This research was funded by Doris Duke Charitable Foundation, Burroughs Wellcome Fund, NIH R21DK080994, Duke Chancellor's pilot project fund, the Roche Foundation for Anemia Research and The Bill and Melinda Gates Foundation. G.L. is supported by Duke's UPGG and the NIH (Grant # 5R01AI090141-03) and K.A.W. by the NSF Graduate Research Fellowship Program.

1: Isolamento di RNA di piccole dimensioni da P. falciparum Durante l&#39;IDC <ol><li> Ottenere i parassiti della malaria nella cultura asessuata 29. NOTA: La dimensione culturale necessaria varierà in base alla applicazione desiderata; tuttavia, una cultura 10 ml al 3-5% parassitemia e 5% ematocrito offre ampio RNA per PCR in tempo reale (RT-PCR). La tecnica è stata inizialmente ottimizzato per le culture asincrone, ma quando si desiderano punti temporali specifici durante il ciclo di infezione, parassiti anello-stage può essere sincronizzato da sincronizzazione sorbitolo entro e non oltre 10-12 ore dopo l&#39;invasione. La sincronizzazione deve essere ripetuta dopo un ciclo (circa 48 ore) 29. </li><li> Cellule infettate Pool insieme (~ 5 x 10 9 RBC al 3-5% parassitemia) e riempire PBS freddo alla parte superiore del tubo e centrifugare a 800 xg per 5 minuti senza freno per far sedimentare le cellule rosse. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante con cura utilizzando una pipetta di aspirazione, in allegatoa vuoto, in quanto il pellet eritrocitaria è facile da rimuovere. Lavare il pellet ancora una volta con 1x PBS freddo. </li><li> Pellet Risospendere cellulare in freddo 0,15% saponina (in 1x PBS) e posto in ghiaccio per 30 min. </li><li> Cellule centrifugare a 1.500 xg per 12 min a 4 ° C, rimuovere il surnatante (che sarà di colore rosso scuro) e risospendere pellet in PBS freddo. Ripetere questo passaggio ancora una volta. NOTA: Al fine di garantire che i microRNA presenti erano riflettente dei microRNA all&#39;interno di parassiti, e non la contaminazione eritrocitaria, una serie di condizioni di isolamento di parassiti sono stati testati: 1) saponina lisi, 2) saponina lisi combinata con trattamento RNaseA dei miRNA cellula ospite e 3 ) metil-beta-ciclodestrina trattamento per rimuovere il parassita dal eritrociti host. Tutti i trattamenti hanno dato risultati simili. </li><li> Lyse il parassita pellet isolato utilizzando la raccomandata 600 ml di tampone di lisi. Questo volume di tampone di lisi è sufficiente per culture fino a ~ 30 ml a 2% e 5% ematocrito parassitemia. NOTA: Per le culture parassita più grandi, questo volume può essere aumentato. È importante garantire la completa lisi del pellet parassita nel vortex approfondita per almeno 1 min. Inoltre, per facilità di estrazione, i campioni lisati possono essere trasferiti in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 60 microlitri, o 1/10 volume del tampone di lisi utilizzato nel passaggio 6, di additivo omogenato (acetato di sodio 2 M, pH 4). </li><li> Lasciare i campioni in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Aggiungere 600 microlitri, o un volume uguale alla quantità di tampone di lisi aggiunto nel passaggio 6, di acido fenolo cloroformio a ciascun campione e vortex per 1 min. </li><li> Separate le fasi acquosa ed organica mediante centrifugazione dei campioni a 10.000 xg per 5 min. Questa rotazione è più lungo di quello proposto dal kit per assicurare che tutte emoglobina / emozoina è nella fase organica. </li><li> Raccogliere il (acquosa) strato superiore e trasferirlo in una nuova provetta. Ripetere i passaggi 9 e 10 se la fase acquosa è bianco o (più probabilmente) di colore marrone, che suggerisce proTEIN contaminazione. </li><li> Determinare il volume del supernatante risultante dalla pipetta e quindi aggiungere 1,25 volumi di etanolo 100% (~ 800 microlitri) e miscelare invertendo la provetta 1,7 ml 5 volte. </li><li> Passare ogni campione attraverso una cartuccia filtro RNA associazione fornito (diversi diversi dei quali sono disponibili in commercio) da una centrifugazione a 14.000 xg per 1 minuto o utilizzando un collettore sotto vuoto. </li><li> Lavare la cartuccia filtrante con 700 ml di miRNA Wash Buffer 1 utilizzando una microcentrifuga, spinning a 14000 g per 1 min. </li><li> Lavare la cartuccia filtrante con 500 microlitri di tampone di lavaggio 2/3 volte per centrifugazione a 14.000 xg per 1 minuto ciascuno. </li><li> Eluire RNA con 100 microlitri DEPC in acqua, che è stato preriscaldato a 95 ° C, in due lavaggi di 50 microlitri, centrifugazione a 14.000 xg per 1 minuto ciascuno. Misurare la concentrazione di RNA tramite assorbimento UV a 260 nm. NOTA: Un gel di RNA (o TBE-urea acrilamide o denaturazione gel di agarosio formaldeide) può be utilizzato per valutare la distribuzione delle dimensioni delle RNA isolati. NOTA: Questo RNA è adatto per l&#39;analisi mediante microarray, RNA-sequenziamento, macchia settentrionale e del test di protezione della ribonucleasi. </li></ol> 2: Quantificazione degli RNA di piccole dimensioni da P. falciparum Durante l&#39;IDC <ol><li> Determinare la concentrazione di singoli campioni isolati al punto 1 mediante spettrofotometria UV a 260 nm. </li><li> Generare primer PCR in tempo reale per le specie di RNA desiderati. Per miRNA da solo, abbiamo usato miRNA premade saggi qPCR, mentre per mRNA o fusione miRNA-mRNA abbiamo progettato primer per SYBR green. Per gli RNA di fusione, il primer forward era sequenza miRNA stesso (miR-451: AAACCGTTACCATTACTGAGTT), mentre il contrario era un gene-specifico Primer ~ 100 bp a valle del miRNA nella sequenza mRNA (PKA-R: ATCGAACATGCTGTGAACAT). </li><li> Effettuare cDNA dai campioni di RNA utilizzando sia un primer tornante per miRNA (utilizzare 20-40 ng di RNA) da solo o esameri casuali per mRNA e / o miRNASpecie -mRNA fusione (con 1 mg di RNA). Mescolare RNA e primers per 5 min a 65 ° C, poi raffreddare a temperatura ambiente. In seguito, aggiungere mix trascrittasi inversa (0,5 microlitri trascrittasi inversa, inibitori 0,5 microlitri RNasi, 1 dNTP microlitri (2,5 mm ciascuno), 4 pl 5x tampone, 2 microlitri 0.1M DTT, 1 ml H 2 O). <ol><li> Campioni eseguito su un termociclatore in grado di rilevare sia SYBR sonde verde o TaqMan. SYBR green quantitativa PCR 30 per geni specifici è stato eseguito come un 3-step PCR, 95 ° C per 15 sec, disponibilità temperatura di ricottura Primer meno 5 ° C per 30 sec e 68 ° C per 30 sec per 40 cicli, utilizzando un SYBR commerciale master mix verde. miRNA PCR in tempo reale è stato eseguito come due fasi PCR, 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min per 40 cicli. </li><li> Quantificare test utilizzando il metodo ΔΔCt e normalizzare contro sia Rab GTPasi (PF08_0110) o 18S rRNA 31. </li></ol></li></ol> 3: Introduzionedi piccoli RNA in Malaria Parassiti <ol><li> Pellet 300 ml di globuli rossi per trasfezione (250 ml di globuli rossi, circa 1.5 x 10 9 cellule, in ultima analisi, da utilizzare) nei media malaria completo per centrifugazione a 800 xg per 5 minuti a freno 1. </li><li> Lavare gli eritrociti due volte con RPMI e risospendere in cytomix completa (120 mM KCl; 0,15 mm CaCl 2; 10 mm K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4, pH 7,6; 25 mM HEPES, pH 7,6; 2 mM EGTA, pH 7,6; 5 mM MgCl 2; pH regolato con KOH) al 50% di ematocrito dopo centrifugazione a 800 xg per 5 min a freno 1. </li><li> Trasferire le cellule di un 0,2 cm elettroporazione cuvetta. </li><li> Aggiungere 10 mg, o adeguate quantità, di oligonucleotidi sintetici personalizzato alle cuvette e sospendere nuovamente le culture. </li><li> Regolare il elettroporatore a 310 V / 950 uF e fornire un impulso per ogni provetta. </li><li> Risospendere le 300 ml di globuli rossi all&#39;interno della cuvetta in pre-riscaldato mal completoAria supporti e piastra in piastre da 24 pozzetti e incubare a 37 ° C in un contenitore ermetico con miscela di gas del sangue malaria (3% O 2, 5% CO 2). </li><li> Dopo 4 ore, di infettare i globuli rossi trasfettate con trofozoiti fine sincronizzati ad una parassitemia finale di circa 1%. </li><li> Aggiungere globuli rossi appena trasfezionati ogni 4-6 giorni a culture infette e determinare la parassitemia% da FACS utilizzando YoYo-1 colorazione, come indicato al punto 4. </li></ol> 4: Determinazione della eritrociti microRNA effetto su Parasite infezione Tasso <ol><li> Prendete 100 ml di cultura risospeso di micropipettatore e posto in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga. Lavare due volte con 1 ml di PBS 1x e centrifugare in una microcentrifuga da tavolo per centrifugazione a 800 xg per 5 min. </li><li> Risospendere pellet in 1 ml di 0,025% glutaraldeide. Incubare i campioni per 20 minuti a RT. NOTA: i campioni possono essere conservati qui per diverse settimane a 4 ° C. In seguito, il pellet infetto RJacket per centrifugazione a 800 xg per 5 min. Lavare due volte con 1 ml di PBS 1x. </li><li> Risospendere pellet in 1 ml di 0,015% saponina. Incubare a 4 ° C per 15 min. Pellet infettato globuli rossi mediante centrifugazione a 800 xg per 5 min. Lavare due volte con 1 ml di PBS 1x. Repeat.4.3. Risospendere le cellule in 1 ml di 1x PBS contenente 1 ml (1,000X) macchia del DNA. </li><li> Determinare i gradi di parassitemia su un citofluorimetro, a 488 nm di eccitazione e ~ 530 nm (FL-1) emissioni. </li><li> In primo luogo, porta il citofluorimetro basata sulla FSC e SSC di concentrarsi su globuli rossi. Quindi misurare i gradi di parassitemia (globuli rossi infetti) nel RBC gated per fluorescenza nel canale FL-1. NOTA: dopo i parassiti stadio sono 10 volte più fluorescente di precedenti parassiti palcoscenico, e ~ 100X sopra globuli rossi infetti. Inoltre, la raccolta a bassa velocità tende a ridurre il rumore. Infine, questo approccio è stato paragonato a 3 H-ipoxantina incorporazione e Giemsa, sia come riportato in precedenza 13, e tutte le tecniche gavdi e risultati simili. </li></ol> 5: biotina-tagging e eluizione di miRNA-mRNA Fusion Prodotti <ol><li> Direttamente ordinare oligonucleotidi sintetici personalizzato RNA con desthiobiotin (DB-) covalentemente legati alla fine del 5 &#39;. </li><li> Trasfettare globuli rossi infetti con Desthiobiotin-coniugata (DB-) miRNA e non modificato miRNA (controllo negativo), come indicato al punto 3. </li><li> Infettare globuli rossi transfettate con P. falciparum parassiti ad una parassitemia iniziale di 0,5% (punto 1.1). </li><li> Estrarre l&#39;RNA parassita 4 giorni (96 ore), più tardi, come descritto in precedenza al punto 1. </li><li> Incubare 10 mg di parassita di RNA con 50 ml confezionati perline streptavidina, ha aggiunto tramite micropipetta, e ruotare su un rotatore provetta per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Pellet le perline a 800 xg per 30 secondi e lavare con 20 mM KCl e 1 / 1.000 RNase Inhibitor. </li><li> Eluire RNA dalle perline di concorrenza con biotina 2 mm e 200 microlitri di buffer RNA cattura di eluizione (20 mM KCl, 1/1, 000 RNase Inhibitor e 2 mm biotina) a 4 ° C durante la notte con rotazione. </li><li> Determinare il grado di arricchimento indicato P. trascrizioni falciparum con SYBR green qRT-PCR, e microRNA arricchimento (controllo positivo) per TaqMan qPCR come indicato al punto 2. </li></ol> 6: Separazione polysome determinare la ribosomiale Occupazione di P. falciparum <ol><li> Posizionare soluzione di saccarosio 5 ml di 15% (400 acetato mM di potassio, HEPES potassio 25 mM, pH 7,2, 15 mM di acetato di magnesio, 200 mM cicloeximide, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml RNase Inhibitor, e il 15% di saccarosio ) in un tubo ultracentrifuga SW41 (14 x 89 mm). </li><li> Usando una siringa da 5 ml, aggiungere la soluzione di saccarosio 5 ml di 50% (400 acetato mM di potassio, HEPES potassio 25 mM, pH 7,2, 15 mM di acetato di magnesio, 200 mM cicloeximide, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml RNasi Inhibitor, e il 50% di saccarosio) sotto il saccarosio del 15% con un lungo ago di acciaio, quindi rimuovere l&#39;ago. </li><li&gt; sigillare la parte superiore del tubo di gradiente con Parafilm, inclinare il tubo lentamente su un lato, in una posizione stabile per evitare di rotolamento, quindi è in posizione orizzontale sul tavolo. Mantenere il tubo su un lato per almeno 2 ore. Durante l&#39;attesa, iniziare dal passaggio 6.5. </li><li> Dopo 2 ore, lentamente inclinare il tubo schiena dritta e trasferire il tubo di ghiaccio, lasciato raffreddare per almeno 15 minuti prima di assaggiare carico (punto 14). </li><li> Raccogliere abbastanza Plasmodium sangue -infected cultura fase di generare 100-500 mg di RNA totale, ovvero circa un 100 ml cultura asincrono al 3-5% parassitemia. Aggiungere 1/10 quel volume di terreno di coltura contenente 10x (2 mM) cicloeximide (CHX) e incubare a 37 ° C per 10 min. <ol><li> Culture pellet per centrifugazione a 500 xg per 7 minuti con la centrifuga (freno 1), poi lavare due volte con temperatura ambiente PBS 1x contenente 200 mM CHX. Risospendere le culture parassita in 1x PBS contenente 200 mM CHX e memorizzare sul ghiaccio. </li></ol></li&gt; <li> Stima il volume del pellet RBC. Aggiungere tampone di lisi (400 potassio acetato mM, HEPES potassio 25 mM, pH 7,2, 15 mM di acetato di magnesio, 200 mM CHX, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml RNase Inhibitor, 1% (v / v) IGEPAL CA -630, e 0,5% (w / v) DOC) al pellet RBC ad un volume finale di 4,25 ml. Incubare il lisato a 4 ° C per 10 minuti durante la rotazione. </li><li> Trasferire il lisato di tubi microcentrifuga, e poi centrifugare i campioni in una microcentrifuga a 16.000 xg e 4 ° C per 10 min. </li><li> Preparare cuscini saccarosio pipettando 1,25 ml di soluzione di cuscino di saccarosio freddo 0,5 M (400 acetato mM di potassio, HEPES potassio 25 mM, pH 7,2, 15 mM di acetato di magnesio, 200 mM cicloeximide, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml RNasi Inhibitor, e 0,5 M saccarosio) in un tubo ultracentrifuga SW55 (13 x 51 mm). </li><li> Strato cautela 3,75 ml di lisato surnatante (dal punto 7) sulla parte superiore del cuscino di saccarosio con una siringa e piccolo (~ 27) gauge. Store il lisato rimanente (~ 500 mL) a -80 ° C per estrarre livelli di RNA totale, come indicato al punto 1. </li><li> Caricare i campioni in un rotore ultracentrifuga, pre-raffreddata a 4 ° C, che può contenere 13,2 ml tubi. Centrifugare i campioni a 366.000 xg e 4 ° C per 146 min. </li><li> Usando una pipetta, trasferire il surnatante in un tubo conico da 15 ml. Conservare il surnatante a -80 ° C per l&#39;RNA isolamento di libero (non legato dai ribosomi) RNA. </li><li> Risospendere il pellet ribosoma in 500 microlitri di tampone di risospensione ribosoma (400 acetato mM di potassio, HEPES potassio 25 mM, pH 7,2, 15 mM di acetato di magnesio, 200 mM cicloeximide, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, e 40 U / ml RNase Inhibitor) pipettando per 5 min. </li><li> Centrifugare i campioni in una microcentrifuga a 16.000 xg e 4 &#160; ° C per 10 min. </li><li> Mantenendo il gradiente dal punto # 4 sul ghiaccio, rimuovere il Parafilm, poi strato accuratamente la sospensione ribosoma in cima alla usi gradienteng una siringa e piccolo (~ 27) gauge. </li><li> Caricare il tubo in un rotore ultracentrifuga pre-raffreddata e centrifugare i gradienti caricati 200.000 xg e 4 ° C per 180 min. Quando il giro è completato, negozio centrifugato gradienti a 4 ° C fino al momento di caricare sul frazionatore. </li><li> Caricare un tubo ultracentrifuga vuoto nel frazionatore pendenza (questo può essere un tubo utilizzato in una precedente esecuzione), poi lavare con acqua RNase-free per 5 min a 100 x 10 velocità. </li><li> Durante il lavaggio nel passaggio 6.16, impostare la sensibilità del rivelatore di assorbanza UV. Una buona sensibilità di partenza è di 0,2, ma questo può essere regolato in seguito corre in base al segnale A 254 (che varia in base al numero parassita, ecc). </li><li> Una volta che la sensibilità del rivelatore è impostata, impostare il segnale di riferimento a zero mentre l&#39;acqua scorre attraverso il rivelatore. </li><li> Dopo aver lavato il raccoglitore di frazioni, invertire il flusso di fluido fino a quando le linee sono vuote e quindi remil sobrio il tubo ultracentrifuga vuoto. </li><li> Eseguire soluzione di saccarosio al 60% attraverso la colonna di frazionamento fino a quando non esce l&#39;apparato ago. </li><li> Inserire il tubo contenente il primo gradiente nella parte superiore della camera di caricamento e stringere la guarnizione, facendo attenzione a non serrare eccessivamente. Poi, perforare il fondo del tubo con l&#39;ago. </li><li> Azzerare la velocità di flusso del fluido di 12,5 x 10 (controllato dal controllo della velocità del flusso sulla parte anteriore della pompa), quindi impostare il raccoglitore di frazioni automatizzato per raccogliere 18 sec frazioni (~ 330 microlitri / frazione) in provette da microcentrifuga. </li><li> Inizia in avanti il ​​flusso della soluzione di saccarosio al 60%. </li><li> Quando la prima goccia della soluzione di gradiente cade nella provetta, iniziare immediatamente sia la raccolta di frazioni e la registrazione dal vivo del segnale A 254. </li><li> Una volta che un forte calo si osserva nel segnale A 254, corrispondente alla interfaccia tra le soluzioni di saccarosio 50% e 60%, sia interrompere il flusso del fluido e A 254 </sub&gt; registrazione. </li><li> Conservare le frazioni gradiente a -80 &#160; ° C per un uso successivo. </li><li> Invertire il flusso del fluido a 100 x 10 velocità finché la soluzione di saccarosio al 60% svuota dal tubo ultracentrifuga. </li><li> Se ci sono pendenze aggiuntive per frazionare, rimuovere il tubo ultracentrifuga vuoto dalla camera di caricamento e ricominciare dal punto 6.21. Se sono stati completati tutti i campioni, lavare l&#39;apparecchiatura come è stata eseguita in fasi 6.16 e 6.19. </li></ol>

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The authors have no competing financial interests to declare.

HBS è una delle varianti di emoglobina più comuni in aree endemiche malaria, principalmente perché fornisce protezione contro la malaria causata da P. grave falciparum. Le tecniche necessarie per caratterizzare il ruolo di microRNA umano nella regolazione genica di P. falciparum sono dettagliate nel corso di questo manoscritto. Estraendo RNA totale in modo tale da includere tutti i piccoli RNA, ed eseguendo una procedura parassita lisi relativamente semplice, questi RNA fusione potevano ess...

La malaria, causata da parassiti Apicomplexa del genere Plasmodium, è la malattia parassitaria umana più comune, infettando il mondo circa 200 milioni di persone ogni anno e provocando circa 600.000 morti 1. Delle cinque specie di Plasmodium che infettano gli esseri umani, il più rilevante per le malattie umane sono P. falciparum e P. vivax, a causa delle loro distribuzioni diffuse e il potenziale di gravi complicazioni di malaria. Il ciclo di vita del parassita della malaria richiede infezione di zanzare e gli esseri umani sia. Quando una zanzara infetta morde un essere umano, i parassiti viaggiano attraverso il flusso sanguigno al fegato, dove si verifica un primo giro di replica. Dopo la rottura merozoiti dal epatociti ospite, infettano vicine globuli rossi, l&#39;avvio di replica sia asessuata o sessuale. La fase asessuata di replica, che dura 48 ore in P. falciparum, è al centro di questo studio in quanto è sia la fonte della maggior Malsintomi Aria e è facilmente ricapitolate in vitro. Mentre un certo numero di iniziative di salute pubblica, tra cui il miglioramento terapie anti-malarici, hanno in qualche modo ridotto l&#39;impatto della malaria a livello globale, l&#39;emergere continuo di parassiti resistenti ai farmaci rappresenta un problema per gli sforzi di controllo della malaria. Un settore che può suggerire nuovi approcci terapeutici è lo studio su come le varie varianti genetiche conferiscono resistenza alla malaria. Nelle regioni la malaria è endemica, una varietà di polimorfismi eritrocitari sono abbastanza comuni 2,3. Queste mutazioni, con falciforme è forse il più importante, sono spesso associati con notevole resistenza alla insorgenza di infezione malarica sintomatica 4. I meccanismi alla base con cui essi provocano eritrociti di resistere alle infezioni di malaria non sono completamente compresi. Eritrociti parassitato con mutazioni di emoglobina sono soggetti a una maggiore fagocitosi attraverso la rigidità cellulare aumentata e la disidratazione, cheè associato con una diminuzione invasione da parte di P. Plasmodium 5. L&#39;allele HbC colpisce anche l&#39;espressione della proteina sulla superficie degli eritrociti e con il rimodellamento del citoscheletro, inibendo l&#39;ulteriore sviluppo del parassita 6,7. Infine, P. falciparum cresce poco all&#39;interno falce omozigote (HbSS) eritrociti 8,9 in vitro, suggerendo intrinseci fattori eritrocitari di resistenza della malaria. Tuttavia, mentre tutti questi meccanismi sembrano svolgere un ruolo, non spiegano appieno i meccanismi alla base della resistenza falciforme alla malaria. Un potenziale serie di fattori eritrocitari che rimangono poco conosciuta è la grande piscina di miRNA presenti all&#39;interno eritrociti maturi. I microRNA sono piccoli RNA non codificanti, 19-25 nt in termini di dimensioni, che mediano la traduzione e / o la stabilità di mRNA bersaglio per appaiamento delle basi nel 3 &#39;UTR. Essi sono stati implicati nel controllo delle risposte immunitarie di mammiferi, compreso la soppressione oreplicazione del virus F 10, e hanno mostrato di conferire resistenza ai virus delle piante Essi hanno anche dimostrato di regolare i diversi processi eritrocitari, tra cui l&#39;eritropoiesi 11,12 e metabolismo del ferro 13. Precedenti studi identificato una popolazione abbondante e diversificata di miRNA eritrocitari, la cui espressione è stata drammaticamente alterata in HbSS eritrociti 14,15. Poiché eritrociti maturi manca la trascrizione attiva e la traduzione, il ruolo funzionale di questi miRNA eritrocitari rimane poco chiaro. Come si verifica un notevole scambio di materiale tra la cellula ospite e P. falciparum durante il ciclo di sviluppo intraerythrocytic (IDC) 16, è stato ipotizzato che il profilo di miRNA alterato secondo eritrociti HbS può contribuire direttamente alla resistenza della malaria cellule intrinseco. Questi studi infine portato allo sviluppo di una pipeline per isolare, identificare e funzionalmente studiare il ruolo di miRNA umano all&#39;interno malaria parassita, P. falciparum, che ha indicato che questi ospitano / miRNA umani in ultima analisi, in modo covalente fusibile e quindi translationally reprimono trascritti parassita mRNA 17. Questo ha fornito un esempio dei primi cross-specie trascritti chimerici formati da trans-splicing e implica che questa fusione miRNA-mRNA potrebbe essersi verificato in altre specie, tra cui altri parassiti. Tutti mRNA trypanosome sono trans-impiombato con una giunta-capo (SL) per regolare la separazione delle trascrizioni policistronici 18. Poiché P. falciparum manca ortologhi per Dicer / Ago 19,20, è possibile che i miRNA eritrocitari dirottare simile macchinario SL in P. falciparum per integrare nelle geni bersaglio. Recenti studi in P. falciparum hanno infatti indicato la presenza di sequenze 5 &#39;splice capo 21. Dettagli Questo studio i metodi che hanno portato alla scoperta di trascritti di fusione umani-parassita miRNA-mRNA, tra cui sia trascrittomica e TRADUCEzionali tecniche di regolazione. Gli obiettivi generali di questi metodi sono per studiare gli effetti di piccoli RNA nella regolazione genica, fenotipi e la traduzione potenziale di P. trascrizioni falciparum. L&#39;identificazione iniziale di trascritti chimerici umano-parassita invocata l&#39;utilizzo di tecniche di analisi di RNA, come la real-time PCR, il sequenziamento del trascrittoma e la cattura biblioteca EST, che includeva sia totali e piccoli RNA, piuttosto che con tecniche che isolati solo piccoli RNA. Isolando tutto RNA insieme in una grande piscina, piuttosto che separatamente, permesso di individuare i piccoli RNA umani traslocati nel parassita, nonché la presenza di queste piccole sequenze di RNA come parte di una sequenza più ampia. Questo poi ricorso ad analisi dello stato di questi mRNA traduzione fusione per determinare le conseguenze funzionali di tali fusioni. Mentre ampi sforzi sulla caratterizzazione del genoma del parassita und trascrittoma hanno aggiunto alla comprensione della biologia del parassita 22-25, molto meno si sa circa la regolamentazione di traslazione del trascrittoma mRNA attraverso il ciclo di vita di P. falciparum 26. Questa comprensione limitata del proteoma del parassita ha ostacolato sia la comprensione della biologia del parassita e la capacità di identificare nuovi obiettivi per la prossima generazione di terapie contro la malaria. Questo divario nella comprensione della biologia cellulare del parassita ha persistito in gran parte a causa della mancanza di tecniche adeguate per svolgere indagini regolazione traduzionale in P. falciparum. Un recente documento descritto l&#39;uso di footprinting ribosomiale di P. falciparum per determinare lo stato di traduzione globale 21. Una misura ben consolidata del potenziale traslazionale delle trascrizioni è il numero di ribosomi associati determinati da polysome profiling. Tuttavia, quando questa tecnica è applicata a P. falciparum &lt;/ em&gt;, è in grado di recuperare la maggior parte dei polisomi e cattura prevalentemente monosomes. Recentemente, diversi gruppi hanno ottimizzato 27,28 P. Tecniche polysome falciparum di lisi degli eritrociti e parassiti simultaneamente per preservare i polisomi e caratterizzare l&#39;occupazione ribosomiale e il potenziale traslazionale di questi parassiti della malaria durante il loro sviluppo asessuale in ospitanti globuli rossi 28. Collettivamente, questi metodi dimostrano che la fusione osservato di miRNA e parassiti mRNA umani modula traduzione proteine ​​parassita di quelle mRNA di fusione, che è stato dimostrato utilizzando metodi precedentemente riportati 27, ed è un fattore determinante della resistenza della malaria in HBA e HbSS eritrociti 17. Questi metodi potrebbero essere utili in qualsiasi sistema cerca di individuare e funzionalmente esplorare eventi RNA splicing, se tali RNA di fusione sono in P. falciparum o altri sistemi eucariotici.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>DEPC</td></tr><tr><td>DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yoyo-1 DNA fluorescent dye</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 cm Electroporation cuvettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 M potassium acetate</td><td>Mallinckrodt</td><td>6700</td><td></td></tr><tr><td>2 M potassium HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0527</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>1 M magnesium acetate</td><td>Sigma</td><td>M-2545</td><td></td></tr><tr><td>1 M dithiothreitol</td><td>Research Products International</td><td>D11000</td><td>DTT</td></tr><tr><td>100 mM phenylmethylsulfonate fluoride</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>PMSF, dissolved in isopropanol</td></tr><tr><td>10% (v/v) Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>10% (w/v) sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D-6750</td><td>DOC</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C-7698</td><td>CHX</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Mallinckrodt</td><td>8360-04</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)</td><td>Invitrogen</td><td>100000840</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 w/ L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10% AlbuMAX I</td><td>Invitrogen</td><td>11020-039</td><td>w/v in sterile water</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&#039; Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin powder (Sigma-Aldrich)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Potassium Chloride</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENT SETUP&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmodium cell culture media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml gentamicin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml HT supplement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml 45% glucose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 ml 10% AlbuMAX I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12.5 ml 1 M HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmodium cell culture media containing 10x CHX&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mM cycloheximide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1x PBS containing cycloheximide&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 &lt;sup&gt;O&lt;/sup&gt;C until use.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ribosome resuspension buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>400 mM potassium acetate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mM potassium HEPES, pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mM magnesium acetate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mM cycloheximide (add fresh)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT (add fresh)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM PMSF (add fresh)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 U/ml RNaseOUT (add fresh)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lysis buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% (v/v) Igepal CA-630</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% (w/v) DOC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sucrose solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA Capture Wash Buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mM&amp;nbsp; KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 unit/ml Rnase Out (Invitrogen)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA Capture Elution Buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mM Biotin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; &amp;frac12; x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyallomer 9/16 x 3 &amp;frac12; in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L8-80M ultracentrifuge (Beckman)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16 G (Aldrich, cat. no. Z261378)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe with 27 G&amp;frac12; needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator, end-over-end</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge, refrigerated</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TracerDAQ (Measurement Computing)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods to investigate the regulatory role of small rnas and ribosomal occupancy of plasmodium falciparum

La variazione genetica responsabile per l&#39;allele falciforme (HbS) consente eritrociti di resistere alle infezioni da parte del parassita della malaria, P. falciparum. La base molecolare di tale resistenza, che è noto per essere multifattoriale, rimane completamente compresa. Recenti studi hanno trovato che l&#39;espressione differenziale dei microRNA eritrocitari, una volta traslocati in parassiti della malaria, influenza sia regolazione genica e la crescita del parassita. Questi miRNA sono stati successivamente dimostrato di inibire la traduzione dell&#39;mRNA formando un RNA trascritto chimerico con 5 &#39;RNA fusione con sottoinsiemi discreti mRNA parassita. Qui, le tecniche che sono state utilizzate per studiare il ruolo funzionale e putative meccanismo sottostante microRNA eritrocitari sulla regolazione genica e il potenziale di traslazione del P. falciparum, compresa la trasfezione dei microRNA sintetici modificati negli eritrociti di accoglienza, sarà dettagliato. Infine, un metodo polysome gradiente è utilizzato per determinare il grado di Translation di queste trascrizioni. Insieme, queste tecniche hanno permesso di dimostrare che i livelli di microRNA sregolati eritrocitari contribuiscono alla cella-intrinseca resistenza della malaria di eritrociti falciformi.

Profilazione globale di microRNA umana in P. falciparum Le tecniche qui presentate sono stati usati per estrarre microRNAs parassitari in una varietà di condizioni. Una cosa da notare è che le estrazioni di RNA per i globuli rossi infetti sono stati effettuati, come indicato nel 32, che spesso serviva come punto di riferimento per i dati microRNA presentati sia in questo articolo e lo studio originale 29. Tali studi precedenti hanno anche dimostrato ...

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Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Metodi per studiare il ruolo di regolamentazione dei piccoli RNA ribosomiale e di occupazione<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

methods-to-investigate-regulatory-role-small-rnas-ribosomal-occupancy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

8.8K Views.  Duke University School of Medicine. Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts. 

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Ricerca

Genetica

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Biochimica

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

Lo studio di RNA interattori della chinasi proteica RNA-attivato durante il ciclo cellulare dei mammiferi

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized notably due to the difficulty of identifying their mRNA targets. Here, we described a modified protocol of the MS2-Affinity Purification coupled with RNA Sequencing (MAPS) technology, aiming to reveal all RNA partners of a specific sRNA in vivo. Broadly, the MS2 aptamer is fused to the 5&#8217; extremity of the sRNA of interest. This construct is then expressed in vivo, allowing the MS2-sRNA to interact with its cellular partners. After bacterial harvesting, cells are mechanically lysed. The crude extract is loaded into an amylose-based chromatography column previously coated with the MS2 protein fused to the maltose binding protein. This enables the specific capture of MS2-sRNA and interacting RNAs. After elution, co-purified RNAs are identified by high-throughput RNA sequencing and subsequent bioinformatic analysis. The following protocol has been implemented in the Gram-positive human pathogen Staphylococcus aureus and is, in principle, transposable to any Gram-positive bacteria. To sum up, MAPS technology constitutes an efficient method to deeply explore the regulatory network of a particular sRNA, offering a snapshot of its whole targetome. However, it is important to keep in mind that putative targets identified by MAPS still need to be validated by complementary experimental approaches.

MAPS technology has been developed to scrutinize the targetome of a specific regulatory RNA in vivo. The sRNA of interest is tagged with a MS2 aptamer enabling the co-purification of its RNA partners and their identification by RNA sequencing. This modified protocol is particularly suited for Gram-positive bacteria.&#160;

Purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con sequenziamento dell'RNA nei batteri gram-positivi

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Regolamento MicroRNA basata su Picornavirus Tropismo

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Immunologia e infezioni

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analisi di Single-cell trascrizione del gene per l&#39;RNA fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Biologia

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, could repress the expression of outer membrane proteins. To further investigate the regulation function of micC in Salmonella Enteritidis, we cloned the micC gene in the Salmonella Enteritidis strain 50336, and then constructed the mutant 50336&#916;micC by the &#955; Red-based recombination system and the complemented mutant 50336&#916;micC/pmicC carrying recombinant plasmid pBR322 expressing micC. qRT-PCR results demonstrated that transcription of ompD in 50336&#916;micC was 1.3-fold higher than that in the wild type strain, while the transcription of ompA and ompC in 50336&#916;micC were 2.2-fold and 3-fold higher than those in the wild type strain. These indicated that micC represses the expression of ompA and ompC. In the following study, the pathogenicity of 50336&#916;micC was detected by both infecting 6-week-old Balb/c mice and 1-day-old chickens. The result showed that the LD50 of the wild type strain 50336, the mutants 50336&#916;micC and 50336&#916;micC/pmicC for 6-week-old Balb/c mice were 12.59 CFU, 5.01 CFU, and 19.95 CFU, respectively. The LD50 of the strains for 1-day-old chickens were 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, and 2.54 x 108 CFU, respectively. It indicated that deletion of micC enhanced virulence of S. Enteritidis in mice and chickens by regulating expression of outer membrane proteins.

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An &#955;-Red-mediated recombination system was used to create a deletion mutant of a small non-coding RNA micC.

Un piccolo RNA non codificante MicC contribuisce alla virulenza nelle proteine della membrana esterna in Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Metodi per studiare il ruolo di regolamentazione dei piccoli RNA ribosomiale e di occupazione

Riepilogo

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Novel RNA-Proteine leganti isolamento dalla rapida Metodologia

Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania

Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

Lo studio di RNA interattori della chinasi proteica RNA-attivato durante il ciclo cellulare dei mammiferi

Purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con sequenziamento dell'RNA nei batteri gram-positivi

Regolamento MicroRNA basata su Picornavirus Tropismo

Analisi di Single-cell trascrizione del gene per l'RNA fluorescente

Un piccolo RNA non codificante MicC contribuisce alla virulenza nelle proteine della membrana esterna in Salmonella enteritidis

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

Metodi per studiare il ruolo di regolamentazione dei piccoli RNA ribosomiale e di occupazione

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Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

Lo studio di RNA interattori della chinasi proteica RNA-attivato durante il ciclo cellulare dei mammiferi

Purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con sequenziamento dell'RNA nei batteri gram-positivi

Regolamento MicroRNA basata su Picornavirus Tropismo

Analisi di Single-cell trascrizione del gene per l'RNA fluorescente

Un piccolo RNA non codificante MicC contribuisce alla virulenza nelle proteine della membrana esterna in Salmonella enteritidis

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

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