Gli autori ringraziano W. Sun e K. Jansen per le discussioni critiche, e per il sostegno da parte del Nano Biomeccanica Lab presso l&#39;Università Nazionale di Singapore. NAK riconosce il sostegno di una Marie Curie IIF Fellowship.

Raccolta 1. Cella <ol><li> Ottenere MD-MBA-231 cellule dal 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Staccare le cellule dal tessuto piastra di coltura con 0,5% di soluzione di tripsina-EDTA. Usare 1 ml di soluzione di tripsina-EDTA per cellule coltivate in un pallone T25. </li><li> Cellule pellet in un tubo da 15 ml per centrifugazione a 200 g per 4 minuti, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 5 ml di coltura. </li><li> Conte densità cellulare, ρ, utilizzando un emocitometro. Nota: Per preparare il gel interno delle cellule testa di serie, la sospensione cellulare viene successivamente diluito 10 × per raggiungere la finale densità di semina delle cellule. Pertanto, è necessario 10 × sospensione cellulare concentrata. </li><li> Calcolare il volume di terreno richiesta per ottenere una concentrazione di 10 × cellulare: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> Nota: Un finale densità di semina delle cellule, c finale, di circa 215; 10 6 cellule / ml è consigliato per MD-MBA-231 cellule ed è utilizzato in questo protocollo. Altri densità di semina possono essere esplorate anche per altri tipi di cellule. </li><li> Cellule pellet ancora una volta in un tubo da 15 ml per centrifugazione a 200 g per 4 minuti, e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in quantità necessaria (V calcolati in fase di 1.3) di terreno privo di siero di coltura cellulare a fondo per ridurre al minimo aggregazione delle cellule. Nota: Il rosso fenolo è auto-fluorescente, e può interferire con l&#39;imaging di fluorescenza / riflessione. Uso di mezzo privo di rosso fenolo può essere considerato per ottenere la migliore qualità dell&#39;immagine. </li></ol> 2. Preparazione di collagene Solutions <ol><li> Ottenere la soluzione di riserva di collagene, 10 × tampone PBS, Milli-Q H 2 O, 0.1 M NaOH, e diversi microprovette. Tenere tutti sul ghiaccio per evitare premature collagene polimerizzazione, e mantenere condizioni sterili. </li><li> Equilibrare un vetro- sterilepiatto fondo di pre-riscaldamento nella C incubatore 37 °. Nota: Tutti i volumi di questo protocollo sono stati ottimizzati per un piatto fondo di vetro con 12 millimetri pure. Se si utilizza un altro tipo piatto, regolare i volumi di conseguenza. </li><li> Calcolare il volume richiesto di preparazione di 50 ml di 2,4 mg / ml soluzione di collagene per il gel interno (soluzione I) basata sulla concentrazione collagene magazzino. Nota: altre concentrazioni di collagene per il gel interno possono anche essere utilizzati. </li><li> In un ambiente sterile (tipicamente una cappa di biosicurezza), aggiungere lentamente 5 ml di 10 × tampone PBS alla quantità necessaria di collagene soluzione madre (calcolata al punto 2.3) con dolce vorticoso. Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Regolare il pH della miscela a 7,4 usando NaOH 0,1 M utilizzando calibrato pH-metro. Indicativamente, utilizzare circa 5 microlitri per portare il pH vicino a 7,4 (la quantità varia a seconda della concentrazione di magazzino e pH). Nota: Si noti che i volumi coinvolti in questopasso è troppo piccolo per l&#39;uso normale pH metro. Utilizzare uno dei seguenti trucchi: <ol><li> Preparare le soluzioni di collagene per più campioni. Regolare il pH in massa con pH normale metro e distribuire le soluzioni di collagene attraverso i campioni. </li><li> In alternativa, regolare il pH di una soluzione di collagene in volume più grande (i. E., Il volume che consente l&#39;utilizzo di pH normale metro). Notare la quantità di NaOH necessaria per portare il pH a pH finale. Scale giù i volumi e utilizzare la quantità appropriata di NaOH per l&#39;esperimento. Confermare il valore del pH utilizzando carta tornasole. </li><li> Altrimenti, utilizzare un elettrodo di pH micro per regolare più accuratamente il pH di piccole quantità. </li></ol></li><li> Portare la soluzione ad un volume di 45 microlitri con H 2 O. Eseguire tutti i passi sul ghiaccio per evitare premature collagene polimerizzazione. </li></ol> 3. La formazione di Concentric Gel Cultura <ol><li> Prendete il piatto fondo di vetro pre-riscaldato (vedi punto 2.2) da the incubatore. </li><li> Aggiungere 5 ml di sospensione cellulare concentrata 10 × (preparata al punto 1.5) di soluzione I. Risospendere accuratamente. Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle d&#39;aria. La miscela ha ora un volume di 50 microlitri e contiene la concentrazione finale collagene (2,4 mg / ml) e la densità delle cellule (c finale = 2 x 10 6 cellule / ml). </li><li> Aggiungere 20 ml della soluzione di cellule contenenti lentamente al centro del pozzo, in modo da formare una cupola a forma di goccia (Figura 1A). Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle in questa fase. Se si forma un bolla, con attenzione ma rapidamente cercare di rottura sia o aspirare utilizzando un puntale. Posizionare delicatamente il piatto di nuovo in incubatrice per lasciare il gel interno polimerizzare per 45 min. </li><li> Preparare la soluzione O (per esterno, gel di collagene acellulare) circa 15 minuti prima della fine di questa fase di incubazione. Nota: La condizione gel esterno può variare in termini di concentrazione di collagene e polimerizzazione a pHottenere reti con diverse microstrutture 10. In questo protocollo, concentrarsi su un 1,5-4,0 mg / ml di gel di collagene polimerizzato ad un pH di 7,4. <ol><li> Sulla base della concentrazione di collagene magazzino, calcolare il volume richiesto necessario per preparare 200 ml di soluzione di collagene O alla concentrazione finale. </li></ol></li><li> Aggiungere 20 ml di 10 × tampone PBS lentamente la quantità richiesta di soluzione di collagene magazzino (calcolata al punto 3.4) con dolce vorticoso. Regolare il pH della miscela a pH finale con 0,1 M NaOH con l&#39;uso di calibrato pH-metro. Vedere nota al punto 2.5 per quanto riguarda la regolazione del pH. </li><li> Portare la soluzione ad un volume finale di 200 microlitri con H 2 O. Eseguire tutti i passi sul ghiaccio per evitare premature collagene polimerizzazione. </li><li> Prendete il piatto dal incubatrice dopo 45 min polimerizzazione del gel interno (vedi punto 3.3). Aggiungere delicatamente 180 microlitri di soluzione di O sulla parte superiore del gel interno, in modo che la soluzione copre completamente i internagel e riempie il pozzo (Figura 1B). <ol><li> Eseguire attentamente questo passo senza agitazione la soluzione, che può portare ad orientamenti fibre non uniformi nel gel esterno. Fare attenzione a non toccare il gel interno con un puntale, e per evitare la formazione di bolle o sacche d&#39;aria. Se si forma un bolla, con attenzione ma rapidamente cercare di rottura sia o aspirare utilizzando un puntale. Posizionare delicatamente il piatto di nuovo in incubatrice per lasciare il gel polimerizzarli esterno. </li></ol></li><li> Prendete il piatto dal incubatrice dopo 45 min di polimerizzazione. Il gel dovrebbe essere già abbastanza solidificato, a questo punto, anche se può ancora staccarsi dalla superficie inferiore se maneggiata. <ol><li> Versare delicatamente 2 ml di mezzo di coltura cellulare riscaldata al piatto (Figura 1C). Assicurarsi che il gel è completamente sommerso nel mezzo. Aggiornare la media ogni 2 - 3 giorni in tutta la durata della cultura. </li></ol></li></ol> 4. Imaging Live-cell <ol><li> Eseguire immagini utilizzando un microscopio confocale invertito dotato di capacità di imaging live-cell-lungo termine. Include un built-in camera di incubazione con una temperatura (37 ° C) e controllo CO 2 (5%). Accendere il microscopio e riscaldare il palco, almeno 1 ora prima di avviare l&#39;esperimento. Nota: Utilizzare lente obiettivo con lunga distanza di lavoro per ottimizzare l&#39;osservazione e la localizzazione delle cellule in gel 3D. </li><li> Incubare il gel in terreno contenente 5 ml di colorante fluorescente inseguitore cellule per 30 minuti per consentire la localizzazione precisa delle cellule del sistema 3D. Successivamente, rimuovere il colorante mediante lavaggio tre volte con 1 × PBS. Successivamente, aggiungere mezzo di coltura cellulare al piatto. </li><li> Prendete il piatto dal termostato e posizionarlo sul palco microscopio (Figura 1D). Nota: l&#39;imaging cellulare dal vivo può iniziare in linea di principio a destra dopo la polimerizzazione del gel esterno. Tuttavia, a questo punto, le cellule in i gel interni non sono ancora diffuse. Per esaminare la migrazione delle prime cellule che hanno invaso il gel esterna, live-cell imaging può iniziare 24 ore (a seconda del tipo di cellula) dopo l&#39;inizio della coltura. Indicativamente, circa 12 - 14 giorni di coltura sono necessari per la maggior parte delle cellule del gel interno per immettere il gel esterno. </li><li> Selezionare Volumi di View (UTP di) nelle regioni del gel esterno che circonda il gel interno. Dopo 24 ore di incubazione, la popolazione cellulare sarà diffuso, attraversato l&#39;interfaccia tra i gel interno ed esterno, e ha iniziato a invadere il gel esterno. <ol><li> Per il Vov di includere le regioni gel immediatamente accanto all&#39;interfaccia gel, regioni intermedie, e le regioni vicino alla periferia del gel esterno 7. Esclusione regioni più stretta di 50 micron dalla superficie inferiore e laterale, nonché dalla parte superiore del gel, per evitare possibili effetti di bordo. Ogni vov misura tipicamente 647 × 647 × 100 micron 3 (in x, Y e Z, rispettivamente), con intervallo di 5 micron di z impili. </li></ol></li><li> Assicurare modalità di imaging, i canali / filtri, tempi di esposizione, e le risoluzioni di immagine sono selezionati correttamente. Per l&#39;imaging senza etichetta della rete di collagene, utilizzare la microscopia confocale riflettanza simultaneamente durante il time-lapse imaging live-cell. </li><li> Prendere immagini di esempio, tracciare gli istogrammi di intensità, e regolare i guadagni e offset a osservare il segnale sufficiente e evitare la saturazione assicurando che l&#39;istogramma si trova tra lo zero e l&#39;intensità massima. Non modificare queste impostazioni più tutta la durata dell&#39;esperimento. </li><li> Prendere immagini time-lapse dei VOV di selezionati, con un intervallo di tempo, Δ t, di 10 minuti per 8 ore (o più se necessario). </li></ol> 5. Monitoraggio cellulare e analisi dei dati <ol><li> Effettuare immagine quantitative post-processing delle immagini impili z utilizzando appropria<html> te software di elaborazione delle immagini. <ol><li> Segmento le immagini time-lapse per selezionare automaticamente le posizioni di cellule 3D in (x, y, z, t). </li><li> Per ogni fotogramma, controllare manualmente la precisione di localizzazione e rimuovere i falsi positivi dovuti a detriti cellulari e sporgenze cellulari che potrebbero essere stati scambiati per le cellule. Rimuovere le cellule proliferative dall&#39;analisi e le cellule sovrapposte o collegate dividere in oggetti distinti. </li></ol></li><li> Generare tracce cellulari temporizzata 3D dalle coordinate di cella (x, y, z, t) ottenuti nella fase precedente collegando la posizione di ogni cella nella sequenza temporale. </li><li> Eliminare il rumore casuale e sistema rimuovendo tracce inferiori alla lunghezza di traccia soglia (tipicamente 20 min). </li><li> Correggere per la deriva del campione sottraendo gli spostamenti netti complessivi dai binari se necessario. </li><li> Calcolare spostamento delle cellule,iles / ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt;, e la distanza migrazione cellulare, <img alt="Equazione 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> , Dalle traiettorie cella osservati, dove è un vettore che rappresenta la posizione 3D di una cella al tempo ed è il numero totale di punti temporali. <ol><li> Calcolare velocità cella come S = d / (n • Δ t), dove Δ t è l&#39;intervallo di tempo tra i fotogrammi. Calcola direzionalità migrazione cellulare (o persistenza) con P = Δd / d. Questa semplice misura di persistenza implica che per P = 0 lo spostamento netto è zero e per P = 1 la traiettoria è una linea retta direzionale. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar...

La migrazione di cellule svolge un ruolo chiave nella varie risposte fisiologiche quali lo sviluppo embrionale, emostasi, e la risposta immunitaria, nonché in processi patologici come le malattie vascolari, infiammazione e cancro 1. Analisi dei fattori biochimici e biofisici sottostanti migrazione delle cellule è quindi di fondamentale importanza non solo per capire i principi fondamentali di funzioni cellulari, ma anche per avanzare varie applicazioni biomediche, come in ingegneria tissutale, anti-metastasi e sviluppo anti-infiammatori droga. Poiché osservazione in vivo è tecnicamente difficile, molti sforzi si è focalizzata sulla ricapitolazione in vitro della migrazione cellulare. Metodi in vitro per studiare la migrazione delle cellule sono state in gran parte progettato per test su due superfici bidimensionali (2D), in particolare il graffio o ferita guarigione test 2. Tali saggi offrono semplice setup sperimentale, facile live-imaging cellulare, e fornire indicazioni utili in diversi meccanismi biochimici alla base delle migrazioni delle cellule. Tuttavia, questi test non rappresentano matrice (ECM) Architettura e rimodellamento extracellulare, che sono aspetti critici nella comprensione della migrazione vivo. Recentemente, è stato sempre più apprezzato che un modello di coltura 3D, spesso in matrici a base di collagene 3, fornisce una piattaforma che meglio assomiglia la situazione in vivo. Infatti, le cellule presentano dinamiche migratori che sono distinti da quelli sulle superfici 2D, soprattutto a causa della diversa dimensionalità dell&#39;ambiente 4. Inoltre, le proprietà biofisiche e meccaniche della matrice influiscono sensibilmente migrazione cellulare 5, anche nel contesto di invasione delle cellule tumorali 6. Qui vi presentiamo un metodo per studiare il comportamento di migrazione delle cellule 3D in ECM con proprietà biofisiche che possono essere facilmente variati condizioni di preparazione. Le cellule sonotesta di serie in un &quot;gel interno&quot; e sono autorizzati a fuggire in e invadere la &quot;gel esterno&quot; inizialmente acellulare. Il metodo si basa sulla capacità delle cellule di riconoscere la presenza e la propensione a migrare in regioni prive di cellule nel gel esterna, che è strettamente legato alla cella mechanosensing 7. In questo studio, ci avvaliamo di reti di collagene come il ECMs invasi dalle cellule del cancro al seno altamente invasive, MD-MBA-231. Le proprietà meccaniche e microstruttura di entrambi i gel interno ed esterno possono essere sintonizzati 8 e 9 caratterizzato per raggiungere condizioni fisiologicamente rilevanti. Ricostruzione e analisi delle tracce cellulari consentono esame quantitativa dettagliata del comportamento di migrazione spaziotemporale sia a livello della popolazione e livello di singola cellula. È importante sottolineare che la messa a punto del sistema di gel concentrica imita il vivo topologia tessuto affrontato da migrazione delle cellule, in particolare invadere le cellule tumorali, offrendo spunti importantiai meccanismi fisici di migrazione cellulare e metastasi.

<table><tbody><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Fisher Scientific Pte Ltd</td><td>Model: 371, S/No 318854-6055</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon A1R</td><td></td><td>Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottom dish</td><td>IWAKI Cell Biology</td><td>3931-035</td><td>35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>iN CYTO</td><td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td><td></td></tr><tr><td>Microprocessor pH meter</td><td>Hanna Instruments</td><td>pH 211</td><td></td></tr><tr><td>Nutragen Collagen</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>#5010-D</td><td>Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)</td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Nikon</td><td></td><td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Sartorius</td><td>S/No 29153352</td><td>Basic pH Meter PB-11</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr></tbody></table>

concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration

La capacità delle cellule di migrare è cruciale in un&#39;ampia varietà di funzioni cellulari per tutta la vita di sviluppo embrionale e la guarigione della ferita al tumore e metastasi. Nonostante intensi sforzi di ricerca, i principi biochimici e biofisici fondamentali della migrazione cellulare non sono ancora pienamente compresi, soprattutto nelle fisiologicamente rilevanti (3D) microambienti tridimensionali. Qui, descriviamo un test in vitro per permettere l&#39;esame quantitativo di comportamenti di migrazione delle cellule in 3D. Il metodo sfrutta la capacità mechanosensing della cellula e propensione a migrare nella matrice extracellulare precedentemente occupato (ECM). Usiamo l&#39;invasione delle cellule del cancro al seno altamente invasivo, MDA-MB-231, in gel di collagene come sistema modello. La diffusione della popolazione cellulare e le dinamiche di migrazione delle singole cellule nel corso di settimane della cultura possono essere monitorati tramite live-cell imaging e analizzati per estrarre i dati spatiotemporally-risolti. Inoltre, Il metodo è facilmente adattabile per diverse matrici extracellulari, offrendo così un modo semplice ma potente per studiare il ruolo dei fattori biofisici del microambiente sulla migrazione delle cellule.

Il test gel concentrica qui presentato è stata effettuata utilizzando cellule di carcinoma mammario altamente invasive, MDA-MB-231, con 2,4 mg / ml di gel di collagene interna e una densità di semina cellulare di = 2 × 10 6 cellule / ml, come esempio. Come mostrato in Figura 2, tipicamente dopo alcuni giorni di coltura, le cellule violato l&#39;interfaccia gel interno-esterno e ha iniziato ad invadere il gel esterno. La popolazione di cellule diffuse prevalentemente radialmente verso l&#39...

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Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Le proprietà meccaniche e microstruttura della matrice extracellulare influenzano fortemente la migrazione delle cellule 3D. Un metodo in vitro per studiare il comportamento di migrazione delle cellule spazio-temporale in ambienti biofisico variabili, sia a livello della popolazione e delle singole celle, è descritto.

Concentric Sistema Gel per studiare il ruolo biofisica di Matrix Microenvironment sulla migrazione Cell 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K Views.  FOM Institute AMOLF.  Le proprietà meccaniche e microstruttura della matrice extracellulare influenzano fortemente la migrazione delle cellule 3D. Un metodo in vitro per studiare il comportamento di migrazione delle cellule spazio-temporale in ambienti biofisico variabili, sia a livello della popolazione e delle singole celle, è descritto. 

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Ricerca

Bioingegneria

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Studio della Migrazione cellulare in canali microfabbricati

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analisi della migrazione delle cellule all&#39;interno di una tridimensionale di collagene Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

Rivelare l&#39;organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali invasive in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Medicina

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microambienti sandwich di sfruttare Cellulari / Materiale Interazioni

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Che caratterizzano la migrazione delle cellule all'interno del tridimensionale In Vitro ferita ambienti

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

Quantificazione della migrazione cellulare tridimensionale all'interno e all'interno di biomateriali granulari in idrogel

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...

Concentric Sistema Gel per studiare il ruolo biofisica di Matrix Microenvironment sulla migrazione Cell 3D

Riepilogo

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Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Studio della Migrazione cellulare in canali microfabbricati

Analisi della migrazione delle cellule all'interno di una tridimensionale di collagene Matrix

Rivelare l'organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali invasive in 3D

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

Microambienti sandwich di sfruttare Cellulari / Materiale Interazioni

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D

Che caratterizzano la migrazione delle cellule all'interno del tridimensionale In Vitro ferita ambienti

Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant

Quantificazione della migrazione cellulare tridimensionale all'interno e all'interno di biomateriali granulari in idrogel

Concentric Sistema Gel per studiare il ruolo biofisica di Matrix Microenvironment sulla migrazione Cell 3D

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Rivelare l'organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali invasive in 3D

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Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D

Che caratterizzano la migrazione delle cellule all'interno del tridimensionale In Vitro ferita ambienti

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