Name: determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)
Uploaded: 2015-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
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We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

1. Generazione e convalida delle Chimere proteina fluorescente <ol><li> Append proteina fluorescente verde (GFP) alla ammino o carbossile termini della proteina di interesse utilizzando strategie di DNA ricombinante standard di 13. NOTA: Anche se abbiamo utilizzato ampiamente GFP, altre varianti come la proteina ciano fluorescente (PCP), proteina fluorescente gialla (YFP), DsRed e mCherry possono essere impiegati. Miglioramenti in fluoroforo pieghevole efficienza, luminosità e fotostabilità vengono costantemente effettuati, e gli investigatori devono avvalersi dei costrutti di ultima generazione. <ol><li> Confermare sequenza di DNA corretta e assicurarsi che la frazione GFP è in cornice con la proteina di interesse. Eseguire sequenziamento utilizzando strategie di DNA ricombinante normali 21. NOTA: Molte istituzioni hanno servizi DNA di base, che il ricercatore è incoraggiato a contattarci per ulteriori informazioni. </li><li> Per proteine ​​di membrana passaggio singole o doppie, generareentrambe le versioni terminali ammino- e carbossilici delle proteine ​​di fusione 19. </li><li> Per le proteine ​​di multi-spanning inserire GFP all&#39;interno di cicli extramembrane putativi, così come il termini. Prestare particolare attenzione quando si generano chimere transmembrana con la proteina di fusione fluorescenti attaccato al capolinea amino della proteina bersaglio come sequenze di segnali sono spesso spaccati dalla proteolisi una volta che la proteina è passato attraverso il translocon ER. </li><li> Nel caso di sequenze di segnali esistenti, inserire la proteina di fusione fluorescenti distale al sito di scissione in modo da generare una proteina matura contenente una proteina fluorescente tag intatto ammino-terminale. Impiegare strategie DNA ricombinante standard per la generazione di chimere 21. </li></ol></li><li> Determinare la presenza del segnale fluorescente sufficienti opportunamente localizzata nella linea cellulare di interesse. <ol><li> Osservare le cellule sotto epifluorescenza utilizzando la fluorescenza intrinseca di GFP sotto ademangiato condizioni di filtro impostato. Per set di filtri GFP che comprendono 510-560 nm, confermano che i filtri corretti sono utilizzati per il fluoroforo impiegato. NOTA: Un segnale sufficiente si ottiene quando la valutazione ad occhio fornisce un segnale abbastanza forte che la struttura cellulare all&#39;interno della quale risiede il segnale viene facilmente risolto sopra sfondo. Inoltre il pattern di colorazione della proteina-GFP deve essere coerente con quello dei marcatori per la organello appropriata, e preferibilmente identica a quella della proteina nativa non etichettato. </li></ol></li><li> Determinare se un approccio stabile o transiente trasfezione sarà utilizzato basa la proteina in corso di valutazione. NOTA: trasfettanti stabili generalmente offrono bassi livelli di espressione rispetto ai sistemi transitori. Sebbene espressione transiente produce espressione elevato livello di proteine ​​e aumento dell&#39;intensità di segnale (~ 5-24 ore dopo la trasfezione seconda proteina), può anche portare ad artefatti iperespressione come proteine ​​aggregation o la saturazione di proteine ​​di targeting percorsi, portando a localizzazione subcellulare erronea. </li></ol> 2. Trasfezione delle cellule e colture cellulari NOTA: Una varietà di cellule sono suscettibili di analisi FPP, tra cui HEK293, HeLa, COS-7 e cellule CHO 14. La seguente descrizione è basata su esprimenti proteine ​​di membrana in cellule HEK293. <ol><li> Grow cellule umane embrionali renali (HEK293) come monostrati aderenti a 6 ml di Dulbecco modificato (DMEM), integrato con siero 5% fetale bovino (FBS), 1% piruvato di sodio, e 250 mg / ml di penicillina / streptomicina a 37 ° C con il 5% di CO 2. Eseguire il lavoro con le cellule in coltura tissutale cappa a flusso laminare. Grow cellule in mezzo di coltura fino ~ 80% confluenti in un pallone T-75. </li><li> Cellule trasfettare utilizzando qualsiasi alta efficienza standard metodo trasfezione bassa tossicità, compresi lipid-, tecnologie viral- o basati elettroporazione, per generare transient o espressione stabile. Tipicamente 2 mg di plasmide DNA per 1 x 10 6 cellule dà buona espressione proteica riproducibili. Mantenere cellule per 5-48 ore in appropriate terreni di coltura tissutale a 37 ° C in un CO 2 in grado di coltura tissutale incubatore. </li><li> Monitorare le cellule per l&#39;espressione della proteina GFP-fusion con epifluorescenza, utilizzando il segnale di fluorescenza intrinseca di GFP, utilizzando appositi set di filtri secondo il protocollo del produttore. Segnale di fluorescenza di solito raggiunge un massimo entro 24-72 ore dopo trasfezione. Utilizzare cellule quando il segnale di fluorescenza raggiunge un livello massimo. Monitorare i livelli di espressione della proteina mediante analisi immunoblot utilizzando anticorpi diretti contro la proteina o di interesse o porzione GFP. </li><li> Per le celle sperimentali piastra analisi su vetrini rivestiti. Visualizza sia sotto una configurazione live-cell o dopo la fissazione e montare su vetrini microscopia. Cellule piastra per raggiungere il 60% -80% di confluenza entro 24-48 ore. <ol><li> Coprioggetto Coat con la soluzione di poli-lisina (0,1 mg / ml), in modo che l&#39;intera superficie è coperta. Incubare per 30 minuti sotto una luce ultravioletta a temperatura ambiente, seguito da 60 minuti in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C. Rimuovere l&#39;eccesso poli-lisina e lavare i coprioggetti in PBS 3 volte. </li><li> In alternativa, piastra le cellule su una copertura in vetro a camera composta da piastre di coltura cellulare con un fondo di vetro ottico per consentire l&#39;imaging diretto con obiettivi ad immersione in olio. La configurazione effettiva microscopia dipende apparecchiature disponibili al ricercatore, ma dovrebbe essere in grado di soluzione cambia rapidi. A seconda della forma tipo di cellula e cellula, cellule dovrebbe essere circa 60-90% confluenti al momento del dosaggio FPP. </li></ol></li></ol> Setup 3. microscopia a fluorescenza <ol><li> Utilizzare una apertura numerica (NA) dell&#39;obiettivo alta ad immersione in olio per la raccolta del segnale massima e risoluzione spaziale, come ad esempio un 60X, 1,42 NA obiettivo ad immersione. Usa the dopo il laser per stimolare i fluorofori: gas Argon 488 nm (GFP e YFP) e 561 diodo (RFP, mCherry). </li><li> Determinare l&#39;esposizione, il guadagno e la cattura tasso ottimale di immagini per ogni costrutto. Regolare intensità del laser e tempo di esposizione per minimizzare photobleaching (vedi punto 7.1.2). </li><li> Per gli studi che utilizzano più fluorofori (ad esempio, un marker solubile per permeabilizzazione della membrana in concerto con un pennarello proteina di membrana), scegliere filtro appropriato imposta per ridurre al minimo segnale di cross-talk e massimizzare rapporti segnale-rumore. </li></ol> 4. Stabilire le condizioni ottimali per membrana plasmatica Permeabilization <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura di cellule da cellule che esprimono solo proteine ​​fluorescenti solubili (es EGFP, DsRed). Lavare le cellule 3 volte (1 min ciascuno) in tampone KHM (110 mM potassio acetato, 3 mM MgCl 2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Effettuare esperimenti con cellule e tutti i reagenti a temperatura ambiente. </li><li> Luogo cellule on coprioggetto (vedi punto 2.4) in tampone KHM su un palco microscopio a fluorescenza e raccolgono la prima immagine, che rappresenta il controllo &#39;non-permeabilizzate&#39; stage. </li><li> Per permeabilize selettivamente la membrana plasmatica, aggiungere digitonina (30 mM) in tampone KHM alle cellule. Profumato cellule con tampone (buffer + digitonina) ad una velocità di 5 ml / min per 10-60 sec. </li><li> Determinare la concentrazione ottimale digitonina aumentando gradualmente la concentrazione di digitonina. La concentrazione digitonina ottimale si ottiene quando vi è perdita completa del segnale di fluorescenza da EGFP solubile entro 10-60 secondi di applicazione digitonina. Per molte cellule applicazione di 10-50 mM digitonina è sufficiente permeabilize membrana cellulare. <ol><li> Per tutte le applicazioni utilizzano la concentrazione più bassa possibile di digitonina. Raccogliere le immagini dopo digitonina permeabilizzazione per permeabilizzate segnale di fondo. </li></ol></li><li> Verificare che la chimera GFP-proteina di interesse è membranategrated confermando ritenzione cellulare del segnale di fluorescenza seguente permeabilizzazione digitonina della membrana plasmatica 16. <ol><li> Esprimere una proteina fluorescente organello specifico 23. Proteine ​​mitocondriali funzionano bene in questo senso 16, ad esempio, pDsRed2-Mito vettoriale. Determinare le condizioni ottimali di espressione come descritto al punto 2.1. </li><li> Verificare che la concentrazione digitonina è appropriato per il tipo cellulare impiegato assicurando che la morfologia di organelli intracellulari rimane costante nel prolungato (fino a 60 min) esposizione a digitonina. NOTA: utilizzare protocolli standard di immunofluorescenza con anticorpi contro vari compartimenti cellulari, come lisosomi (es LAMPADA1), Golgi (ad esempio, TGN38), reticolo endoplasmatico (ad esempio, calnexina), endosomi (ad esempio, Rab5), mitocondri (ad esempio, citocromo c). Se organelli intracellulari modifiche morfologia / integrità drammaticamente over 60 min, è probabile che la concentrazione digitonina era troppo alta, e richiede una riduzione della concentrazione digitonina e / o tempo di esposizione. NOTA: Digitonin è tossico per inalazione e contatto con la pelle. Indossare appropriati dispositivi di protezione individuale (DPI). </li></ol></li></ol> 5. Protease Trattamento di proteine ​​fluorescenti <ol><li> Lavare le cellule in tampone KHM e quindi aggiungere proteasi (proteasi K; 50 mg / ml in tampone KHM) direttamente sulle celle. Profumato cellule ad una velocità di flusso di 5 ml / min usando un sistema di perfusione a gravità alimentata alla vasca continuamente la preparazione. <ol><li> Soluzioni negozio in 50 ml siringhe e tubi di polietilene collegati serbatoi indipendenti ad un collettore con una singola presa al bagno (portata 5 ml / min). Posizionare una pipetta di aspirazione per mantenere una (0,5 ml) Volume vasca costante e conseguire scambio soluzione commutare manualmente i serbatoi di perfusione. </li></ol></li><li> Raccogliere immagini per determinare se il fluorSegnale escent persiste o si degrada. Una perdita di&gt; 90% dell&#39;intensità del segnale iniziale tramite 30-60 sec è coerente con la degradazione proteolitica della chimera GFP-proteina (vedi Risultati rappresentativi). </li><li> Se nessuna degradazione del segnale si osserva con proteinasi K, quando si prevede tale perdita, sostituire la soluzione di proteinasi K con tripsina (4-8 mM) in tampone KHM. Se necessario, utilizzare una miscela di proteinasi K e tripsina. Non vi è alcuna necessità di spegnere l&#39;attività della proteasi. </li></ol> 6. Approccio per plasma proteine ​​di membrana con domini esterni Alternative <ol><li> Per proteine ​​di membrana plasmatica, eseguire il test per le proteine ​​fluorescenti esterni chimere prima di digitonina permeabilizzazione. Lavare le cellule su vetrini in tampone KHM (5 ml / min x 3 min), e prendere una immagine per il trattamento pre-proteasi e quantificare segnale di fluorescenza pre-proteasi come al punto 7. </li><li> Esporre le cellule di proteasi (proteinasi K; 50 mg / ml o tripsina 4-8 mm in tampone KHM) in tha assenza di digitonina mediante perfusione le cellule con KHM supporto contenente proteasi (portata 5 ml / min). Raccogliere immagini della proteina fluorescente, per determinare quanto velocemente il segnale scompare e per quanto tempo il segnale persiste. </li><li> Prima permeabilizzazione digitonina, spegnere tutte le attività della proteasi, lavando le cellule tre volte (1 min ciascuno) in mezzi di coltura cellulare contenente siero 10% (FBS). </li><li> Lavare le cellule mediante perfusione con tampone KHM (velocità di flusso di 5 ml / min) per 2 min. Acquisire un&#39;immagine pre-permeabilizzazione. Permeabilize la membrana cellulare, come descritto al punto 4. </li><li> Raccogliere le immagini seguenti proteasi Inoltre, come descritto al punto 5. </li></ol> Analisi 7. Immagine <ol><li> Utilizzare un microscopio invertito in grado di &quot;cellule vive&quot; di registrazione, in cui la perdita del segnale di fluorescenza può essere monitorato in tempo reale. Per il monitoraggio continuo, impiegare parametri identici (tempo di esposizione, il guadagno, intensità laser, ecc). <ol><li> Determinare experparametri imental osservando il segnale di fluorescenza dalla GFP-proteina di interesse in condizioni di controllo (ad esempio, KBH tampone da solo). Regolare le impostazioni di tempo guadagno, intensità di esposizione laser e sul microscopio computer guidato per garantire che non vi è alcuna perdita apprezzabile di intensità del segnale in un periodo di 10-20 minuti. NOTA: intensità del segnale non è un valore assoluto, ma si basa sul sistema microscopio e impostazioni disponibili per ciascun PI. Monitorare i cambiamenti di intensità di fluorescenza relativa. </li></ol></li><li> In alternativa, il trattamento di cellule a set punti temporali in digitonina seguito da proteasi, e fissare le cellule prima del montaggio su vetrini per l&#39;imaging. Determinare punti di tempo a seguito empiricamente procedure nei passaggi 4 e 5. Per l&#39;indagine iniziale, partono da 0, 30, 60, 120 e 300 sec dopo aggiunta di digitonina o proteasi. <ol><li> Fissare cellule (20 min a temperatura ambiente) con una quantità sufficiente di fissativo (3,7% paraformaldeide in PBS) per immergere completamente thcellule e. </li><li> Quench paraformaldeide residua sciacquando cellule con PBS contenente glicina 20 mm (3 x 5 min). </li><li> Mount coprioggetto rimuovendo il liquido in eccesso dal vetrino e invertendo il vetrino su un supporto di montaggio 50 microlitri su un microscopio Vetrini per l&#39;imaging. Lasciare i vetrini si asciughino durante la notte prima di imaging. </li></ol></li><li> Raccogliere immagini al microscopio a fluorescenza (sotto i filtri appropriati imposta compatibile con il fluoroforo utilizzato) utilizzando la funzione di cattura dell&#39;immagine video su un microscopio a fluorescenza computer controllato. </li><li> Quantificare intensità di segnale fluorescente in funzione della condizione di incubazione. Ottenere l&#39;intensità dei pixel media all&#39;interno di una regione di interesse (ROI) che racchiude una singola cella. </li></ol>

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The authors declare no conflict of interest.

L&#39;orientamento e la topologia corretta delle proteine ​​di membrana è essenziale per il loro corretto funzionamento. Nonostante l&#39;importanza di comprendere la topologia proteina di membrana, ci sono molte proteine ​​per i quali i dati sono del tutto carenti. FPP fornisce un modo semplice ed efficace per determinare topologia proteina di membrana, e uno che può essere eseguita dalla maggior parte dei laboratori. L&#39;approccio FPP offre vantaggi significativi rispetto ai metodi precedenti per la determ...

Le membrane plasmatiche, nonché numerose membrane intracellulari, servono come barriere che separano due compartimenti acquosi. Nel caso della membrana plasmatica, la separazione è tra l&#39;esterno e l&#39;interno della cella; per organelli intracellulari che è tra il citoplasma e il lume organelli. Ad esempio, la membrana del reticolo endoplasmatico (ER) separa un ambiente ossidante all&#39;interno del lume del ER da un citosolico riducendo ambiente 1. Le proteine ​​di membrana sono sintetizzate sui ribosomi ER-associata, e raggiungere il loro topologia finale entro la membrana ER 2. L&#39;acquisizione di un adeguato orientamento membrane e topologia per le proteine ​​è fondamentale per la loro normale funzione. Topologia corretta permette pertinenti domini di proteine ​​di membrana per interagire con i partner di legame, permette critici modificazioni post-traduzionali a verificarsi, e nel caso delle proteine ​​di membrana di plasma, permette alla cellula di interagire con e rispondere to suo ambiente. Per apprezzare appieno la funzione di una proteina di membrana, è chiaramente indispensabile sapere come tale proteina è orientato rispetto alla membrana entro cui risiede, cioè la sua topologia membrana. Oltre alla acquisizione di conoscenze scientifiche di base, comprendere la topologia di una proteina di membrana e quali aspetti di una superficie proteine ​​sono esposte ad ambienti differenti ha segnato implicazioni cliniche poiché proteine ​​di membrana sono la maggioranza dei bersagli farmacologici 3. Fino a poco tempo, approcci per determinare la topologia di proteine ​​di membrana hanno richiesto un notevole investimento di tempo e di denaro o hanno richiesto reagenti che sono difficili da trovare. Sia approcci sperimentali e in silico sono stati impiegati per determinare la topologia di proteine ​​di membrana che risiedono all&#39;interno della membrana plasmatica. Dal momento che le prime previsioni di domini di membrana attraversa basati sulla idrofobicità valutato di indiviaminoacidi doppio 3, numerosi algoritmi predittivi sono ora disponibili su internet, e semplicemente richiedono la conoscenza della sequenza aminoacidica della proteina. Tuttavia, le ipotesi sono spesso al centro di tali programmi di modellazione, ipotesi che possono portare alle assegnazioni errate di topologia 4,5. Inoltre, mentre le previsioni basate su computer è possibile assegnare provvisoriamente le regioni che vanno a membrana, che non sempre determinano se la amino o carbossi-terminale di proteine ​​sono nel citoplasma, lume organelli o esterno cella. Anche con maggiore potenza di calcolo, e l&#39;uso di algoritmi di apprendimento macchina 6, tali dati è ancora un modello, e deve essere convalidato utilizzando i dati acquisiti sperimentalmente. Determinazione diretta sperimentale di topologia di membrana è stata effettuata utilizzando pannelli di anticorpi monoclonali con epitopi noti distribuite in tutta la proteina, in cui è stata effettuata la valutazione della loro immunoreattività prima e dopo permeabilizzazione cellulare. Questoapproccio richiede una serie di anticorpi, che non possono essere disponibili per la proteina di interesse. Una strategia alternativa è quella di progettare etichette epitopi quali myc o emoagglutinina (HA) in varie località in tutta la proteina, ancora una volta seguita da determinazione della immunoreattività prima e dopo permeabilizzazione della membrana. Oltre ai tag immunogenico, tag enzimatici (compresi fosfatasi alcalina, β-galattosidasi, o β-lattamasi) e modificazioni chimiche come la scansione cisteina sono stati tutti impiegati per determinare membrana proteica topologia 7,8. Un ulteriore metodo impiegato per la mappatura topologica delle proteine ​​di membrana plasmatica si basa su un approccio leggermente diverso per tag epitopi. In questo metodo la sequenza di tag è la sequenza di consenso glicosilazione N-linked NXS / T. Poiché glicosilazione avviene solo quando tale sequenza è presente nel lume della via biosintetica, la presenza del tag in un luminale controun compartimento citosolico è facile osservare come spostamento di massa su gel SDS-PAGE. Tale approccio è stato applicato al canale ionico multispanning CFTR 9. Mentre tutti questi approcci sono stati utilizzati, è chiaro che tutti richiedono notevoli investimenti nel campo della biologia molecolare per generare e la sequenza dei costrutti molteplici. Per determinare le informazioni topologiche riguardanti proteine ​​transmembrana situati all&#39;interno organelli intracellulari ha dimostrato di essere più impegnativo. L&#39;applicazione di tecnologie basate fluorescenza tuttavia, ha fatto la determinazione della topologia di membrana molto più semplice. La tecnica di bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) si basa sulla interazione tra due frammenti non fluorescenti di una proteina fluorescente, ripristinando le proprietà fluorescenti di quella proteina 10. Sebbene inizialmente descritto per determinare le interazioni proteina-proteina in vivo 10, questo approccio è anche stato utilizzatoper determinare membrana proteica topologia nelle cellule vegetali 11. Tuttavia questo approccio è anche tempo intenso in quanto richiede la generazione non solo di proteine ​​di fusione con la proteina di interesse, ma anche una varietà di proteine ​​di fusione mirati al citosol o organelli lume, e richiede la cui conoscenza intracellulare membrane proteina di interesse risiede in . Un approccio alternativo alla semplice determinazione topologia proteina di membrana è stato descritto 12. Il saggio di fluorescenza proteasi protezione (FPP) richiede la generazione di una proteina di fusione tra GFP e il gene di interesse. L&#39;approccio è basato sulla relativa accessibilità di proteasi non specifici per la frazione GFP; a seconda che GFP è protetto dalla proteolisi risiedendo nel lume di organelli intracellulari o è esposto alla proteolisi essendo presenti nel citosol. Pertanto, se la frazione GFP sulla proteina di interesse affaccia citoplasma, sarà esposto aattività proteasica e il segnale di fluorescenza persi. Al contrario, se la frazione GFP sulla proteina di interesse affaccia un ambiente &#39;protetto&#39; dalla proteasi (come il lume Golgi) allora il segnale di fluorescenza persisterà. Per consentire proteasi di entrare nella cellula, ma non immettere compartimenti intracellulari membrana farmaco vincolante colesterolo digitonina viene utilizzato. Il colesterolo è sterolo dominante in vertebrati, ed è specificamente arricchito nella membrana plasmatica rispetto al compartimenti intracellulari. La tossina glicoside, digitonina, viene estratto dalla pianta Digitalis purpurea. Digitonin ha un&#39;affinità per colesterolo ricchi membrane, dove si porta a membrana selettiva permeabiliztion 14,16 (figura 1). Oltre a consentire l&#39;uscita dei piccoli componenti citosolici, permeabilizzazione digitonina permette anche l&#39;ingresso di molecole esogene quali proteinasi K o tripsina. Il protocollo FPP sfrutta il fact che la membrana plasmatica contiene fino al 80% del colesterolo cellulari 17, mentre altri organelli, come ER, Golgi, endosomi, i mitocondri, che hanno molto basso contenuto di colesterolo, rimangono intatti 14. L&#39;incorporazione selettiva di colesterolo nella membrana plasmatica è stata osservata in molte cellule eucariotiche, permettendo l&#39;uso di digitonina-dipendente permeabilizzazione della membrana plasmatica in tali diverse specie eucariotica come S. cerevisiae di umana 14,18. Il dosaggio FPP fornisce un mezzo semplice, rapido e abbastanza robusti di determinazione (a) se una proteina è legato alla membrana / o associati liberamente diffusibile nel citosol e (b) che dominio di una proteina di membrana affronta citosol o organelli lumen. Qualora una proteina di membrana avere più orientamenti, il segnale sorgerà dalla forma dominante e non verrà rilevato forme minori. Mentre ci può essere qualche preoccupazione che l&#39;aggiunta di una frazione GFP alla proteina di interesse può influire sulla sua funzione e/ O localizzazione subcellulare, questo è in realtà più teorica che reale. Infatti molti studi hanno chiaramente dimostrato che il tag GFP non altera le proprietà della proteina 19,20.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 Golgi</td><td>Clontech</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Dako</td><td>cS704</td><td></td></tr></tbody></table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Plasma permeabilizzazione della membrana Efficient permeabilizzazione della membrana plasmatica è determinato mediante l&#39;uso di proteine ​​fluorescenti solubili (ad esempio, GFP, DsRed) (Passaggio 4). Queste proteine, quando espresso in cellule, sono liberi di diffondere nel citosol, e vengono persi quando la membrana plasmatica è permeabilizzate con digitonina (Figura 2). Una completa scomparsa del segnale fluorescente dovrebbe avvenire entro 10-...

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Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.7K Views.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

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Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies against specific peptides within the predicted sequence allow some localization experiments. However, other possible interactions with the antibodies often cannot be excluded. This situation provided an opportunity to develop a set of assays dependent on the protein sequence. Specifically, a construct containing the gene sequence coupled to the GFP coding sequence at the C-terminal end of the protein was obtained and employed for these purposes. Experiments to characterize localization, ligand affinity, and gain of function were originally designed and carried out to confirm the identification of TMEM184A as a heparin receptor1. In addition, the construct can be employed for studies addressing membrane topology questions and detailed protein-ligand interactions. The present report presents a range of experimental protocols based on the GFP-TMEM184A construct expressed in vascular cells that could easily be adapted for other novel proteins.

A construct encoding TMEM184A with a GFP tag at the carboxy-terminus designed for eukaryotic expression, was employed in assays designed to confirm the identification of TMEM184A as a heparin receptor in vascular cells.

Utilizzando un TMEM184A GFP-tagged Construct per la conferma della Eparina Receptor Identità

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Ricerca

Genetica

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biochimica

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine ​​di membrana<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Bioingegneria

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Uso delle proteine di fusione ricombinante in una piattaforma di analisi fluorescente proteasi e loro rinaturalizzazione In-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

Valutazione rapida della qualità delle proteine di membrana mediante cromatografia fluorescente di esclusione dimensionale

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine ​​di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Biologia

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Proteine ​​di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine ​​solubili e insolubili In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A Technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins upon Detergent Solubilization

Source: Bird, L. E., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52357">Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli</a>. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate a fluorescence-detection size-exclusion chromatography technique to screen for green fluorescent protein (GFP)-fused membrane protein stability in Escherichia coli following detergent solubilization. Proteins exhibiting a symmetrical peak in the size-exclusion profile with little or no free GFP indicate purified proteins with minimum degradation and aggregation, which can subsequently be selected for structure-function analysis.

Cromatografia ad esclusione dimensionale con rilevamento a fluorescenza: una tecnica per identificare l'integrità delle proteine di membrana fluorescenti dopo solubilizzazione con detergente

Source: Bird, L. E., et al. Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)
In this ...

Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Utilizzando un TMEM184A GFP-tagged Construct per la conferma della Eparina Receptor Identità

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine di membrana

Uso delle proteine di fusione ricombinante in una piattaforma di analisi fluorescente proteasi e loro rinaturalizzazione In-gel

Valutazione rapida della qualità delle proteine di membrana mediante cromatografia fluorescente di esclusione dimensionale

Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

Proteine di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine solubili e insolubili In vitro

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine di membrana in

Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins

Cromatografia ad esclusione dimensionale con rilevamento a fluorescenza: una tecnica per identificare l'integrità delle proteine di membrana fluorescenti dopo solubilizzazione con detergente

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Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine ​​di membrana

Uso delle proteine di fusione ricombinante in una piattaforma di analisi fluorescente proteasi e loro rinaturalizzazione In-gel

Valutazione rapida della qualità delle proteine di membrana mediante cromatografia fluorescente di esclusione dimensionale

Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine ​​di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

Proteine ​​di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine ​​solubili e insolubili In vitro

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Cromatografia ad esclusione dimensionale con rilevamento a fluorescenza: una tecnica per identificare l'integrità delle proteine di membrana fluorescenti dopo solubilizzazione con detergente

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Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine di membrana

Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

Proteine di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine solubili e insolubili In vitro

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