Grazie a Michaela Hall, Larissa Bispo e Gustavo Tavares per l&#39;assistenza tecnica.

I prodotti alimentari che vengono consumati crudi o poco cotti sono più preoccupazione per la salute umana. Gli esempi includono insalata di verdure, frutta, frutti di mare e crostacei. 1. Raccolta dei campioni <ol><li> Raccogliere i campioni in condizioni che riducono al minimo la contaminazione, e conservati in sacchetti puliti, separati durante il trasporto. Una volta raccolti, i campioni devono essere conservati a 4 ° C e trattati entro 24 ore. </li></ol> 2. Enriched Cultura Preparazione <ol><li> Frutta e verdura: <ol><li> Posizionare circa 10 g di materiale in un sacchetto di plastica resistente. Se l&#39;elaborazione di materiale più grande, concentrarsi sulla pelle della frutta o verdura. Aggiungere 90 ml di 0,1 M tampone fosfato di sodio, pH 7,0 e di processo in un miscelatore a pale per 30 sec. In alternativa, il materiale può essere agitato manualmente se un miscelatore a pale non è disponibile. </li><li> Raccogliere il liquido in due provette da 50 ml Falcon. Provette per centrifuga a 4.000 xg per 7 minuti a batteri pellet. </li&gt; <li> Rimuovere con attenzione il surnatante e sospendere i batteri pellet in 30 ml di sterile Luria Bertani (LB) brodo. </li><li> Incubare su un agitatore O / N, tenendo un tubo a 25 ° C e l&#39;altro a 37 ° C. Le colture devono essere agitati a 200 oscillazioni al minuto (OPM). Conservare le culture a 4 ° C fino a quando necessario. </li></ol></li><li> Frutti di mare: <ol><li> Sezionare lo stomaco (ostriche) o del tratto digestivo (gamberi) con pinza sterile e pinzette e posto in una provetta sterile da 1,5 ml contiene 200 ml di tampone fosfato 0,1 M di sodio, pH 7,0. Macerare il campione per creare un omogenato. </li><li> Dispensare 5 ml di brodo LB in due sterili provette da 5 ml, e inoculare ciascuna con l&#39;omogeneizzato frutti di mare. </li><li> Incubare su un agitatore O / N, tenendo un tubo a 25 ° C e l&#39;altro 37 ° C. Le colture devono essere agitati a 200 opm. Conservare le culture a 4 ° C fino a quando necessario. </li></ol></li></ol> 3. Culture screening per integroni 2 di 2,5 mm. Se necessario, Lorenz (2011) 24 ha delineato l&#39;ottimizzazione e la risoluzione dei problemi di PCR metodi in un numero precedente di questa rivista. <ol><li> La preparazione del DNA Bollito: <ol><li> Dispensare 100 l di cultura arricchito in una sterile 0,5 ml provetta PCR. Riscaldare il campione a 99 ° C per 10 minuti, utilizzando un bagnomaria o calore. Snap freddo in ghiaccio per 2 minuti. </li><li> Microcentrifuga a 14000 g per 5 minuti per far sedimentare i detriti cellulari. Ritorno a ghiaccio. I campioni di DNA possono essere congelati a -20 ° C fino al momento, ma devono essere scongelati in ghiaccio. </li></ol></li><li> Screening per la classe 1 integroni utilizzando PCR: NOTA: culture miste dal / N incubazione O sono proiettati per la classe 1 integroni che utilizzano il protocollo HS463a / HS464 PCR (Tabella 1). <ol><li> Scongelare tutti i reagenti PCR su ghiaccio, lontano da qualsiasi potenziale souRCE di contaminazione del DNA. Make up 48 microlitri PCR mastermix per campione, inclusi i controlli negativi (Tabella 2). Dispensare 48 ml di PCR master mix in ogni provetta, con punte di barriera. </li><li> Aggiungere 2 ml di DNA scongelata per provette PCR singole con puntali. Eseguire apposito programma nel termociclatore PCR. </li><li> Per valutare i risultati della amplificazione, elettroforesi 7 ml di prodotto di PCR su un gel di agarosio al 2% versato ed eseguire in tampone TBE (90 mM TRIS-borato, 2 mM EDTA). Include un marcatore di peso molecolare, come ad esempio una scala di 100 bp. </li><li> Posta macchia il gel con una macchia DNA, e visualizzare utilizzando un transilluminatore UV. Verificare che non vi è stata alcuna amplificazione nel controllo negativo. Una forte banda a circa 470 bp per qualsiasi campione particolare indica che la cultura mista contiene batteri che portano una classe 1 integrone. Colonie Pure verranno isolate da qualsiasi cultura mista che ha restituito una PCR positiva. </li></ol></li></ol><ol><li> Diluizioni seriali e piastre spread: NOTA: Per isolare singole colonie da colture miste PCR-positivi, la coltura mista è serialmente diluiti 10 volte in tampone fosfato di sodio, e poi placcato recuperare singole colonie. <ol><li> Aggiungere 1 ml di coltura mista a 9 ml di tampone fosfato 0,1 M di sodio, pH 7,0 e mescolare per inversione. Aggiungere 1 ml della diluizione ad un ulteriore 9 ml di tampone fosfato, e ripetere fino una diluizione seriale di 10 -8 è raggiunto. </li><li> Stendere 100 ml di i 10 -4 a 10 -8 diluizioni su agar LB, in duplice copia. Incubare le piastre O / N alla stessa temperatura utilizzata per la coltura mista iniziale. Le piastre possono quindi essere conservati a 4 ° C fino al momento, ma è meglio elaborare le singole colonie abbastanza rapidamente. </li></ol></li><li> Selezione colonia unico e la preparazione del DNA bollito: <ol><li> Scegli singole colonie dalle piastre di diluizione seriali, SEnando come molti tipi differenti di colonie possibile, utilizzando criteri come le dimensioni delle colonie, forma e colore. Usa stuzzicadenti sterile per selezionare singole colonie dalla piastra diffusione. </li><li> Toccare lo stuzzicadenti alla colonia, e poi trasferire in un tubo di PCR contenente 100 ml di acqua sterile. Se un gran numero di colonie devono essere sottoposti a screening, quindi le colonie possono essere preparati in un vassoio di microtitolazione. Spin stuzzicadenti tra le dita per rimuovere alcune delle cellule in acqua. </li><li> Utilizzando lo stesso stecchino, inoculare una piastra LB con una striscia della colonia. Un gran numero di colonie possono essere memorizzati su piastre etichettati se ogni striscia è lungo circa 1 cm. Ripetere i passaggi da 1 a 3 fino a selezionare un numero adeguato di isolati. </li><li> Incubare la piastre LB O / N, alla stessa temperatura di quello usato per la coltura arricchita iniziale. Le culture possono quindi essere conservati a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Per la preparazione del DNA dalle sospensioni batteriche, seguire la procedura come outlined nella sezione 3.1. Per lo screening dei lisati coltura pura, eseguire la HS463a / HS464 PCR come indicato nella sezione 3.2. Gli isolati che restituiscono un PCR positivo sarà utilizzato per la preparazione di DNA genomico (sezione 5), e per ulteriori analisi. </li></ol></li></ol> 5. Le colonie singole genomico Estrazione del DNA di Integron positivi Uso Bead Beating 25 <ol><li> Inoculare 5 ml di brodo LB con un campione della coltura pura isolato nella sezione 4.2. Incubare O / N, agitando alla stessa temperatura che è stato utilizzato per la coltura arricchita iniziale. </li><li> Cellule pellet a 4.000 xg per 7 minuti, quindi rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule pellet in 1 ml di soluzione CLS-TC in un tubo di preparazione veloce di Lisi Matrix E. Utilizzando una macchina tallone pestaggio, elaborare il campione a 5,5 m / sec per 30 sec. </li><li> Provetta da centrifuga a 14000 xg per 5 min e recuperare 700 pl di surnatante in una provetta sterile da 1.5 ml. </li><li> Aggiungere 700 ml di matrice legante diluito 1: 5 con 6 M guanidinium tiocianato e mescolare a temperatura ambiente per 5 minuti. Centrifugare a 14000 g per 1 minuto, il surnatante scarto. </li><li> Aggiungere 800 microlitri etanolo di lavaggio sale (70% di etanolo, 0,1 M di acetato di sodio) e vortex fino a quando il pellet è completamente risospeso. Lavare per 5 minuti a RT, centrifugare a 14.000 xg per 1 minuto e scartare il surnatante. Assicurarsi tutte surnatante è stato rimosso, usando una micropipetta se necessario, quindi lasciare asciugare all&#39;aria per 5 min. </li><li> Risospendere la matrice pellet in 200 microlitri TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6) pipettando su e giù. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Centrifugare a 14.000 xg per 3 min e trasferimento 160 microlitri della DNA eluito in una provetta sterile. Eseguire una aliquota della estrazione del DNA genomico su 2% w / v gel di agarosio per verificare la resa e l&#39;integrità della estrazione del DNA. Il DNA genomico purificato è conservato a -20 ° C e scongelato in ghiaccio quando richiesto per il test PCR. </li></ol> 6. PCR diagnostici e sequenziamento del DNA NOTA: IlDNA genomico preparata al punto 5 sarà utilizzato per tutte le PCR diagnostici, e per confermare il test positivo per la classe 1 integroni. <ol><li> Scongelare il DNA genomico sul ghiaccio, vortice brevemente il campione di DNA e di spin impulso a 14000 g per 20 sec. Ripetere la PCR per la classe 1 integrone-integrasi gene utilizzando HS463a / HS464 (Tabella 1), a conferma che l&#39;isolato è positivo per l&#39;amplicone 471 bp (Sezione 3.2). </li><li> Identificazione delle colture positive a livello di specie è ottenuta mediante analisi della piccola subunità gene rRNA (16S rDNA). Amplificare il gene 16S con primer f27 / r1492 (Tabella 1). Controllare i prodotti PCR mediante elettroforesi. Tutti gli obiettivi batterici dovrebbero generare un 16S amplicone di circa 1450 bp. </li><li> Sequenza gene amplicone 16S rRNA per determinare l&#39;identità delle specie, ma dal momento che ci sono probabilmente più PCR positivi dal punto 6.2, e molti di questi aspetti positivi saranno le stesse specie di batteri, abbiamo in primo luogo distinguere diverse specie using restrizione digestione del prodotto di PCR 16S. <ol><li> Digest un&#39;aliquota del 16S PCR con l&#39;enzima di restrizione Hinf 1. Ogni enzima che riconosce siti di rottura 4 bp farà, ma Hinf 1 genera buona diversità dagli obiettivi 16S, ed è un affidabile, enzima poco costoso. </li></ol></li><li> Impostare una limitazione di 30 microlitri digerire mastermix (Tabella 2) in una provetta sterile e aggiungere 20 ml di un-purfied prodotto 16S PCR. Incubare a 37 ° C bagnomaria O / N. Controllare il digest su un gel di agarosio al 2%. </li><li> Nota i modelli prodotti dalla digestione Hinf 1. Isolati con la stessa 16S profilo di restrizione saranno probabilmente della stessa specie. Piuttosto che sequenziare ogni prodotto 16S PCR, sequenza al massimo tre rappresentanti di ogni Hinf 1 restrizione modello. </li><li> Purificare i prodotti 16S PCR utilizzando un kit commerciale. Un unico kit exonuclease filamento può essere utilizzato, ma sulla base di colonna o metodi di precipitazione anche lavorare bene per rimuovere unincprimer orporated e DNA cavo rigido. Sequenza 16S amplificati usando Primer R910 (Tabella 1), che istituiscono le reazioni, come specificato dalla struttura sequenziamento. </li><li> Utilizzare la sequenza di DNA derivati ​​di interrogare la banca dati del DNA NCBI con la funzione BLASTN ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). Superiore al 97% nucleotide identità è solitamente considerato come l&#39;identità di specie. </li></ol> 7. mappatura e caratterizzazione di integroni e cassette Array NOTA: Classe 1 integroni provenienti da ecosistemi umani dominati sono probabilmente i integroni più comuni in tutti i campioni. Questi integroni tutti hanno un recente un&#39;unica origine, e quindi hanno una sequenza di DNA altamente conservata 5. <ol><li> Distinguere tra una classe 1 integroni provenienti da fonti umane e quelle che si trovano in natura in campioni ambientali eseguendo unaPCR con primer set intI1F165 / intI1R476 10 (Tabella 1). NOTA: Classe 1 integroni da batteri clinici o commensali genererà un prodotto ~ 300 pb, mentre la classe ambientale 1 integroni non genereranno alcun prodotto. </li><li> Caratterizzare le integroni clinici amplificando matrice cassetta con primer HS458 / HS459. Questo PCR amplifica la regione tra intI1 e segmento conservato il 3 &#39;al capolinea della maggior parte degli array di cassette. Poiché il numero e l&#39;identità di cassette è variabile, le dimensioni del prodotto di PCR anche variare. </li><li> Purificare ampliconi e sequenziare il DNA utilizzando ciascuno dei primer di amplificazione. Utilizzare sequenze di interrogare banche dati del DNA utilizzando la funzione BLASTN ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li><li> Garantire la denominazione di cassette seguire nomenclatura standardizzata 9, dal momento che molte deposizioni di dati per cassette gene integrones usano nomi incoerenti o ambigui. Dare particolare attenzione alle cassette geniche nuovi, dal momento che questi possono codificare nuovi fenotipi, compresi i geni che conferiscono aumentata trasmissibilità, patogenicità o la virulenza 8,21. NOTA: preclinici forme della classe 1 integrone circolano ancora in ambienti naturali. In particolare, coloro che sono legati alla attive Tn 402 trasposoni sono di maggior interesse 26. Gli array di cassette di questi integroni non amplificare con primer HS458 / HS459, ma possono essere amplificati con la MRG284 / MRG285 Primer set (Tabella 1), generando ampliconi di grandezza variabile dipendente sui contenuti cassetta. I prodotti di PCR devono essere purificati e DNA sequenziati come indicato al punto 7.2. </li></ol>

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Gli autori non hanno niente di rilevante da rivelare.

L&#39;identificazione di integroni e le loro cassette geniche associate è potenzialmente un passo fondamentale nel predire l&#39;emergere di nuovi patogeni opportunisti, tracking percorsi per gli agenti patogeni nella catena alimentare umana, e identificando nuova resistenza e la virulenza determinanti 8,21,26. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di descrivere un approccio semplificato per lo screening dei campioni per la classe 1 integroni, che caratterizzano le loro matrici cassette e identificare le...

La scoperta degli antibiotici è stata una delle più grandi conquiste scientifiche del 20 ° secolo. Tuttavia, l&#39;uso e l&#39;abuso di antibiotici ha portato alla rapida evoluzione dei batteri resistenti agli antibiotici, e questi ora rappresentare una seria minaccia per la salute pubblica nel 21 ° secolo. L&#39;aumento di ceppi batterici resistenti alla maggior parte delle opzioni di trattamento solleva la possibilità che stiamo entrando in un&#39;era in cui i farmaci antimicrobici non sono più efficaci 1,2. Il macchinario genetico che conferisce resistenza agli antibiotici è un antico sistema, anticipando gli esseri umani e le pressioni di selezione antibiotici da milioni di anni 3. Elementi genetici mobili, come i plasmidi, trasposoni, isole genomiche, elementi di coniugazione integrativi e integroni possono diffondere geni resistenti agli antibiotici (ARG), sia all&#39;interno e tra specie batteriche 4. Di questi, integroni hanno svolto un ruolo centrale nella diffusione di ARG, nonostante lafatto che si basano su plasmidi e trasposoni per la mobilitazione e l&#39;inserimento in genomi batterici 5. Integroni catturano cassette geniche che utilizzano un integrone-integrasi, e quindi esprimono cassette utilizzando un integrone codificato promotore 6,7 (Figura 1). Integron gene cassette sono piccoli elementi mobili costituiti da singole fasi di lettura aperti (ORF) i cui prodotti possono conferire resistenza agli antibiotici e disinfettanti 8. Classe 1 integroni sono i integroni più comunemente recuperati da isolati clinici 5, dove hanno complessivamente acquisito oltre 130 diverse cassette antibiotico gene di resistenza 9. La diffusione di classe 1 integroni in commensali e batteri patogeni umani associata genera flussi di rifiuti umani che contengono un gran numero di questi elementi genetici 10. Si stima che 10 19 batteri che contengono classe 1 integroni vengono rilasciati tramite fanghi di depurazione ogni anno in il Regno Unito 11. Non è quindi sorprendente che classe 1 integroni che conferiscono resistenza agli antibiotici sono ora rilevati nel microbiota degli uccelli selvatici, pesci e altri fauna selvatica 12-14. Rilasciando integroni indietro nell&#39;ambiente costituisce una significativa minaccia per la salute pubblica, dal momento che l&#39;acquisizione di nuove cassette geniche e riarrangiamenti complessi con altri elementi mobili continua a verificarsi, soprattutto negli impianti di trattamento delle acque reflue e di altri corpi idrici 15-18. L&#39;ambiente naturale diventa un terreno di reclutamento fertile per i nuovi determinanti di resistenza e patogeni opportunisti 19,20. Batteri integrone contenente Nuovi e nuovi ARG possono fare il giro nella comunità umana attraverso acqua e cibo contaminati 21,22. Sorveglianza di ARG ambientali è una strategia chiave per la comprensione e la gestione di resistenza agli antibiotici in futuro 23. In particolare, occorre prestare attenzione agli alimenti che vengono consumati crudi opoco cotti, dal momento che questi rappresentano la più grande minaccia per la trasmissione di nuovi elementi mobili e gli agenti patogeni. In questo protocollo, un approccio semplificato per il rilevamento, l&#39;identificazione e la caratterizzazione di classe 1 integroni e le loro cassette geniche associate nei prodotti alimentari sono delineati (Figura 2). Utilizzando una combinazione di reazione coltura e della polimerasi a catena (PCR), integroni possono essere rapidamente individuati nelle comunità batteriche complesse e singoli isolati. I metodi per identificare le specie di batteri e la conformazione e l&#39;identità delle cassette geniche Integron associata sono dati. Il metodo è adatto per una vasta gamma di alimenti vegetali e animali, ed esempi di workflow tipici sono fornite per ciascuno di questi tipi di alimenti.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Colourless Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Used in all PCRs</td></tr><tr><td>RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas)</td><td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Used in all PCRs</td></tr><tr><td>HinFI restriction enzyme</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA</td></tr><tr><td>100 bp ladder</td><td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>Used as a size standard on all agarose gels</td></tr><tr><td>GelRed DNA stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material</td></tr><tr><td>CLS-TC Solution</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep tubes</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.</td></tr><tr><td>Binding matrix</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.</td></tr><tr><td>Fast Prep machine</td><td>MP Biomedicals</td><td>Number of options available</td><td>MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit &lt;a href=&quot;http://www.mpbio.com&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.mpbio.com&lt;/a&gt; for more information</td></tr></tbody></table>

screening foodstuffs for class 1 integrons and gene cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

Proiezione di colture miste e isolati batterici per intI1 Primer HS463a / HS464 PCR può essere utilizzato per rilevare la presenza della classe 1 integrone-integrasi gene, intI1 (Figura 1). Questo set di primer funziona bene per la rilevazione intI1 in colture miste, ed è anche utilizzato per lo screening colonie batteriche raccolte da dispositivo di spargimento (Figura 2). Isolati positivi dovrebbero generare una singola banda forte a 471 b...

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Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Screening prodotti alimentari per la Classe 1 integroni e Gene cassette

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

screening-foodstuffs-for-class-1-integrons-and-gene-cassettes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

9.0K Views.  Macquarie University. This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs. 

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Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Ricerca

Bioingegneria

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

Produzione di delezioni del Gene in Escherichia coli di trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Genetica

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized into five different toxinotypes, A through E, based on the carriage of four major toxin genes. The prevalence and distribution of these various toxinotypes is understudied, especially their pervasiveness in American retail food. Of particular interest to us are the type B and D strains, which produce epsilon toxin, an extremely lethal toxin suggested to be the environmental trigger of multiple sclerosis in humans. To evaluate the presence of different C. perfringens toxinotypes in various food samples, we developed an easy method to selectively culture these bacteria without the use of an anaerobic container system only involving three culturing steps. Food is purchased from local grocery stores and transported to the laboratory under ambient conditions. Samples are minced and inoculated into modified rapid perfringens media (RPM) and incubated overnight at 37 &#176;C in a sealed, airtight conical tube. Overnight cultures are inoculated onto a bottom layer of solid Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC) agar, and then overlaid with a top layer of molten TSC agar, creating a &#34;sandwiched&#34;, anaerobic environment. Agar plates are incubated overnight at 37 &#176;C and then evaluated for appearance of black, sulfite-reducing colonies. C. perfringens-suspected colonies are removed from the TSC agar using sterile eye droppers, and inoculated into RPM and sub-cultured overnight at 37 &#176;C in an airtight conical tube. DNA is extracted from the RPM subculture, and then analyzed for the presence of C. perfringens toxin genes via polymerase chain reaction (PCR). Depending on the type of food sampled, typically 15&#8211;20% of samples test positive for C. perfringens.

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

The objective of this protocol is to detect different Clostridium perfringens toxinotypes in locally purchased foods, particularly epsilon toxin producing strain types B and D, without the use of anaerobic chambers.

Arricchimento e rilevamento di Clostridium perfezioni tossinotipi nei campioni di alimenti al dettaglio

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized ...

Ambiente

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex PCR per la tipizzazione di stafilococco cassette cromosomiche Mec Tipi I a V, resistente alla meticillina<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Immunologia e infezioni

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the genome of Anopheles mosquitoes. Amongst these methods, the &#966;C31 system allows precise and stable site-directed integration of transgenes, or the substitution of integrated transgenic cassettes via recombinase-mediated cassette exchange (RMCE). This method relies on the action of the Streptomyces &#966;C31 bacteriophage integrase to catalyze recombination between two specific attachment sites designated attP (derived from the phage) and attB (derived from the host bacterium). The system uses one or two attP sites that have been integrated previously into the mosquito genome and attB site(s) in the donor template DNA. Here we illustrate how to stably modify the genome of attP-bearing Anopheles docking lines using two plasmids: an attB-tagged donor carrying the integration or exchange template and a helper plasmid encoding the &#966;C31 integrase. We report two representative results of &#966;C31-mediated site-directed modification: the single integration of a transgenic cassette in An. stephensi and RMCE in An. gambiae mosquitoes. &#966;C31-mediated genome manipulation offers the advantage of reproducible transgene expression from validated, fitness neutral genomic sites, allowing comparative qualitative and quantitative analyses of phenotypes. The site-directed nature of the integration also substantially simplifies the validation of the single insertion site and the mating scheme to obtain a stable transgenic line. These and other characteristics make the &#966;C31 system an essential component of the genetic toolkit for the transgenic manipulation of malaria mosquitoes and other insect vectors.

The protocol describes how to achieve site-directed modifications in the genome of Anopheles malaria mosquitoes using the &#966;C31 system. Modifications described include both the integration and the exchange of transgenic cassettes in the genome of attP-bearing docking lines.

Integrazione mediata dal sito φC31 e scambio di cassette in Anopheles Vettori della malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Screening and Isolation of C-Glycoside-Cleaving Intestinal Bacteria

C-glycosides are commonly found in medicinal plants and exhibit extensive structural diversity along with various bioactivities, including antibacterial, anti-inflammatory, antiviral, antioxidant, and antineoplastic activities. In C-glycosides, the anomeric carbon of the sugar moiety is directly connected to an aglycone through carbon-carbon bonding. Compared with O-glycosides, C-glycosides are structurally stable and resistant to acids and enzymes. Consequently, they are typically unbreakable, resulting in poor absorbability and low bioavailability. Interestingly, some intestinal bacteria can cleave C-C glycosidic bonds, providing a specific and environmentally friendly biological approach to degrade C-glycosides. In this study, a set of standard operating procedures (SOPs) was developed for screening intestinal bacteria capable of cleaving C-C glycosidic bonds based on the biotransformation model of natural compounds. The SOPs include the preparation and enrichment of intestinal bacteria, activity-oriented screening, and activity validation in a low-carbon source medium. This methodology provides a foundational reference for researchers aiming to isolate and study these specialized functional bacteria.

This study establishes a set of standard operating procedures (SOPs) for efficiently screening and isolating intestinal bacteria capable of cleaving C-glycosides.

Screening e isolamento dei batteri intestinali che scindono il glicoside C

C-glycosides are commonly found in medicinal plants and exhibit extensive structural diversity along with various bioactivities, including antibacterial, ...

Biochimica

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Utilizzo di co-coltura per rilevare chimicamente mediata interspecie Interazioni

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Biologia

Espressione genica a copia singola per la caratterizzazione di sistemi di efflusso multifarmaco

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sulla resistenza agli antibiotici utilizzando un ceppo batterico carente di efflusso e un sistema di espressione genica a copia singola

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.

Caratterizzazione di sistemi di efflusso multifarmaco in Acinetobacter baumannii utilizzando un ceppo batterico carente di efflusso e un sistema di espressione genica a singola copia

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Screening prodotti alimentari per la Classe 1 integroni e Gene cassette

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Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Produzione di delezioni del Gene in Escherichia coli di trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa

Arricchimento e rilevamento di Clostridium perfezioni tossinotipi nei campioni di alimenti al dettaglio

Multiplex PCR per la tipizzazione di stafilococco cassette cromosomiche Mec Tipi I a V, resistente alla meticillina

Integrazione mediata dal sito φC31 e scambio di cassette in Anopheles Vettori della malaria

Screening e isolamento dei batteri intestinali che scindono il glicoside C

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Utilizzo di co-coltura per rilevare chimicamente mediata interspecie Interazioni

Caratterizzazione di sistemi di efflusso multifarmaco in Acinetobacter baumannii utilizzando un ceppo batterico carente di efflusso e un sistema di espressione genica a singola copia

Caratterizzazione di sistemi di efflusso multifarmaco in Acinetobacter baumannii utilizzando un ceppo batterico carente di efflusso e un sistema di espressione genica a singola copia