Name: a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish
Uploaded: 2015-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish at JoVE.com

We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.

Entrambi i protocolli conformi agli orientamenti del Consiglio canadese di Animal Care (CCAC) e sono state effettuate con l&#39;approvazione dell &#39;Università di Ottawa Comitato Animal Care (Protocollo BL-226). 1. Tempo di colorazione differenziale Tecnica: mitocondrio-ricchi Dye Bath <ol><li> Preparare 1 soluzione madre mM MitoTracker Red sciogliendo 50 mg in 94,0 ml di dimetilsolfossido (100% DMSO). Conservare soluzione madre al buio a -20 ° C quando non in uso. Evitare cicli di congelamento / scongelamento. </li><li> Preparare scatole scure (3-6 scatole) con un volume massimo di 600 ml. Riempite le caselle con 400 ml di acqua sistema (acqua il pesce si svolgono normalmente a) e mettere una pietra d&#39;aria in ogni casella per fornire una fonte di O 2. Ottenere pesci rossi (30 - 40 g) e metterli in scatole con 400 ml di acqua e una pietra d&#39;aria. Dopo 30 minuti, aggiungere il colorante ricco mitocondrio praticabile per produrre concentrazioni finali di 0,1 micron e 0,01% DMSO. Bagnare il pesce per 4 orer. <ol><li> Se questi sono i pesci di controllo (cioè, senza denervazione), attivare il flusso di acqua per le scatole, permettono la tintura di scovare e recuperare il pesce per il periodo di tempo assegnato nel protocollo. I pesci sono generalmente recuperati per 3 - 5 giorni. </li></ol></li><li> Dopo il periodo di recupero procede alla Sezione 3: Tecnica Tempo colorazione differenziale: immunoistochimica. Se questi pesci devono essere denervato procedere alla Sezione 2: Completa Procedura Denervation bilaterale. </li></ol> 2. Procedura completa Denervation bilaterale <ol><li> Ottenere 1 paio di forbici studente primavera Vannas (curve), 1 paio di pinze-rette modello standard, 1 paio di pinze-curve del modello standard, 2 paia di No. 5 pinze, 1 paio di divaricatori tissutali, palle piccolo di cotone (1 - 2 mm di diametro) e tamponi di cotone (Q consigli o equivalenti). </li><li> Preparare bagnomaria anestetico. Innanzitutto, sciogliere 10 g di benzocaina ad un volume finale di 100 mldel 99% di etanolo per preparare una soluzione madre. Per preparare bagnomaria anestetico, sciogliere 15 ml della soluzione madre benzocaina in 30 L di acqua sistema areato alla temperatura richiesta. Aerare l&#39;acqua mettendo una pietra aria collegata ad una pompa ad aria o aria linea centrale nel serbatoio dell&#39;acqua. <ol><li> Mettere il pesce in bagno d&#39;acqua anestetico (Figura 1A). </li><li> Una volta che la respirazione è cessata, posizionare il pesce su un tavolo chirurgia e intubazione come mostrato nella Figura 1B. A tale scopo, l&#39;inserimento di un tubo nella sua cavità buccale per irrigare le branchie con soluzione di anestetico aerato. Irrigazione delle branchie assicura che il pesce viene fornito con una sufficiente quantità di O 2 e anestetico durante la procedura di denervazione. Posizionare il pesce in modo che la testa è inclinata leggermente verso il basso. Questo permette un migliore accesso alla zona dietro il quarto arco branchiale. </li></ol></li><li> Sollevare delicatamente l&#39;opercolo con le rette pinza modello standarde posizionare i divaricatori tissutali tra l&#39;opercolo e l&#39;interno della testa. Aprire con cautela i divaricatori dei tessuti per mantenere l&#39;opercolo lontano dalla testa e mantenere le branchie esposti. </li><li> Assicurarsi che la soluzione di anestetico viene irrigando le branchie durante questa procedura. Riposo il divaricatore gestisce accanto alla testa, che fornisce l&#39;accesso a tutti i quattro archi branchiali. </li><li> Posizionare le curve pinza modello standard tra il quarto arco branchiale e la parte posteriore della testa e delicatamente aprirli per creare tensione nella legamento allegando il quarto arco branchia alla testa. Con un paio di n ° 5 pinze creare una piccola apertura (2-3 mm), forando l&#39;epitelio che collega l&#39;estremità dorsale degli archi branchiali alla cavità opercolare. Fare attenzione a non andare troppo in profondità perché c&#39;è il rischio di danneggiare un vaso sanguigno. </li><li> Con un piccolo batuffolo di cotone tenuto con No. 5 pinze lentamente e con attenzione ampliare l&#39;incisione per esporre il IX (glossofaringeo) e X (vago) nervi. Libero ilnervi da qualsiasi tessuto connettivo utilizzando il n ° 5 pinze, ancora una volta facendo attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni. NOTA: La IX e X branchiale nervi del pesce rosso profondo riposo dietro il quarto arco branchiale e sono in prossimità di importanti vasi sanguigni che alimentano nelle archi branchiali. </li><li> Una volta che i nervi sono stati identificati uso le forbici curva molla per tagliare con attenzione i nervi tenendo l&#39;incisione aperta con le curve pinza forma standard. Dopo recidere i nervi, estrarre con cautela le pinze curve. Non vi è alcuna necessità di chiudere l&#39;incisione con suture perché l&#39;epitelio è molto sottile e l&#39;incisione di solito chiude propria all&#39;interno di 24 - 48 ore. Rimuovere divaricatore tissutale. </li><li> Ripetere la stessa procedura sull&#39;altro lato della testa. </li><li> Accendere l&#39;irrigazione delle branchie da anestetico per acqua dolce aerato per recuperare il pesce da anestesia. Una volta che i movimenti opercolari hanno ripreso spostare il pesce nelle vasche sperimentali per recuperare per almeno 24 ore. </li><li&gt; eseguire una procedura di &quot;farsa&quot; in un gruppo separato di pesce. La procedura di &quot;farsa&quot; coinvolge penetrante l&#39;epitelio dietro il quarto arco branchiale senza recidere i nervi. </li></ol> 3. Tempo colorazione differenziale Tecnica: Immunohistochemistry <ol><li> Innanzitutto, preparare 4% paraformaldeide (PFA) in 1x tampone fosfato salino (PBS; 4 g PFA in 96 ml di PBS). PFA non si scioglie facilmente in PBS a temperatura ambiente. Soluzione di calore in un bagno d&#39;acqua per sciogliere PFA. Eseguire questo in una cappa aspirante. Una volta PFA è in soluzione lasciate raffreddare prima dell&#39;uso. Conservare a 4 ° C fino a 2 settimane. </li><li> Prima eutanasia il pesce ed estraendo il tessuto gill, posizionare 3 - 4 ml di 4% PFA in una fiala di scintillazione per un totale di 8 fiale di scintillazione (1 flaconcino per gill arch). Inoltre, prendere una piccola barca a pesare e riempirlo con 1x PBS. Questo verrà utilizzato per lavare il tessuto dopo che è stato asportato. Tenere tutte le soluzioni su ghiaccio. </li><li> Dopo l&#39;esposizione di colorante vitale ricco di mitocondrioesperimento è finito, eutanasia il pesce rosso mettendo in un bagno d&#39;acqua con una overdose di benzocaina. </li><li> Utilizzare pinze smussato per sollevare l&#39;opercolo su un lato della testa e forbici curve di recidere ciascuna estremità del cestello branchiale gill. Scegliere con cura le branchie per i rastrelli con pinze smussato e sollevarli dalla cavità opercolare. Lavare immediatamente le branchie in ghiaccio freddo 1x PBS per rimuovere l&#39;eccesso benzocaina e sangue. </li><li> Posizionare le branchie asportati in fiale separate (una fiala per ogni arco branchiale) riempito con 4% PFA e fissare O / N a 4 ° C. </li><li> Dopo fissazione, lavare l&#39;eccesso PFA in 1X PBS e posizionare il tessuto in una provetta 2 ml proiettile riempito con 1,5 ml di 1% Triton-X su un agitatore per 6 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Questo passaggio permeabilizes il tessuto. Se tutta la branchia è troppo grande per inserire in una provetta 2 ml poi tagliate il tessuto in sezioni abbastanza piccolo per adattarsi tubo facendo attenzione a non danneggiare i filamenti. <ol><li> Preparare le diluizioni di anticorpi primari di Mixing 4 ml di soluzione madre di ogni anticorpo primario (un totale di 8 ml) in 992 ml di 1x PBS. Assicurarsi che il NKA (etichette cellule NKA-ricchi) e Zn-12 (etichette neuroni) anticorpi primari sono stati sollevati nello stesso host. Ciò è importante se i ricercatori decidono identificare specifici sottotipi IC allo stesso tempo per il quale si dovranno utilizzare anticorpi primari e secondari sollevati in diverse specie ospiti. </li><li> Rimuovere la soluzione di Triton-X e senza lavare il tessuto aggiungere un 1: 250 diluizione (diluito in PBS 1x) di un anticorpo monoclonale NKA (α-5) per rilevare le cellule NKA ricchi e un anticorpo specifico neuronale zebrafish (zn-12) per rilevare fibre nervose (anticorpi primari) e incubare su un agitatore per 6 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lavare l&#39;anticorpo primario 3 volte per 3 minuti ciascuno con 1x PBS. Per fare questo, rimuovere la soluzione di anticorpo primario dal tubo aspirando fuori usando una pipetta. </li><li> Preparare l&#39;anticorpo secondario a un1: 200 diluizione mescolando 5 ml di brodo anticorpo secondario in 995 ml di 1x PBS. Applicare anticorpo secondario (Alexa Fluor 488) e incubare per 6 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C su un agitatore. NOTA: MitoTracker rosso è eccitato a ~ 594 nm e verrà fluorescenza rossa. Un anticorpo secondario che viene eccitato a ~ 488 nm di lunghezza d&#39;onda e reagisce in verde deve essere usato per etichettare NKA e Zn-12 anticorpi primari. </li><li> Rimuovere anticorpo secondario eccesso lavando il tessuto 3 volte per 5 minuti ciascuno (come descritto nel passaggio 3.7). </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Dopo i lavaggi, montare il tessuto su un vetrino concava per montare tutto confocale di cellule e fibre nervose. Per montare il tessuto, il primo posto in una goccia (200 ml) di 1x PBS su un vetrino da microscopio piatta. Questo assicura che il tessuto non essiccare. </li><li> Separare i hemibranchs branchia con curve micro-forbici. Mettere una goccia di PBS 1x e una goccia di mezzo di montaggio in una diapositiva concava. </li><li> Posizionare i hemibranchs separati nella diapositiva concava con il bordo anteriore del filamento rivolto verso l&#39;alto e coprire con un vetrino coprioggetto. Tamponare i bordi del coprioggetto con smalto per evitare vetrino da spostano e spostando il tessuto. Lasciare il tessuto di depositarsi sul fondo della slitta concava per 10 - 15 minuti prima di imaging. </li><li> Per ogni arco branchiale, selezionate sei filamenti branchiali a caso per l&#39;imaging, la produzione di sei immagini per arco branchiale. Utilizzare microscopia confocale convenzionale immagine del tessuto prendendo 1-3 micron fette ottici. NOTA: Tutte le cellule pre-esistenti sarà etichettato con MitoTracker rosso e positivo per NKA apparirà solo giallo. Le cellule che appaiono di colore rosso solo i circuiti integrati preesistenti che non contengono NKA. Ogni cella appena proliferato sarà solo positivo per NKA e apparirà solo verde. Le fibre nervose appaiono anche verde. </li></ol> 5. Analisi immagine per Ionocyte quantificazione <ol><li> Per each branchia filamento che è stato ripreso, quantificare i circuiti integrati e innervazione associato scorrendo le sezioni della pila Z e contando il numero di lamellari e filamental circuiti integrati presenti e anche se non sono state recentemente differenziati, pre-esistenti, e / o innervata . </li><li> Quantificare i circuiti integrati per filamento o per area (mm 2) del filamento. Per fare ciò, utilizzando gli strumenti di disegno associati al software utilizzato per acquisire le immagini per delineare le lamelle del filamento che comprende l&#39;area del filamento in cui sono stati quantificati gli integrati. La maggior parte dei programmi software di imaging confocale hanno la possibilità di calcolare l&#39;area di una regione delineato sull&#39;immagine. Utilizzare l&#39;opzione nel software di imaging che permette di fare questo per acquisire l&#39;area. </li><li> Dividere le CI contati dal area calcolata dal software per ottenere una misura di circuiti integrati per unità di superficie (ad esempio, per mm 2). </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> La tecnica di colorazione differenziale di tempo può essere un utile strumento per comprendere la regolazione dinamica di ioni assorbimento e di esaminare la redistribuzione temporale di circuiti integrati in epiteli branchia. Sebbene una procedura semplice, ci sono una serie di punti chiave che sono cruciali per il successo del tempo tecnica di colorazione differenziale. Il pesce rosso deve essere esposto al colorante ricco mitocondrio per il tempo assegnato nel protocollo. Esposizioni più brevi si tradurrà in scarsa captazione del colorante da parte delle cellule ricche di mitocondrio (cioè, ionocytes). Durante la fissazione, il tessuto branchia deve essere asportato rapidamente e tenuti all&#39;oscuro per evitare foto sbiancamento. Il tessuto deve essere processato per l&#39;imaging entro 2 settimane di fissazione. Durante la procedura bilaterale sezionamento nervo garantire che il pesce è ben anestetizzato; i nervi ei vasi sanguigni sono chiaramente identificati; e il pesce riprende pieno funzione opercolare prima di essere spostato in un serbatoio di recupero. &quot;&gt; L&#39;ambiente FW presenta pesce con la duplice sfida di bilanciare le perdite di ioni passivi e aumento di acqua osmotizzata 14. Il bilanciamento delle perdite di ioni passivi avviene tramite la diffusione attiva di sale attraverso i circuiti integrati che sono localizzate al filamental e epiteli lamellare dove possono entrare in contatto diretto con l&#39;ambiente esterno 2,4,8,9,16. Tuttavia, la posizione dei circuiti integrati sul Gill non è statica. Negli ultimi tre decenni, un certo numero di studi hanno dimostrato che diverse specie di pesci FW, di fronte con una sfida ionico e / o la temperatura, ridistribuire CI branchiali dal filamento o di base della lamella alle regioni più distali del lamelle 1,2,4,5,17-21. Tale ridistribuzione può aumentare lo spessore delle lamelle che possono compromettere il trasferimento di gas (O 2, CO 2) attraverso gli epiteli branchia 22. I ricercatori hanno utilizzato la tecnica di colorazione differenziale volta descritto in questo manoscritto per monitorare il trasferimento e emergence dei nuovi circuiti integrati sul epiteli branchia in queste diverse condizioni sperimentali (Figura 1C) 1,4,5. Le branchie, e presumibilmente i circuiti integrati branchiali, sono innervati dal IX e X nervi cranici 7,23-25. Questi nervi portano sia efferente input afferenti e da e verso il gill, rispettivamente. Si trovano sul lato dorsale della cavità buccale dietro al 4 ° branchia arch. L&#39;accessibilità dei nervi e la facilità con cui la procedura di denervazione bilaterale può essere eseguita sia specie-specifico. In trota, per esempio, l&#39;anatomia appuntito ed appiattito della testa consente ai nervi giacciono in un unico piano dietro 4 ° gill arco sotto un sottile strato di tessuto. Questo rende i nervi visibili e facilmente accessibili al ricercatore di eseguire la procedura di denervazione. Al contrario, pesci rossi hanno un muso più corto e una testa più rotondo. IX e X nervi cranici di pesci rossi si trovano più in profondità la si dorsalede della cavità dopo il 4 ° arco gill occupando piani diversi. Questo orientamento limita la facilità di accesso ai nervi e richiede un approccio più accurata per identificare e recidere i nervi appropriati. Lo scopo della procedura di denervazione è rimuovere input afferenti ed efferenti sensoriali da e verso il gill, rispettivamente. Denervazione degli archi branchiali può essere accoppiato con esperimenti di flusso di ioni con radioisotopi (ad esempio, 22 Na). Queste tecniche possono essere utilizzate in tandem per studiare il contributo dell&#39;ingresso nervoso sul movimento di ioni attraverso gli epiteli gill. Un&#39;altra limitazione al procedimento denervazione è l&#39;incapacità di distinguere tra i neuroni sensoriali e motori, pertanto quando recidere il nervo fascio è possibile che entrambi i tipi di innervazione vengono rimossi. Severing eventuali motoneuroni può influenzare la branchia e movimento opercolare del pesce. Così, quando l&#39;esecuzione di esperimenti denervazione branchiali è importante monitorare anche la ventilazione dopo lapesce è recuperato dalla procedura per garantire che vi sia sufficiente circolazione gill sia per il gas e scambio ionico. I protocolli descritta nel presente manoscritto animali adulti tenuti al 00:12 luce: ciclo buio e nutriti pellet alimentari commerciali. Questi metodi possono essere modificati in vari modi. Innanzitutto, il periodo di recupero dopo l&#39;esposizione colorante ricco mitocondrio può essere regolato alle esigenze del protocollo del ricercatore (ad esempio, 1, 3, 5, o 14 giorni). Il più lungo periodo di recupero dopo ricchi-mitocondrio esposizione dye in laboratorio è stato 14 giorni di 4,5. Non c&#39;era una significativa diminuzione dell&#39;intensità della fluorescenza del colorante ricco mitocondrio dopo 14 giorni di recupero. In secondo luogo, l&#39;uso dell&#39;anticorpo primario α-5 è limitato solo identificare cellule ricche Nka e non distingue tra i differenti sottotipi di CI branchiali. Fortunatamente, in pesci rossi è stato stabilito che la maggior parte dei circuiti integrati sono entrambi mitochondrion-ricchi (etichetta con MitoTracker) e NKA-ricchi (etichetta con α-5), le cellule che non può essere il caso in tutte le specie ittiche 4,27. Esperimenti futuri possono concentrarsi sul seguito della redistribuzione temporale dei sottotipi specifici IC utilizzando anticorpi diretti specificamente contro una varietà di canali, pompe e scambiatori (ad esempio, NHE, H + pompa). Precedenti studi hanno trovato che la maggior parte dei ionocytes colorati con ricche di mitocondri dye mostra NKA immunoreactivity 4. Innervazione del IC può essere rilevato utilizzando un anticorpo primario contro-specific antigen neurone zebrafish-derivato (Zn-12). In questo studio, α-5 e Zn-12 anticorpi primari sono stati rilevati utilizzando lo stesso anticorpo secondario (Alexa Fluor 488) per entrambi. Questa limitazione è dovuta sia anticorpi primari a salire in un ospite mouse e viene superata dal fatto che le NKA ricchi cellule e neuroni possono distinguere morfologicamente pur fluorescenza dello stesso colore. Colorazione sequenzialecon differenti anticorpi secondari (ad esempio, prima α-5 con Alexa Fluor 488 poi Zn-12 con Alexa Fluor 594) può anche essere utilizzato per eliminare il problema di avere due marcatori fluorescenti stesso colore. Infine, il protocollo completo nervo sezionamento bilaterale può essere modificato per i nervi a specifici archi branchiali bersaglio. Ad esempio, il sezionamento nervo selettiva può essere eseguita sul primo arco gill separando delicatamente primo e secondo archi branchiali per esporre i nervi che conducono al primo arco gill alla fine dorsale del cestello gill (Figura 2B-E). La tecnica differenza di tempo può essere applicato anche per studiare la distribuzione di ionocytes in larvale pesce zebrafish come si sviluppano e transizioni trasporto ionico dalla pelle al gill.

Circuiti integrati sono l&#39;unità funzionale per la regolazione ionica nel pesce e si trovano sulle superfici epiteliali dei filamenti branchiali e lamelle 4,6-8,10. Sebbene una varietà di sottotipi sono stati descritti che possiedono caratteristiche uniche, molti dei circuiti integrati sono caratterizzati da una elevata densità di mitocondri (così essi sono anche noti come cellule ricco mitocondrio) e / o l&#39;abbondanza dell&#39;enzima Na + / K + ATPasi (NKA). In genere, questi circuiti integrati casa una varietà di altre pompe, canali ionici e scambiatori coinvolti nella regolazione di ioni (ad esempio, Na + / H + scambiatore Na + / Cl - co-transporter, H + pompa) 2,10,11. La ridistribuzione e la proliferazione di circuiti integrati, come un meccanismo di compensazione è fondamentale per il mantenimento della omeostasi di ioni in particolare durante lo stress ionico (ad esempio, l&#39;esposizione ad acqua ion-poveri) 4,8,9. Questo studio descrive un momento colorazione differenziale techniQue 1 per identificare ionocytes appena proliferato (CI) in branchie dei pesci. Questa tecnica è accoppiato con una denervazione bilaterale completa degli archi branchiali. Goldfish (Carassius auratus), le specie utilizzate in questi studi, è adatto per studiare la proliferazione delle cellule epiteliali branchie perché hanno una notevole capacità di rimodellare strutturalmente loro branchie 2. Gill rimodellamento riferisce alla crescita o retrazione di una massa cellulare interlamellare (ILCM) quando il pesce (normalmente mantenuta a 15 - 30 ° C) sono acclimatati per acqua fredda (&lt;15 ° C) o ipossia, rispettivamente 3. Studi precedenti che utilizzano il tempo di tecnica di pittura differenziale sui pesci rossi si sono concentrati sulla redistribuzione, innervazione e la proliferazione di circuiti integrati sul branchia nel contesto della branchia rimodellamento 4,5. Katoh e Kaneko 1 hanno sviluppato questa nuova tecnica per studiare la trasformazione e la sostituzione dei circuiti integrati branchiali in killifish (Fundulus heteroclitus) transfeRred da acqua di mare (SO) per l&#39;acqua dolce (FW). In questo studio, l&#39;attenzione è rivolta alla proliferazione e innervazione di circuiti integrati in pesci rossi acclimatati a 25 ° C. Utilizzando la tecnica di colorazione differenziale tempo è stato dimostrato che, nel contesto di gill rimodellamento, pesci rossi mantenere un numero costante di CI ipossico durante l&#39;esposizione e il successivo recupero normossia, tuttavia, la percentuale di cellule innervati diminuito per tutto il periodo di recupero normossia 5. È stato proposto più di 70 anni fa, che meccanismi di assorbimento ionici nei pesci sono sotto controllo neurale 12. La branchia teleosteo è innervato dalle facciale (VII), glossofaringeo (IX) e vago (X) nervi di cui anche le &quot;nervi branchiali&quot; 13,14. Gli studi di Jonz e Nurse (2003) su zebrafish (Danio rerio) branchia innervazione hanno mostrato che l&#39;origine di innervazione è estrinseca (corpo cellulare di fibre nervose è estrinseco alla branchia) e intrinseca (corpo cellulare difibre nervose è intrinseca alla branchia). Gli stessi autori hanno anche dimostrato che IC branchiali sono estrinsecamente innervate 7. In questo studio, il tempo di tecnica di colorazione differenziale accoppiato con piena branchia denervazione bilaterale è stato utilizzato per studiare la proliferazione di circuiti integrati privi innervazione estrinseca in pesci rossi. Pieno branchia denervazione bilaterali si riferisce a recidere nervi cranici IX e X. Questi due approcci sono realizzabili in pesci rossi perché la loro dimensioni relativamente grandi (30-200 g) semplifica le procedure chirurgiche delicate, e ionocytes sono facilmente identificabili con tecniche immunoistochimiche standard. Nel presente studio, CI sono state visualizzate utilizzando un colorante vitale specifico mitocondrio (ad esempio, MitoTracker rosso) o un anticorpo primario contro la α-subunità della Na + / K + -ATPasi (α-5; Developmental Studies Ibridoma Bank, Università di Iowa, Iowa City IA). Questo protocollo fornisce un meto sempliced di visualizzare e analizzare la ridistribuzione e la proliferazione di CI a branchia di pesce.

<table><tbody><tr><td>MitoTracker Red</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma Alrdich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-5 primary antibody</td><td>Develompental Hybridoma Bank</td><td>a5</td><td></td></tr><tr><td>zn12 primary antibody</td><td>Develompental Hybridoma Bank</td><td>zn12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (anti mouse)</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Sigma Alrdich</td><td>E1501</td><td>4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate</td></tr><tr><td>Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>straight</td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11001-12</td><td>curved</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Tissue retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17009-07</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Alrdich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma Alrdich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish

Ionocytes branchiali (CI) sono le unità funzionali per la regolamentazione ionico nei pesci. Negli adulti, si trovano sul filamental e epiteli lamellare della branchia dove essi ioni di trasporto come Na +, Cl - e Ca 2+ attraverso una varietà di canali ionici, pompe e scambiatori. La branchia teleosteo è estrinsecamente innervato dal viso (VI), glossofaringeo (IX) e vago (X) nervi. I nervi IX e X sono anche la fonte estrinseca di branchiali IC innervazione. Qui, due tecniche usate per studiare l&#39;innervazione, la proliferazione e la distribuzione di IC sono descritti: un tempo tecnica di colorazione differenziale e una completa tecnica bilaterale gill denervazione. Brevemente, pesci rossi sono esposti ad un colorante specifico mitocondrio vitale (es MitoTracker Red) che etichette (fluorescenza rossa) CI preesistenti. I pesci sono stati sia permesso di recuperare per 3 - 5 giorni immediatamente sottoposti ad un completo branchia denervazione bilaterale. Dopo 3 - 5 giorni di recupero, il gmali vengono raccolti e fissati per immunoistochimica. Il tessuto viene quindi colorato con un anticorpo primario α-5 (obiettivi Na + / K + ATPasi contenente cellule) in combinazione con un anticorpo secondario che etichetta tutti (sia nuove che preesistenti) CI verde. Utilizzando confocale, è stato dimostrato che CI preesistenti appaiono giallo (contrassegnato con sia un colorante specifico mitocondrio vitale e α-5) e nuove CI appaiono verde (marcato con solo α-5). Entrambe le tecniche utilizzate in tandem può essere applicato per studiare l&#39;innervazione, la proliferazione e la distribuzione di IC sul filamento branchie quando i pesci sono esposti alle sfide ambientali.

La figura 1 illustra il tavolo operatorio configurare (Figura 1A), il posizionamento del pesce durante l&#39;intervento chirurgico (Figura 1B) e le tre fasi più importanti per il tempo tecnica di colorazione differenziale (Figura 1C). Nel passaggio 1, il pesce viene mantenuta per 30 minuti in un bagno d&#39;acqua ben aerato a 25 ° C al buio. Durante il periodo di 30 min, il ricercatore può preparare il colorante aliquota ricco mitocondrio in DMSO che viene aggiunto all&#39;acqua durante Fase 2 (Figura 1C). Il periodo di incubazione nella Fase 2 consente per l&#39;assorbimento del colorante ricco mitocondrio dall&#39;acqua nelle cellule ricche di mitocondrio (cioè, CI). Il pesce può quindi essere sottoposti alla procedura completa bilaterale denervazione o di una procedura simulata in cui il pesce viene anestetizzato e la opercoli manipolato, ma i nervi rimangono intatti. Il set up al punto 3 rappresenta una camera di recupero dotata di acqua corrente per un pesce che ha either subito le completa denervazione bilaterale o una procedura di &quot;farsa&quot;. Dopo il periodo di recupero, il pesce era eutanasia e le branchie sono stati asportato e fissato per immunoistochimica. La distribuzione complessiva e innervazione di IC sul filamento branchie di un pesce che aveva subito una procedura di &quot;sham&quot; è mostrata in Figura 2. I circuiti integrati sono presenti sul epiteli filamental nonché alla base delle regioni interlamellari. Spettacoli Figura 2A Circuiti integrati preesistenti marcati con ricchi mitocondrio dye (cioè, questi circuiti integrati esistevano prima sono state eseguite le procedure di denervazione / sham). La figura 2B mostra fibre nervose che innervano i circuiti integrati pre-esistenti e di nuova costituzione (identificato da NKA immunoreattività) del filamental e epiteli lamellare. Infine, la fusione delle due immagini (Figura 2C) rivela chiaramente i circuiti integrati preesistenti (colore giallo) e dei nuovi circuiti integrati (appaiono in verde).La figura 2D è un grafico rappresentante IC quantificazione per il filamento illustrato nella Figura 2A-C. Su questo filamento specifica, sembrano essere un numero maggiore di CI appena proliferato per mm 2 rispetto CI preesistenti (N = 1). Per rimuovere la fonte di innervazione estrinseca branchiale, i nervi cranici IX e X (innervazione estrinseca) sono stati interrotti. La figura 3A mostra la regione dorsale della cavità opercolare dopo i filamenti branchiali e gli epiteli che coprono i nervi sono stati rimossi per esporre il IX e X nervi cranici (indicati con numeri romani), che spaziano da due grandi tronchi nervosi a innervano i quattro archi (Figura 3A); gli archi branchiali sono numerati da 1 a 4. Figura 3B-E illustrare denervazione selettiva del primo arco branchiale. Il primo arco gill è innervato da entrambi i IX e X nervi cranici (Figura 3B) che possono essere rimosse senza influenzare l&#39;innervazione al resto of archi branchiali (Figura 3C-E). Risultati completi denervazione bilaterali in graduale perdita di innervazione estrinseca ai filamenti branchiali (Figure 4A-C). Pesci controllo presentano un fascio nervoso evidente che attraversa la lunghezza del filamento (Figura 4A). Denervazione bilaterale completa provocato una perdita di innervazione estrinseca dopo 2 giorni di recupero (Figura 4B). Ulteriore scomparsa di innervazione estrinseca è stato notato dopo 5 giorni di recupero da denervazione (Figura 4C). Qualsiasi residuo innervazione di circuiti integrati dopo 5 giorni di recupero presumibilmente è stato derivato dal nervi con corpi cellulari all&#39;interno del filamento branchia (innervazione intrinseca; Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. sperimentale impostato per la procedura di denervazione e la sequenza di passi utilizzati nellatempo tecnica di colorazione differenziale. (A) tabella di Chirurgia istituito per la procedura di denervazione mostrare i serbatoi anestetici e di recupero. (B) Esempio di posizionamento di un anestetizzato, pesce intubato. (C) passaggi chiave dell&#39;atto tempo tecnica di colorazione differenziale. Nel passaggio 1, il pesce è posto in modo controllato, statica bagnomaria aerata temperatura per 30 min. Il colorante ricco-mitocondrio viene aggiunto al punto 2 per una concentrazione finale di 0,1 micron e il pesce è permesso fare il bagno nella soluzione per un minimo di 4 ore. Il flusso dell&#39;acqua è riavviato al punto 3 il punto in cui il pesce subisce sia una completa denervazione bilaterale branchia o un intervento chirurgico farsa. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg" width="600"<html> /&gt; Figura 2. micrografie luce rappresentano il tempo tecnica di colorazione differenziale in un dorato (acclimatati a 25 ° C) 2 giorni dopo denervazione completa bilaterale. (A) La distribuzione dei ionocytes preesistenti (CI, frecce). Su un singolo filamento branchia è rivelato da ricchi-mitocondrio dye colorazione (B) La distribuzione dei circuiti integrati (nuovi e preesistenti) e branchiali nervi (frecce tratteggiate) viene rivelata da colorazione con anticorpi α-5-zn e 12, rispettivamente. Le frecce indicano circuiti integrati (C) La sovrapposizione di (A) e (B) distingue IC preesistenti. (Di colore giallo; indicati da frecce) da circuiti integrati di nuova proliferato (appare verde, indicati dalle frecce). Inserire in (C) è un ingrandimento di un preesistente ionocyte innervati. (D) grafico rappresentante IC quantificazione per il filamento mostrato in pannelli (AC). N bar = 1. Scala a pannello (C) è di 50 micron e si applica a tutti i pannelli./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Immagini rappresentative descrivono le varie fasi della innervazione branchia. Vista (A) dorsale della cavità buccale che mostra i nervi cranici IX e X innervano tutti i 4 archi branchiali. Archi branchiali sono numerati 1-4. I filamenti branchiali e il tessuto che copre i nervi sono stati rimossi per visualizzare meglio l&#39;innervazione. (B) Il 1 ° e 2 ° archi branchiali sono separati per rivelare l&#39;organo sensoriale ei rami dei nervi cranici IX e X innervano il 1 ° branchia arch. (CE) Sequenza di immagini che mostrano la denervazione selettiva del 1 ° arco branchiale tagliando i rami dei nervi cranici IX e X. Per un re schematicopresentazione di branchia innervazione di pesci teleostei, fare riferimento alla Figura 1 a Milsom et al 26 Le linee bianche nelle immagini sono acqua di riflessione dalle luci microscopio.; non definiscono alcuna struttura morfologica. Bar Scala a pannello (E) è di 4 mm e si applica a tutti i pannelli. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4. Micrografie luce raffiguranti la distribuzione e innervazione di ionocytes su un singolo filamento del 1 ° branchia arco di un pesce rosso acclimatati a 25 ° C. Ionocytes (indicato da punte di freccia) sono state colorate con la α-5 anticorpi e nervi (indicata bfrecce y) sono state colorate con l&#39;anticorpo zn-12. (A) Gill filamento di un pesce di controllo che mostra un fascio nervoso centrale presumibilmente provenienti dai nervi IX e X (innervazione estrinseca) con una vasta ramificazione lamellare. Alcuni dei ionocytes indicati sono anche innervati (insert). (B) A branchia filamento 2 giorni dopo il pieno denervazione bilaterale. C&#39;è stata una riduzione del fascio nervoso centrale, mentre l&#39;innervazione lamellare è apparso in gran parte intatta. (C) A branchia filamento 5 giorni dopo completa denervazione bilaterale dimostrando che innervazione estrinseca era in gran parte assente. Analisi qualitativa suggerisce che completa denervazione bilaterale provoca la degradazione della innervazione estrinseca branchia mantenendo i nervi con corpi cellulari all&#39;interno del filamento branchia (innervazione intrinseca) la creazione di una rete di nervi attraverso il filamento e nella lamelle. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" target="_blank">Si prega</a>clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.

Una tecnica Tempo colorazione differenziale Accoppiato con Full bilaterale Gill Denervation per studiare Ionocytes in Pesci

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the ...

a-time-differential-staining-technique-coupled-with-full-bilateral

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Views.  University of Ottawa. This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation. 

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Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Alzando la Tetra messicano Astyanax mexicanus per analisi di Post-larval fenotipi e Immunohistochemistry intero-monta

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Ricerca

Genetica

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp Misure di capacità e Ca 2 + Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

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Neuroscienze

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

La registrazione dell&#39;attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo &#946;-Cell Function

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in &#946;-cell function are associated with hyperglycemia that can lead to diabetes. During the process of insulin secretion, &#946;-cells experience an influx of Ca2+. Thus, imaging the glucose-stimulated Ca2+ influx using genetically encoded calcium indicators (GECIs) provides an avenue to studying &#946;-cell function. Previously, studies showed that isolated zebrafish islets expressing GCaMP6s exhibit significant Ca2+ activity upon stimulation with defined glucose concentrations. However, it is paramount to study how &#946;-cells respond to glucose not in isolation, but in their native environment, where they are systemically connected, vascularized, and densely innervated. To this end, the study leveraged the optical transparency of the zebrafish larvae at early stages of development to illuminate &#946;-cell activity in vivo. Here, a detailed protocol for Ca2+ imaging and glucose stimulation to investigate &#946;-cell function in vivo is presented. This technique allows to monitor the coordinated Ca2+ dynamics in &#946;-cells with single-cell resolution. Additionally, this method can be applied to work with any injectable solution such as small molecules or peptides. Altogether, the protocol illustrates the potential of the zebrafish model to investigate islet coordination in vivo and to characterize how environmental and genetic components might affect &#946;-cell function.

Here, the study presents a protocol for calcium imaging and glucose stimulation of the pancreatic &#946;-cells of the zebrafish in vivo.

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in ...

Biologia dello sviluppo

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Registrazione neuronale attività Temperatura indotta attraverso il monitoraggio dei cambiamenti di calcio nel bulbo olfattivo di<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

Etichettatura dei vasi sanguigni nel cervello teleost e pituitario utilizzando la perfusione cardiaca con un DiI-fissativo

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Bioingegneria

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the clear majority have been performed on dissociated primary cells. To improve our understanding of how teleost pituitary cells, behave in a more biologically relevant environment, this protocol shows how to prepare viable brain-pituitary slices using the small freshwater fish medaka (Oryzias latipes). Making the brain-pituitary slices, pH and osmolality of all solutions were adjusted to values found in body fluids of freshwater fish living at 25 to 28 &#176;C. Following slice preparation, the protocol demonstrates how to conduct electrophysiological recordings using the perforated whole-cell patch-clamp technique. The patch-clamp technique is a powerful tool with unprecedented temporal resolution and sensitivity, allowing investigation of electrical properties from intact whole cells down to single ion channels. Perforated patch is unique in that it keeps the intracellular environment intact preventing regulatory elements in the cytosol from being diluted by the patch pipette electrode solution. In contrast, when performing traditional whole-cell recordings, it was observed that medaka pituitary cells quickly lose their ability to fire action potentials. Among the various perforation techniques available, this protocol demonstrates how to achieve perforation of the patched membrane using the fungicide Amphotericin B.

The article describes an optimized protocol for making viable brain-pituitary tissue slices, using the teleost fish medaka (Oryzias latipes), followed by electrophysiological recordings of pituitary cells using the patch-clamp technique with the perforated patch configuration.

Fette di cervello-ipofisi sane per le indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in pesci teleostei

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Biologia

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

Imaging ottico basato su fotodiodi per la registrazione di dinamiche di rete con risoluzione a singolo neurone in invertebrati non transgenici

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Una tecnica Tempo colorazione differenziale Accoppiato con Full bilaterale Gill Denervation per studiare Ionocytes in Pesci

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Alzando la Tetra messicano Astyanax mexicanus per analisi di Post-larval fenotipi e Immunohistochemistry intero-monta

Patch-clamp Misure di capacità e Ca^{2 +} Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

La registrazione dell'attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo β-Cell Function

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

Registrazione neuronale attività Temperatura indotta attraverso il monitoraggio dei cambiamenti di calcio nel bulbo olfattivo di

Etichettatura dei vasi sanguigni nel cervello teleost e pituitario utilizzando la perfusione cardiaca con un DiI-fissativo

Fette di cervello-ipofisi sane per le indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in pesci teleostei

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Imaging ottico basato su fotodiodi per la registrazione di dinamiche di rete con risoluzione a singolo neurone in invertebrati non transgenici