Name: high-frequency ultrasound imaging of mouse cervical lymph nodes
Uploaded: 2015-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo Dorothy D. Radford Endowment dalla West Virginia University Maria Babb Randolph Cancer Center. L&#39;uso della West Virginia University animale Modelli e Imaging Facility (AMIF) e Microscopia Imaging Facility (MIF) (supportato dalla Maria Babb Randolph Cancer Center e NIH sovvenzioni P20 RR16440, P30 RR032138 / GM103488 e S10 RR026378) si ringraziano.

Tutte le procedure sugli animali hanno dimostrato in questo protocollo sono stati esaminati e approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Università West Virginia secondo protocolli 11-0412 e 14-0514 e condotto in conformità con i principi e le procedure descritte nella guida NIH per la cura e l&#39;uso degli animali. 1. Preparazione degli animali <ol><li> Anestetizzare un singolo mouse in una camera di induzione utilizzando 3% isofluorano miscelato con 1,5 L / min 100% di ossigeno. Rimuovere l&#39;animale dalla camera di induzione e posto in posizione supina sulla piattaforma di imaging preriscaldato a 40 ° C e mantenuta tra 37-42 ° C (Figura 2A). Conferma anestesia dalla mancanza di risposta ad una presa punta. </li><li> Posizionare il muso mouse all&#39;interno dell&#39;ogiva collegato al sistema di anestesia. Applicare l&#39;anestesia per mantenere la sedazione stato stazionario (1,5% isofluorane miscelato con 1,5 L / min 100% di ossigeno). </li><li> Applicare il lubrificante occhio ogni occhio per evitare essicatoio peg. Applicare gel per elettrodi agli elettrodi e utilizzare nastro per fissare ciascuno dei quattro zampe all&#39;elettrodo corrispondente. Gli elettrodi trasmettono ECG dell&#39;animale per il sistema di imaging per consentire il monitoraggio della frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria. Lubrificare ed inserire la sonda temperatura rettale per il monitoraggio continuo della temperatura corporea. La temperatura corporea del mouse normale è 36,9 ° C. 1-2 variazione ° C è normale mentre sotto anestesia. </li><li> Utilizzare crema depilatoria per rimuovere il pelo dal collo del mouse. Sciacquare la regione del collo con una garza imbevuta di acqua per eliminare i peli e la crema depilatoria eccesso. Facoltativamente, utilizzare ulteriore applicazione di crema depilatoria per rimuovere qualsiasi residuo corpo capelli (Figura 2B). </li></ol> 2. Identificazione e Image Acquisition of Mouse cervicale linfonodi Utilizzando HFUS <ol><li> Per iniziare, applicare uno strato di gel ultrasuoni riscaldato alla zona del collo priva di pelo. Utilizzare l&#39;applicazione di gel per un&#39;immagine ottimalequalità (Figura 2C). Evitare di introdurre bolle d&#39;aria nel gel durante l&#39;applicazione, che possono interferire con l&#39;imaging ad ultrasuoni. </li><li> Regolare la piattaforma di imaging 20-30 ° in modo che il mouse si trova con la testa un po &#39;elevato. Questa posizione aiuta a garantire il tasso di respirazione ottimale per il mouse. Posizionare il trasduttore 40 MHz trasversalmente nel sistema di montaggio ed abbassare fino alla parte anteriore della testina di scansione trasduttore è immerso nel gel ultrasuoni (Figura 2C). NOTA: Assicurarsi di non esercitare un&#39;eccessiva pressione sul collo del mouse, in quanto potrebbe causare difficoltà respiratorie eccessivo. Inoltre, è utile per l&#39;imaging di avere un buffer di gel fra il trasduttore e il mouse. </li></ol> B-Mode Imaging e rilevamento di Linfonodi: <ol start="3"><li> Utilizzando il computer che controlla il software di acquisizione HFUS, regolare la luminosità (B-) impostazioni della modalità per i seguenti parametri: Guadagno 22 dB, profondità 10,00mm, larghezza 14,08 millimetri. NOTA: Queste impostazioni sono un punto di partenza suggerito, e possono richiedere lieve regolazione per l&#39;acquisizione delle immagini ottimale tra le diverse applicazioni. Osservare le normali linfonodi cervicali come ovali strutture ipoecogene vicino alla superficie della pelle all&#39;interno di un campo iperecogeno circostante. La comparsa di linfonodi malati può variare tra i modelli. Per sistematicamente immagine tutti i linfonodi nella regione del collo eseguire le seguenti operazioni: <ol><li> Utilizzare l&#39;asse Y per la scansione del collo in un cranica caudale maniera verso la regione toracica. Utilizzare asse X per centrare l&#39;immagine. </li><li> Identificare i principali punti di riferimento: cavità orale, lingua e tiroide (Figure 3A, B e C; rispettivamente); inclinare la piattaforma di imaging per regolare in orizzontale la superficie ventrale del collo del mouse, rendendo entrambi i lati del collo appaiono anche nell&#39;immagine B-mode. La quantità di inclinazione dipende fisiologia di ogni singolo mouse. </li></ol></li&gt; <li> Effettuare una scansione 3D dell&#39;intero regione del collo dalla regione cavità / linguetta buccale alla tiroide, al fine di mappare linfonodi e monumenti associati tutto il collo. <ol><li> Individuare il / regione di cavità orale della lingua (Figura 3A) e annotare la posizione numerica della scala Y. </li><li> Individuare tiroide (Figura 3C) e annotare la posizione numerica della scala Y. </li><li> Calcolare la differenza fra i valori ottenuti in (2.4.1) e (2.4.2) per determinare la lunghezza totale in mm per la regione del collo immaginata. </li><li> Utilizzare la manopola Y per centrare il trasduttore sul punto medio della lunghezza totale determinata. </li><li> Premere il tasto &quot;3D&quot;. Inserire la lunghezza totale. Per ampiezza del passo 3D, utilizzare 0,076 millimetri per acquisire lo stack serie di immagini per l&#39;intera regione del collo. </li></ol></li><li> Una volta completata la scansione, selezionare il lato destro o sinistro del collo e centrare il trasduttore su un linfonodo individuale di interesse, quindi sollevare la 40 MHz trasduttore dal mouse. Rimuovere il trasduttore 40 MHz e sostituirlo con un trasduttore microscan 50 MHz (anche in posizione trasversale) per ottenere immagini ad alta risoluzione. Ricostituire il gel per ultrasuoni sul collo mouse e abbassare il trasduttore 50 MHz nel gel ultrasuoni. </li></ol> 3D Power Doppler Imaging <ol start="6"><li> Comportamento scansioni 3D con power Doppler a volume asini e la vascolarizzazione dei singoli linfonodi cervicali come segue: <ol><li> Premere il pulsante di accensione sulla tastiera di sistema per acquisire potere Dopper e regolare le seguenti impostazioni potere-mode: PRF 4 KHz, Doppler guadagno 34 dB, 2D guadagno 30 dB, profondità 5,00 millimetri, larghezza 4,73 millimetri. NOTA: Come prima, queste impostazioni sono un punto di partenza suggerito e può essere modificato in base alle esigenze per l&#39;acquisizione delle immagini ottimale in vari modelli. </li><li> Individuare il cranio-punto più del linfonodo di interesse e annotare la posizione sulla scala Y. </li><li> Individuare il punto più caudale stesso nodo e notela posizione sulla scala Y. </li><li> Calcolare la differenza di distanza per determinare la lunghezza totale del linfonodo (vedere fase 2.4.3). </li><li> Centrare il trasduttore sul punto medio della lunghezza totale determinata, utilizzando la posizione Y scala. </li><li> Premere il tasto &quot;3D&quot; e inserire la lunghezza totale dei linfonodi. Utilizzare 0,051 millimetri per il passo. NOTA: A causa della vicinanza del trasduttore alla regione toracica, il trasduttore 50 MHz può provocare un&#39;immagine Doppler instabile a causa del rilevamento del movimento respiratorio normale. Ciò può essere evitato utilizzando l&#39;opzione &quot;Respiration gating&quot;, disponibile nella scheda &quot;fisiologica&quot;. </li><li> Circondano il linfonodo selezionato con la scatola gialla che indica la regione da analizzare dal power Doppler e selezionare &quot;scan 3D&quot; per acquisire le immagini. Sollevare il trasduttore off del mouse e spostarlo verso il lato opposto del collo. Abbassare il trasduttore sul mouse e ripetere i passaggi sopra descritti per image linfonodi su questo lato del collo. </li></ol></li><li> Salva set di immagini per successive analisi. </li></ol> 3. cervicale biopsia del linfonodo <ol><li> Selezionare il linfonodo desiderato per la biopsia e mantenere HFUS di imaging con il trasduttore 50 MHz. Scelto il grande linfonodi cervicali visibile in ciascun lato del collo mouse. Linfa allargamento nodo indica in genere una risposta infiammatoria, e, pertanto, questi nodi sono candidati ideali per la biopsia. NOTA: Abbiamo trovato che è molto difficile condurre biopsie sui nodi cervicali inferiore a 10 mm 3. </li><li> Preparare l&#39;ago e la siringa per biopsia mettendo una siringa da 1 ml con annessa 27 G, 0,5 pollici ago nel porta siringa. Regolare il supporto dell&#39;ago per orientare l&#39;ago 90 ° al collo mouse (Figura 4A). </li><li> Preparare elevando l&#39;intera piattaforma del mouse al livello dell&#39;ago. Raggiungere questo obiettivo rimuovendo il motore 3D e passare a un più alto piattaform, o mettendo un oggetto solido di altezza adeguata sotto la piattaforma breve disponibile. Utilizzare un rack provetta per microcentrifuga in plastica per questo scopo. Se necessario, ruotare la piattaforma 180 ° per biopsia nodi posti sul lato del collo di fronte all&#39;apparato dell&#39;ago. </li><li> Regolare le impostazioni di acquisizione selezionando &quot;Preferenze&quot;, poi scegliendo &quot;Max &amp; tampone ampliato&quot;. Allargare il campo di vista per una profondità di 8,00 mm e larghezza di 9,73 millimetri. Accendere la guida ago utilizzando comporre lo schermo Keys. La guida dell&#39;ago prevedere la traiettoria dell&#39;ago sullo schermo e permette all&#39;utente di allineare il linfonodo di interesse nella posizione corretta per la biopsia. </li><li> Assicurarsi che il linfonodo rimane costantemente in vista centrando il linfonodo in mezzo o leggermente a sinistra del centro della schermata (Figura 4B). Per ottenere l&#39;intero ciclo cine della procedura, premere Pre-trigger della tastiera di sistema prima di iniziare la biopsia. </li><li> Regolare il porta-aghi fino a quando la punta dell&#39;ago entra in vista e in contatto con la pelle (Figura 4B). Avanzare l&#39;ago con una ditta, veloce spingere per forare la pelle. Continuare a far avanzare l&#39;ago finché la punta perfora anche la capsula (Figura 4C) ed è visibile all&#39;interno del midollo (Figura 4D). </li><li> Una volta che l&#39;ago è posizionato correttamente all&#39;interno del nodo, tirare delicatamente lo stantuffo della siringa schiena tra le 200-300 demarcazioni microlitri di condurre la biopsia (Figura 4D e 4E). Si noti che il materiale bioptico non è tipicamente visibile all&#39;interno della siringa. </li><li> Rimuovere delicatamente l&#39;ago dal collo del mouse. Espellere il contenuto della siringa in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Rimuovere l&#39;ago dalla siringa, lasciando l&#39;ago nel tubo. Raccogliere 1 ml di supporti biopsia (da un&#39;aliquota, separati dalla sorgente magazzino) con la stessa siringa, e quindi ricollegare l&#39;ago alla siringa, mantenendo l&#39;ago in the tubo. <ol><li> Lavare la siringa e l&#39;ago con i media biopsia espellendo media biopsia nel tubo. NOTA: Non tirare indietro lo stantuffo mentre l&#39;ago è collegato in qualsiasi momento dopo la biopsia. Questo riduce il rischio di perdere il materiale bioptico a causa delle piccole dimensioni del campione. </li></ol></li><li> Confermare linfa contenuto del nodo mediante istologici (figura 4F) e analizzare con metodi aggiuntivi (istochimica, citometria a flusso, etc.) a seconda dei casi. </li><li> Una volta che la biopsia è completata, spegnere l&#39;anestesia e rimuovere la sonda di temperatura rettale. Rimuovere gel per ultrasuoni in eccesso dal mouse con una garza e rimuovere il nastro da ciascuna zampa. </li><li> Rimuovere il mouse dalla piattaforma di imaging e tornare ad una gabbia. Sanguinamento minimo dal sito biopsia può verificarsi, ma questo si ferma senza l&#39;intervento. Monitorare il mouse durante il recupero fino piena attività è ripresa. </li></ol> 4. Immagine Analisi delle cervicali Linfonodi <ol><li&gt; Nel software ultrasuoni, selezionare l&#39;immagine per l&#39;analisi e passare alla scheda &quot;Image Processing&quot;. Scegliete &quot;Load in 3D&quot;. </li><li> Selezionare &quot;3D Ricostruita Immagine&quot; in alto a sinistra, cliccando sul pulsante &quot;Visualizza Pane Single&quot;. Utilizzare la funzione di zoom per ingrandire l&#39;immagine se lo si desidera. Toggle &quot;Layout Display&quot; per visualizzare l&#39;immagine solo in B-mode, che elimina la sovrapposizione power Doppler alla vista. Questo rende più facile vedere i bordi del linfonodo durante la successiva analisi 3-D. Scorrere la serie di immagini per individuare l&#39;inizio del linfonodo. </li><li> Per circoscrivere il linfonodo, accedere alla scheda &quot;Impostazioni 3D&quot;. Selezionare &quot;Volume&quot;, poi il pulsante &quot;Start&quot; accanto a &quot;parallelo&quot;. </li><li> Disegna contorni intorno alla zona di interesse all&#39;interno delle singole immagini scorrendo. Continuare fino a quando le immagini che comprendono l&#39;intero linfonodo sono contrassegnati. Scegliere &quot;Fine&quot; percompletare l&#39;analisi. </li><li> Nella parte inferiore dell&#39;immagine, viene visualizzata automaticamente 3D volume e% vascolarizzazione. NOTA: 3D il volume corrisponde al volume dei linfonodi, e cento vascolarizzazione rappresenta la percentuale del linfonodo positivo per il flusso di sangue dal power Doppler. </li><li> Toggle &quot;Layout Display&quot; per visualizzare il power Doppler Imaging come una sovrapposizione dell&#39;immagine B- modalità on. Sulla superficie vista osservare una vista netta dell&#39;area volume di interesse. Esportare le immagini in file di immagine (TIF) in formato 3D o scansioni nella categoria film (.avi) per un ulteriore uso. </li></ol>

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Costi di pubblicazione per questo articolo sono sponsorizzati da Visual Sonics.

Il protocollo descritto permette la visualizzazione e la valutazione in situ di murine linfonodi cervicali utilizzando non invasiva di imaging HFUS. L&#39;uso di B-mode e potenza Doppler per visualizzare cervicale morfologia linfonodi, volume e linfonodo flusso sanguigno prevede una analisi sperimentale preclinici sistemi modello topo simile a quello utilizzato per la caratterizzazione dei nodi cervicali paziente nella pratica clinica. La possibilità di monitorare i linfonodi cervial tramite biopsia con ago sottile offre anche una tecnica utile per rilevare le alterazioni delle cellule immunitarie e la presenza di tipi cellulari stranieri o batteri durante cavità orale malattia indotta linfadenopatie nei topi. La facilità di utilizzo e basso costo associato con HFUS permette lo screening rapido di stato dei linfonodi cervicali in un&#39;ampia varietà di modelli animali. Un passo fondamentale in questo protocollo è l&#39;identificazione successo iniziale dei linfonodi cervicali nelle immagini HFUS. La nostra struttura ha un assortimento di HFUS transducers come descritto, così li abbiamo utilizzati per ottenere immagini di altissima qualità. Tuttavia, se i trasduttori descriviamo non sono disponibili, è possibile adattare l&#39;immagine che utilizzano altri trasduttori. A questo scopo, regolando la profondità e la larghezza dell&#39;immagine per ottenere un&#39;immagine adeguata è tutto ciò che è richiesto. Risoluzione di tali immagini può variare, ma dovrebbe essere ancora possibile ottenere immagini di alta qualità usando HFUS. Monumenti Imaging della cavità orale e la ghiandola tiroidea notevolmente aiuto nell&#39;orientare l&#39;utente alla regione appropriata in cui sono localizzati i linfonodi. La caratteristica, natura ipoecogena ovale e la posizione superficiale vicino alla superficie della pelle consente di identificazione rapida conferma dei linfonodi cervicali all&#39;interno della regione corretta collo. Mentre tutti e tre i nodi possono essere visibili in un unico piano di imaging (figura 3B), tipicamente uno o due nodi vengono catturati durante l&#39;imaging. Aggiustamenti minori del trasduttore di posizione possono essere condotte a squarciareer di imaging diversi piani visibile, consentendo la visualizzazione di tutti i nodi su un unico lato del collo. Mentre abbiamo trovato la tecnica descritta affidabile per l&#39;identificazione di linfonodi cervicali, ci sono limitazioni specifiche per la tecnica di imaging e biopsia. La natura superficiale del topo linfonodi cervicali conferisce mobilità eccessiva quando anche una leggera pressione viene applicata alla pelle attraverso la testa trasduttore. Questo può essere neutralizzata lentamente applicazione della testina trasduttore nel gel ultrasuoni sul collo mouse finché sono state identificate le immagini di riferimento. Mobilità linfonodale può anche complicare la biopsia con ago sottile, soprattutto quando si utilizza trasduttori nella risoluzione più alta (50 MHz) gamma. Immagini centrate di linfonodi per biopsia sono tipicamente spinti fuori dal campo visivo dovuto alla forza della biopsia necessario per perforare la pelle sovrastante e capsule. Questo può essere risolto dal posizionamento fuori centro del linfonodo verso la direzione di entrata dell&#39;ago,fornire spazio per il linfonodo da spingere attraverso ma rimangono ancora all&#39;interno del campo di visualizzazione durante biopsia. Nella nostra esperienza, i linfonodi&gt; 10 mm 3 sono molto difficili da biopsia, e sono spesso spinti dalla ago piuttosto che penetrare durante ago avanzamento. Così, la biopsia andrebbe riservato ai linfonodi ingrossati in cui la dimensione è&gt; 10 mm 3 per garantire una sufficiente dimensione di destinazione del nodo e la stabilità nella regione cervicale. Inoltre, materiale bioptico non può contenere il numero di cellule sufficiente per le procedure che richiedono il numero di cellule grandi (ad esempio, citometria a flusso). HFUS è stato utilizzato con successo per visualizzare HNSCC ortotopica tumori 25, e ha il potenziale per controllare le metastasi nodo cervicale nei topi con tumori orali 24. Oltre a ultrasuoni, l&#39;imaging bioluminescenza è stato utilizzato anche per visualizzare la formazione del tumore orale ortotopica e metastasi linfonodali cervicali in topi vivi 26,27. Come un Alternapproccio ative, imaging bioluminescenza ha un netto vantaggio rispetto HFUS di essere in grado di quantificare direttamente la progressione del tumore e l&#39;onere metastatico nel tempo nello stesso animale. Mentre innegabilmente utile, l&#39;imaging bioluminescenza è in grado di misurare molti dei parametri visualizzati da HFUS, inclusa la linfa morfologia nodo, volumi nodali o il flusso di sangue. L&#39;imaging bioluminescenza richiede anche scatole scure specializzati per mantenere i topi durante l&#39;imaging, rendendo questa tecnica non adatto per l&#39;adattamento per biopsia con ago sottile. Inoltre, l&#39;imaging bioluminescenza richiede la produzione di cellule tumorali che esprimono stabilmente l&#39;enzima luciferasi, permettendo a questa tecnica deve essere utilizzato solo in casi di xenotrapianti ortotopici con le cellule tumorali luciferasi transfettate in topi immunocompromessi, o con sistemi di transgenici tessuto-specifici inducibili che limitano l&#39;espressione luciferasi in modo spazio-temporale specifico tessuto di origine tumorale. Al contrario, HFUS può essere used in combinazione con le immagini bioluminescenza in questi modelli, oltre ad essere in grado di immaginare linfonodi cervicali in modelli di tumori orali cancerogeno-indotta in topi con sistemi immunitari completi 28,29. Mentre HFUS può essere più adattabile alla maggior parte dei modelli murini di cancro orale, i dati combinata che può essere ottenuto da bioluminescenza e HFUS immagini in sistemi in cui le cellule tumorali esprimono luciferasi in grado di fornire un quadro più completo di coinvolgimento linfonodale cervicale rispetto sia di imaging modalità solo. La capacità di identificare e rilevare topo linfonodi cervicali in tempo reale consente questa tecnica per essere utilizzato nella maggior parte dei modelli di malattia orale che provocano linfoadenopatia infiammatoria dove l&#39;animale può essere mantenuto in posizione invertita in anestesia breve termine. Il rilevamento di metastasi ai linfonodi o infezioni batteriche e l&#39;impatto sulla concomitante linfonodo morfologia in animali vivi presenta un vantaggio significativo rispetto ai metodi tradizionaliche richiedono i linfonodi per essere rimosso da animali morti per l&#39;elaborazione istologica. Combinando HFUS con biopsia con ago sottile permette un mezzo per condurre l&#39;analisi patologica di routine dei linfonodi cervicali, simile a quello che viene condotto in clinica, che fornisce un metodo migliore per monitorare la progressione della malattia nella maggior parte dei modelli attuali murini di patologie del cavo orale.

Linfodrenaggio del liquido tessuto interstiziale è il metodo principale di diffusione per i microrganismi infettivi e tumori derivanti nella regione orale e maxillo-facciale 1,2. La valutazione clinica dei linfonodi cervicali è una pratica comune utilizzata diagnostico per determinare la presenza o la progressione di malattie che hanno origine nella cavità orale. Ciò sottolinea l&#39;importanza della raccolta linfonodi cervicali come preziosi siti anatomici per la diagnosi della malattia orale 3. Diverse metodologie di imaging specializzati sono clinicamente utilizzati per identificare malate linfonodi cervicali. Questi includono la tomografia a emissione di positroni (PET), la tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MR). Mentre grande valore, tutti questi metodi richiedono ampie preparazione del paziente, attrezzature altamente specializzate e / o infusione chimica nella circolazione per abilitare o migliorare il processo di imaging. L&#39;imaging ecografico (ultrasuoni, Stati Uniti) è una tecnica comunemente applicato utilizzata per imetà linfonodi cervicali presentano linfoadenopatia a causa di infezioni o metastasi 4-6. Stati Uniti è spesso combinato con PET-TC e RM per fornire una rappresentazione globale dello stato linfonodale paziente, contribuendo a determinare la stadiazione del tumore e la necessità di escissione chirurgica 7. La natura non invasiva degli Stati Uniti ha anche vantaggi intrinseci rispetto ad altre modalità di imaging, tra cui la facilità di utilizzo, a basso costo, il minimo disagio per il paziente e la preparazione. La posizione sottocutaneo superficiale della maggior parte dei linfonodi cervicali permette agli Stati Uniti a guidare mini-invasive fini biopsie ago aspirazione con maggiore precisione, migliorando l&#39;accuratezza diagnostica 8. Commercial-alta frequenza (HF) US fornisce una risoluzione dettagliata delle strutture anatomiche interne a 30 micron 9. Utilizzando trasduttori vanno 22-70 MHz, HFUS è facilmente applicata ad una varietà di sistemi di roditori sperimentali per permettere imaging in tempo reale degli organi interni in vivo.; HFUS è stato adattato per la visualizzazione della formazione di tumori in convenzionale luminosità (B) -MODE, nonché con un numero di generale e specializzata agents9 miglioramento del contrasto. Utilizzando power Doppler con HFUS fornisce la possibilità di monitorare il flusso di sangue all&#39;interno dei tumori del mouse, consentendo una valutazione globale di perfusione angiogenico nei topi dal vivo 10,11. HFUS è stato usato per visualizzare malate nodi linfatici del mouse all&#39;interno della cavità del corpo principale, dimostrando l&#39;utilità parallelo di questa tecnologia per la pratica clinica. In particolare, infiammatorie e metastatici alterazioni linfonodi viscerale è stato osservato in modelli murini di cancro al seno nutrire 12,13, pancreatici 14, del colon-retto e del polmone 15 16 tumori, così come histocytomas fibrosi 17, e di un modello murino di età idronefrosi acquisito 18 . Questi esempi solidificare il valore di HFUS come un potente strumento di indagine per linfoadenopatia neoplastica in un&#39;ampia varietà di rosistemi dent. Diversi modelli di infezione batterica 19,20 e testa e del collo a cellule squamose (HNSCC) 21,22 sono stati sviluppati per studiare queste malattie in ambito preclinico. In contrasto con gli esseri umani, i topi contengono tre linfonodi cervicali che un&#39;indagine della linfa dai tessuti orali cavità (mandibolare, mandibolare sottomandibolare e parotide superficiali 23). Recentemente, abbiamo riportato l&#39;uso di HFUS per mappare la posizione e la morfologia di questi linfonodi, il monitoraggio dei cambiamenti nei linfonodi di volume nodo e il flusso di sangue in un modello murino cancerogena indotta HNSCC 24. Qui, mettiamo a disposizione un protocollo dettagliato per l&#39;utilizzo di HFUS per l&#39;identificazione, l&#39;imaging e l&#39;analisi dei linfonodi cervicali in topi vivi. Questo protocollo dimostra anche la possibilità di utilizzare HFUS condurre immagine- guidata ago sottile biopsia del mouse allargata linfonodi cervicali, consentendo il monitoraggio istologico di cambiamenti nel contenuto di linfonodi cervicali e patologie oltre tIme nello stesso animale. Questo protocollo è facilmente adattabile per consentire lo studio dettagliato delle patologie cervicali linfonodali risultanti da qualsiasi malattia invasiva cavità orale in topi.

<table><tbody><tr><td>Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td>VS-11945</td><td></td></tr><tr><td>Power Dopper Mode and 3D Mode</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td>VS-11952; VS-11484</td><td></td></tr><tr><td>Vevo compact anesthesia system</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td>SA-11983</td><td></td></tr><tr><td>Thermasonic Gel Warmer</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td></td><td>Optional</td></tr><tr><td>Transducers &amp;ndash; MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz - 55 MHz)</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td>VS-11960</td><td>Referred to as 40 MHz Transducer</td></tr><tr><td>Transducers &amp;ndash; MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz - 70 MHz)</td><td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td>VS-12026</td><td>Referred to as 50 MHz Transducer</td></tr><tr><td>Ophthalmic Ointment</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-1663</td><td></td></tr><tr><td>Electrode gel</td><td>Parker Laboratories</td><td>174-1525</td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td>Medical Arts Press</td><td>174-153000</td><td></td></tr><tr><td>Depilatory Cream</td><td>Carter Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>General Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-907</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>General Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lubricating gel</td><td>Parker Laboratories</td><td>57-05</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound gel</td><td>Parker Laboratories</td><td>01-50</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube rack</td><td>General Supply</td><td></td><td>Used to raise mouse platform for optimal biopsy position</td></tr><tr><td>27 G &amp;frac12; inch needle with 1 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-87</td><td></td></tr><tr><td>ThinPrep PreservCyt Solution</td><td>Hologic</td><td>70097-002</td><td>Refered to as biopsy media</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>General Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thinprep 2000 processor</td><td>Cytyc, Marlborough, MA</td><td></td><td>Blue Filter</td></tr><tr><td>Olympus AX70 Provis Microscope</td><td>Olympus, Center Valley, PA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-frequency ultrasound imaging of mouse cervical lymph nodes

Ad alta frequenza ultrasuoni (HFUS) è ​​ampiamente utilizzato come un metodo non invasivo per l&#39;imaging strutture anatomiche interne in piccoli impianti sperimentali animali. HFUS ha la capacità di rilevare strutture piccoli come 30 micron, una proprietà che è stata utilizzata per la visualizzazione linfonodi superficiali nei roditori di luminosità (B) -mode. La combinazione di power Doppler con immagini B-mode consente di misurare circolatorio flusso di sangue all&#39;interno dei linfonodi e altri organi. Mentre HFUS è stata utilizzata per l&#39;imaging linfonodo in un certo numero di sistemi modello del mouse, non è stato riportato un protocollo dettagliato descrive HFUS imaging e caratterizzazione dei linfonodi cervicali in topi. Qui mostriamo che HFUS può essere adattato per rilevare e caratterizzare linfonodi cervicali in topi. Combinato B-mode e di imaging power Doppler può essere utilizzato per rilevare gli aumenti del flusso sanguigno in linfonodi cervicali immunologicamente allargata. Descriviamo anche l&#39;uso di immagini B-mode per condurre fini biopsie di linfonodi cervicali senzades recuperare tessuto linfatico per l&#39;analisi istologica. Infine, a pochi passi di software assistita sono descritte per calcolare variazioni di linfa di volume nodo e di visualizzare i cambiamenti in linfonodo morfologia seguenti ricostruzione delle immagini. La possibilità di monitorare visivamente cambiamenti nella cervice biologia linfonodi nel tempo fornisce una tecnica semplice e potente per il monitoraggio non invasivo della cervice alterazioni linfonodi in modelli preclinici murini di malattie del cavo orale.

Lo schema generale per le procedure di imaging e biopsia è mostrato in Figura 1. Le fasi principali del procedimento includono corretta preparazione del mouse per l&#39;imaging, l&#39;identificazione dei linfonodi cervicali, corretta preparazione e la conduzione della biopsia, e l&#39;analisi di B immagini -mode e Doppler per misurare il volume e la quantità di vascolarizzazione all&#39;interno di ogni nodo selezionato utilizzando il software del computer. HFUS imaging topo linfonodi cervicali necessario applicare e mantenere l&#39;anestesia adeguate per tutto il periodo di imaging (Figura 2A), nonché la rimozione completa dei capelli che copre l&#39;intera zona del collo (Figura 2B). L&#39;applicazione di gel ultrasuoni per la regione depilata garantisce un segnale HFUS chiaro durante la procedura (Figura 2C). HFUS l&#39;imaging della regione del collo è aiutata dalla visualizzazione dei punti di riferimento anatomici cervicali che producono caratteristici immagini ecografiche. Figura3 mostra esempi degli organi principali (figura 3A-C), linfonodi cervicali in B-mode (Figura 3D) e in modalità power Doppler (Figura 3E). In tempo reale HFUS immagini in topi anestetizzati permette guidata ago sottile biopsia linfonodi cervicali simile a quello che è condotta nella pratica clinica. Posizionamento dell&#39;ago bioptico e la siringa raccolta attaccata al dispositivo microinjector controllo è mostrato in Figura 4A. B-mode successiva immagini ecografiche mostrano il posizionamento ideale ago prima biopsia (figura 4B), ago entrata punta in un linfonodo cervicale (Figura 4C), e la posizione dell&#39;ago durante la biopsia (Figura 4D). Close-up immagine mostra la punta dell&#39;ago all&#39;interno della midollare del linfonodo (figura 4E). L&#39;elaborazione dei componenti biopsia di cytospin rivela abbondanti gruppi di cellule linfoidi e del tessuto connettivo associate, verificando linfonodo di successobiopsia (Fig 4F). Analisi basata-computazionale di immagini HFUS consente di ottenere informazioni dettagliate su architettura linfonodi, il volume e il flusso vascolare. Utilizzando la modalità power Doppler e misurazioni del volume 3D, cento vascolarizzazione (PV) può essere calcolata dalla serie di immagini che comprendono interi nodi (Figura 5A). Inoltre, imaging 3D consente virtuale ricostruzione dei linfonodi, rivelando generale topografia linfonodo (Figura 5B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig1.jpg" /> Figura 1:. Presentazione schematica delle fasi del processo di HFUS diagnostico linfonodi cervicali nodo di imaging nei topi I passaggi chiave includono 1: Preparazione del mouse per l&#39;imaging HFUS e ottenendo 40 e 50 immagini ad alta risoluzione MHz della regione del collo contenente i tre topi linfonodi cervicali . 2: ago sottile guidata dalle immagini biopsia dei linfonodi cervicali e successiva analisi istologica<html> di biopsia materiale. 3: Computer-aided analisi dell&#39;immagine e ricostruzione 3D di immagini linfonodali ottenuti in B-mode e Doppler per determinare rispettivo volume linfonodo e percentuale (%) del flusso vascolare. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig2.jpg" /> Figura 2:. Panoramica del alta risoluzione nel sistema di micro-imaging in vivo per la valutazione dei linfonodi cervicali e la biopsia (A) Il sistema HFUS è mostrato con un mouse anestetizzato preparata per l&#39;imaging dei linfonodi cervicali. Anche indicato è microinjector (MI), e stage 3D-motore (3D MS) apparecchiature accessorie. (B) Primo piano vista di un mouse anestetizzato preparato per HFUS l&#39;imaging con rimosso in regione del collo capelli. (C) La stessa mouse con il trasduttore 50 MHz in posizione sul collo. Nota gel ultrasuoni supplementare utilizzato per facilitare collo regione imaging. 718fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: HFUS rappresentante immagini di anatomia del collo dell&#39;utero nella B-mode e power Doppler. (A, B) immagini B-mode della cavità orale, mostra la cavità buccale (BC) e la linguetta (T) individuate tramite tomografia vicina alla cavità nasale. I tre linfonodi cervicali trovate su ciascun lato del collo (etichettati M, mandibolare, SM, sottomandibolare, SP, parotide superficiale), appaiono come un gruppo di strutture ipoecogene in un piano di imaging singola come indicato (B). (C) La ghiandola tiroidea (Th), come visualizzato nella regione toracica superiore, che appare come una struttura a forma di farfalla ecogenica solido. (AC) sono stati visualizzati con un trasduttore 40 MHz; barra della scala = 1 mm. (D, E) Immagini rappresentative della normale (D) e allargata (E) linfonodi cervicali con B-mode e power Doppler (rosso). Le linee tratteggiate descrivono i singoli linfonodi. Barra di scala = 0,5 mm. <img alt="Figura 4" src = &quot;/ files / ftp_upload / 52718 / 52718fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4: cervicale biopsia del linfonodo set-up, imaging e analisi cytospin di materiale bioptico (A) La piattaforma di imaging che mostra la micro-iniezione e il posizionamento dell&#39;ago vicino al collo del mouse.. Una vasta cremagliera provetta (blocco arancione) è usato per sollevare leggermente la piattaforma, che consente il corretto posizionamento dell&#39;ago pur consentendo spazio per la fase 3D del motore. Questa disposizione riduce al minimo il tempo trascorso la rimozione della fase del motore per ogni mouse. (B - D) Interi immagini HFUS collo prelevati da un video di una biopsia del linfonodo cervicale con il trasduttore 50 MHz. (B) HFUS immagine B-mode che mostra l&#39;ago posizionato al lato del collo prima biopsia. La punta dell&#39;ago è la struttura iperecogena appena sotto la posizione della guida dell&#39;ago (linea tratteggiata verde) sovrapposto durante l&#39;imaging per indicare la traiettoria dell&#39;ago. Il linfonodo è nel centro dil&#39;immagine. Barra di scala = 1 mm. (C) l&#39;ingresso dell&#39;ago nel linfonodo. (D) biopsia del linfonodo cervicale. (E) biopsia ingrandita di linfonodi cervicali. Barra di scala = 0,5 mm. Analisi (F) Cytospin del rappresentante materiale bioptico linfa conferma biopsia successo. Barra di scala = 100 micron. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig5.jpg" /> Figura 5:. L&#39;analisi al computer di immagini 3D linfonodali cervicali (A) screenshot Rappresentante di un linfonodo analizzati utilizzando software per computer. Il nodo è circoscritto in blu; risultati dell&#39;analisi mostrano volume 3D e cento vascolarizzazione (PV) come indicato. (B) Una vista immagine superficie dello stesso nodo dopo l&#39;analisi 3D. Rende intero volume di linfonodo sulla base di misurazioni effettuate in A.

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High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Questo protocollo descrive l&#39;applicazione di ultrasuoni ad alta frequenza (HFUS) per l&#39;imaging di topo linfonodi cervicali. Questa tecnica consente di ottimizzare la visualizzazione e la quantificazione di cervicale morfologia linfonodi, il volume e il flusso di sangue. Immagine-guidate biopsia dei linfonodi cervicali e lavorazione di tessuto linfatico per la valutazione istologica è anche dimostrato.

Ad alta frequenza di Ecografia del mouse cervicali Linfonodi

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

high-frequency-ultrasound-imaging-of-mouse-cervical-lymph-nodes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

18.9K Views.  West Virginia University.  Questo protocollo descrive l'applicazione di ultrasuoni ad alta frequenza (HFUS) per l'imaging di topo linfonodi cervicali. Questa tecnica consente di ottimizzare la visualizzazione e la quantificazione di cervicale morfologia linfonodi, il volume e il flusso di sangue. Immagine-guidate biopsia dei linfonodi cervicali e lavorazione di tessuto linfatico per la valutazione istologica è anche dimostrato. 

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Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the initiation of an immune response 1. Here, we present methods for adoptive transfer of labeled T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node as first described in 2002 2. Two-photon imaging of immune cells requires that the cells are fluorescently labeled, either by staining with a cell tracker dye or by expressing a fluorescent protein. We demonstrate the adoptive transfer procedure of injecting cells derived from donor mice into the tail vein of a recipient animal, where they home to lymphoid organs within approximately 15-30 min. We illustrate the isolation of a lymph node and describe methods to ensure proper mounting of the excised lymph node. Other considerations such as proper oxygenation of perfused media, temperature, and laser power are discussed. Finally, we present 3D video images of naive CD4+ T cells exhibiting steady state motility at 37&deg;C.

Two-photon imaging has uncovered lymphocyte motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and durring an immune response 1. Here, we demonstrate adoptive transfer of T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node.

Dissezione e 2-Photon Imaging di linfonodi periferici nei topi

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

Ricerca

Biologia

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine superficiale Lymph Chirurgia Node

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Immunologia e infezioni

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imaging intravitale del Nodo poplitea Lymph mouse

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a primary tumor has been induced by tamoxifen treatment, an increase in metastatic burden is observed within 4-6 weeks after induction. This paper shows how Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) imaging can be exploited to monitor the increase in metastatic involvement of the inguinal lymph nodes by measuring the increase in their volume.
The UHFUS system is used to scan anesthetized mice with a UHFUS linear probe (22-55 MHz, axial resolution 40 &#181;m). B-mode images from the inguinal lymph nodes (both left and right sides) are acquired in a short-axis view, positioning the animals in dorsal recumbency. Ultrasound records are acquired using a 44 &#181;m step size on a motorized mechanical arm. Afterward, two-dimensional (2D) B-mode acquisitions are imported into the software platform for ultrasound image post-processing, and inguinal lymph nodes are identified and segmented semi-automatically in the acquired cross-sectional 2D images. Finally, a total reconstruction of the three-dimensional (3D) volume is automatically obtained along with the rendering of the lymph node volume, which is also expressed as an absolute measurement.
This non-invasive in vivo technique is very well tolerated and allows the scheduling of multiple imaging sessions on the same experimental animal over 2 weeks. It is, therefore, ideal to assess the impact of pharmacological treatment on metastatic disease.

Melanoma is a very aggressive disease that quickly spreads to other organs. This protocol describes the application of ultra-high-frequency ultrasound imaging, coupled with 3D rendering, to monitor the volume of the inguinal lymph nodes in the Braf/Pten mouse model of metastatic melanoma.

Analisi del volume dei linfonodi mediante imaging ecografico ad altissima frequenza nel modello murino geneticamente modificato braf/Pten del melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

Ricerca sul cancro

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes significantly. Genetically engineered murine models that mimic ATC&#39;s progression may help researchers to study treatments for this disease. Crossing three different genotypes of mice, a TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53&#916;ex2-10/&#916;ex2-10&#160;transgenic ATC model was developed. The ATC murine model was induced by an intraperitoneal injection of tamoxifen with overexpression of BrafV600E and deletion of Trp53, and the tumors were generated within about 1 month. High-resolution ultrasound was applied to investigate the tumor initiation and progression, and the dynamic growth curve was obtained by measuring the tumor sizes. Compared to magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography scanning, ultrasound has advantages in observing the ATC murine model, such as being noninvasive, portable, in real-time, and without radiation exposure. High-resolution ultrasound is suitable for dynamic and multiple measurements. However, ultrasonographic examination of the thyroid in mice requires relevant anatomical knowledge and experience. This article provides a detailed procedure for utilizing high-resolution ultrasound to scan tumors in the transgenic ATC model. Meanwhile, ultrasonic parameter adjustment, ultrasound scanning skills, anesthesia and recovery of the animals, and other elements that need attention during the process are listed.

The present protocol describes high-frequency ultrasonography for visualizing the entire mouse thyroid gland and monitoring the growth of anaplastic thyroid carcinoma.

Ecografia ad alta risoluzione per l'analisi di tumori ATC ortotopici in un modello murino geneticamente modificato

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes ...

Non-Invasive Ultrasound Assessment of Endometrial Cancer Progression in Pax8-Directed Deletion of the Tumor Suppressors Arid1a and Pten in Mice

Uterine cancers can be studied in mice due to the ease of handling and genetic manipulation in these models. However, these studies are often limited to assessing pathology post-mortem in animals euthanized at multiple time points in different cohorts, which increases the number of mice needed for a study. Imaging mice in longitudinal studies can track the progression of disease in individual animals, reducing the number of mice needed. Advances in ultrasound technology have allowed for the detection of micrometer-level changes in tissues. Ultrasound has been used to study follicle maturation in ovaries and xenograft growth but has not been applied to morphological changes in the mouse uterus. This protocol examines the juxtaposition of pathology with in vivo imaging comparisons in an induced endometrial cancer mouse model. The features observed by ultrasound were consistent with the degree of change seen by gross pathology and histology. Ultrasound was found to be highly predictive of the observed pathology, supporting the incorporation of ultrasonography into longitudinal studies of uterine diseases such as cancer in mice.

Non-Invasive Ultrasound Assessment of Endometrial Cancer Progression in Pax8-Directed Deletion of the Tumor Suppressors Arid1a and Pten in Mice

This protocol describes a method for monitoring the progression of morphological changes over time in the uterus in an inducible mouse model of endometrial cancer using ultrasound imaging with correlation to gross and histological changes.

Valutazione ecografica non invasiva della progressione del cancro dell'endometrio nella delezione diretta da Pax8 dei soppressori tumorali Arid1a e Pten nei topi

Uterine cancers can be studied in mice due to the ease of handling and genetic manipulation in these models. However, these studies are often limited to ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

Visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale Ex-Vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Ultrafast Doppler Ultrasound for Hepatic Microvasculature Analysis in Mice

Imaging and Quantification of the Hepatic Vasculature of Mice Using Ultrafast Doppler Ultrasound

Non-invasive in vivo imaging of the vasculature is a powerful tool for studying disease mechanisms in rodents. To achieve high sensitivity imaging of the microvasculature using Doppler ultrasound methods, imaging modalities employing the concept of ultrafast imaging are preferred. By increasing the frame rate of the ultrasound scanner to thousands of frames per second, it becomes possible to improve the sensitivity of the blood flow down to 2 mm/s and to obtain functional information about the microcirculation in comparison to a sensitivity of around 1 cm/s in conventional Doppler modes. While Ultrafast Doppler ultrasound (UFUS) imaging has become adopted in neuroscience, where it can capture brain activity through neurovascular coupling, it presents greater challenges when imaging the vasculature of abdominal organs due to larger motions linked to breathing. The liver, positioned anatomically under the diaphragm, is particularly susceptible to out-of-plane movement and oscillating respiratory motion. These artifacts not only adversely affect Doppler imaging but also complicate the anatomical analysis of vascular structures and the computation of vascular parameters. Here, we present a qualitative and quantitative imaging analysis of the hepatic vasculature in mice by UFUS. We identify major anatomical vascular structures and provide graphical illustrations of the hepatic macroscopical anatomy, comparing it to an in-depth anatomical assessment of the hepatic vasculature based on Doppler readouts. Additionally, we have developed a quantification protocol for robust measurements of hepatic blood volume of the microvasculature over time. To contemplate further research, qualitative vascular analysis provides a comprehensive overview and suggests a standardized terminology for researchers working with mouse models of liver disease. Furthermore, it offers the opportunity to apply ultrasound as a non-invasive complementary method to inspect hepatic vascular defects in vivo and measure functional microvascular alterations deep within the organ before unraveling blood vessel anomalies at the micron scale levels using ex vivo staining on tissue sections.

Ultrafast Doppler ultrasound (UFUS) with high spatial resolution (100 &#956;m) and sensitivity represents a suitable noninvasive imaging modality for obtaining a comprehensive qualitative overview of the hepatic vasculature. UFUS also facilitates quantitative measurements of the microvasculature, aiming to enhance our understanding of vascular disease mechanisms.

Non-invasive in vivo imaging of the vasculature is a powerful tool for studying disease mechanisms in rodents. To achieve high sensitivity imaging of the ...