The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

1. Preparazione di strumenti, Substrati, Culture Media e Piatti <ol><li> Gestione delle finestre nitruro di silicio (Si 3 N 4). <ol><li> Aprire la capsula leggermente spremitura un&#39;estremità contenente la finestra in modo tale da non comprimere finestra stessa, ruotando l&#39;altra estremità della capsula con l&#39;altra mano. </li><li> Controllare un paio di inversione, pinzette dalla punta sottile sotto stereomicroscopio per assicurarsi che non ci siano adesivi, lacune o curve sulla punta. In caso contrario, le finestre possono essere rotti dalle pinzette o il distacco di loro durante le fasi successive. </li><li> Rimuovere la finestra dalla capsula afferrando attentamente il telaio della finestra con una pinzetta, mentre delicatamente comprimendo la capsula in prossimità dell&#39;estremità aperta esercitando una pressione in una direzione in modo da rendere la capsula più ampio in cui i bordi della finestra devono venire fuori. </li></ol></li><li> Finestra pre-lavaggio (optional). <ol><li> Se lo si desidera, le finestre di prelavaggio per immersione delicatamentein acqua distillata per 5 sec, seguito da 2 minuti di lavaggio in 70% di etanolo e 2 min lavaggio in 100% di etanolo. </li></ol></li><li> L&#39;apposizione e sterilizzazione finestre sul piatto cultura. <ol><li> Per fissare le finestre, impostare la finestra con lato piatto fino al fondo del piatto di coltura, posizionare un pezzo di nastro su un vetrino pulito. Tagliare su una striscia di quarto di pollice giù per il lato lungo del nastro. Prendete una fetta di nastro largo del lato corto (a ⅛ &quot;da ¾&quot;) con una lama di rasoio pulito. </li><li> Utilizzare pinzette per applicare la fetta di nastro al bordo della griglia o finestra. Usare abbastanza per aderire saldamente senza coprire l&#39;apertura della finestra stessa. Manipolando il nastro aderito con pinzette, impostare il finestrino sul fondo del piatto di coltura. Utilizzare la punta delle pinzette di aderire il nastro al fondo del piatto cultura saldamente. </li><li> Applicare un&#39;altra striscia di nastro per l&#39;altro bordo e rispettare questo al fondo saldamente con la punta delle pinzette. </li><li> Una volta che tutte le finestre sonoregistrato, sterilizzare finestre in piastre di coltura con raggi ultravioletti (UV). Realizzare questo mettendo il piatto sotto la lampada UV in una cappa a flusso laminare per circa 1 ora. </li><li> (Facoltativo) Se le finestre devono essere pre-rivestito con poli-lisina, farlo seguente finestra di sterilizzazione. Rivestire la finestra con 10 ml di soluzione sterile 0,01% poli-L-lisina per 1 ora a 37 ° C incubatore, e poi sciacquare la soluzione rimanente via con il mezzo di coltura. </li></ol></li><li> Preparare buffer per lavaggio finale prima XFM. <ol><li> Preparare sia un Tris-glucosio o piperazine- N, N &#39;-bis (acido etansolfonico) (TUBI) -sucrose tampone privo di eventuali tracce di metalli con osmolalità e pH pari al tampone fosfato salino di Dulbecco (D-PBS) senza calcio e magnesio. Utilizzare uno di questi buffer per risciacquare celle dopo cellule vengono fissate chimicamente. <ol><li> Per rendere la soluzione Tris-glucosio (Tris 10 mM, glucosio 260 mM, 9 mM acido acetico,) aggiungere 1,4 g di glucosio, 36 mg di base Tris e16 ml di acido acetico e 20 ml di acqua ultrapura. Poi, regolare il volume finale di 30 ml con acqua ultrapura. Non è necessaria alcuna regolazione del pH. Conservare a temperatura ambiente fino a una settimana. </li><li> Per rendere i TUBI-saccarosio (20 TUBI mM, saccarosio 200 mm) aggiungono 0,18 g di tubi e 2,0 g di saccarosio a 20 ml di acqua ultrapura e regolare il pH a 7,4 con piccole quantità di acido acetico concentrato. Poi, regolare il volume finale di 30 ml con acqua ultrapura. Conservare a temperatura ambiente fino a una settimana. NOTA: La ragione per evitare di utilizzare PBS nel risciacquo finale è che le concentrazioni di fosfato, cloruro e potassio in PBS sono così alti che può interferire con XFM se non viene completamente rimosso prima essiccazione all&#39;aria. </li></ol></li></ol></li><li> Preparare buffer per la placcatura cellulare. <ol><li> Preparare o estrarre tutti i media, come ad esempio RPMI medio 1640, 1x soluzione tripsina-EDTA, D-PBS, e tutti gli altri reagenti come necessario per la particolare linea cellulare aderente come normalmente fatto per passaging le cellule aderenti ointeressi f, e riscaldare a 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. placcatura di Celle <ol><li> Per piatto di coltura sterilizzato contenente le finestre, nella cappa a flusso laminare, aggiungere delicatamente supporti (10 ml per un piatto di coltura 100 mm), lungo il lato del piatto cultura con esso inclinato ad un angolo. Evitare di creare tensione superficiale inutili o cadere supporto direttamente sulla superficie delle finestre nitruro di silicio. Come si aggiunge supporto, lentamente alleviare l&#39;angolo di inclinazione per rivestire la griglia e la finestra con i media. </li><li> Preparare la linea cellulare aderenti di interesse appropriato, trypsinizing o raschiare le cellule fuori delle piastre come al solito per passaging la linea cellulare. Eseguire una conta cellulare, o altra preparazione necessaria prima di applicare le cellule alla piastra fresca. </li><li> Aggiungere cellule al piatto cultura con finestre ad una densità cellulare che è necessaria per raggiungere tipicamente il 50% -70% di confluenza entro 24-72 ore, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di anidride carbonica. </li&gt; <li> Osservare la crescita delle cellule occasionalmente, utilizzando un microscopio ottico invertito, fino alla densità cellulare desiderata (di solito 50% -70% di confluenza) è raggiunto. </li></ol> 3. Fissazione delle cellule <ol><li> Preparare freschi 4% paraformaldeide in D-PBS diluendo uno stock acquistato (ad esempio 25% paraformaldeide) e regolando il pH a 7,4 con acido acetico (per evitare l&#39;aggiunta di eccesso di sodio al campione). </li><li> Quando le cellule sono state coltivate come desiderato, e le macchie vitali (come Hoescht) sono stati applicati e ripreso, rimuovere il supporto aspirando delicatamente, inclinando il piatto in un angolo di 45 ° con una mano, e l&#39;aspirazione con una pipetta con l&#39;altra mano . NOTA: Invece di pipettaggio impiegato mezzi, l&#39;alternativa è quella di scegliere la finestra in alto, immergere la finestra in microprovette con D-PBS due volte e poi metterlo in una nuova imbarcazione cultura con soluzioni fissativo per 20 minuti seguito da 2 tempi di lavaggio PBS per rimuovere i residui fissativi. Se questo viene scelto, andare directly al punto 3.5. </li><li> Lavare il piatto delicatamente con D-PBS e sostituire immediatamente il liquido rimosso aggiungendo delicatamente il fresco 4% PFA / PBS tenendo il piatto con un angolo di 45 °, pipettaggio verso il lato del piatto, e lentamente rilassante l&#39;angolo di inclinazione per consentire la soluzione fissativa per coprire le finestre. Conservare le celle coperte con il fissativo per 20 minuti a RT. </li><li> Rimuovere il liquido mediante aspirazione delicata, ancora come sopra, inclinando leggermente il piatto ed aspirando a mano. </li><li> Sostituire il liquido rimosso aggiungendo delicatamente alcuni dei tubi / soluzione di saccarosio, con il metodo di inclinazione e pipettaggio descritto nel passaggio 3.3. </li><li> Ripetere i punti 3.4 e 3.5. </li><li> Preparare i materiali per l&#39;essiccazione. <ol><li> Raccogliere asciugamani privo di lanugine, come Kimwipes, e tirare uno fuori dalla scatola, quindi è a portata di mano molto rapidamente e facilmente. </li><li> Preparare un luogo non-pulita e in piano per impostare la finestra per asciugare. Impostare su una stuoia griglia gomma del tipo usato in microscopia elettronica, che ha così crestela finestra può essere appoggiato su un&#39;estremità mentre si asciuga. Ciò manterrà la finestra di rimanere bloccati alla superficie di essiccazione come si asciuga, e drenare qualsiasi buffer residuo al bordo del campione. </li></ol></li><li> Tweeze cautela il nastro collegata alla finestra per tenere la finestra fuori dal liquido. Recuperare le finestre che si staccano del nastro, applicando una piccola quantità di TUBI / saccarosio per farli galleggiare e poi raccogliere con le pinzette inversa. </li><li> Cautela (senza toccare la finestra stessa) e accuratamente daub qualsiasi eccesso TUBI / saccarosio dal bordo della finestra con un Kimwipe. Daub Anche la parte posteriore zona frastagliata con una piega arrotondata di un Kimwipe. NOTA: L&#39;obiettivo è di avere meno cristallizzazione di sali o buffer sulla superficie della finestra possibile. </li><li> Collocare la finestra sul tappeto griglia. Assicurarsi che la finestra non è disteso sul tappeto griglia, ma appoggiato su un bordo (con le creste del tappeto griglia) e toccando il meno della grigliamat possibile. Lasciare la finestra di asciutto. </li></ol> 4. Montaggio del campione e Imaging <ol><li> Una volta che il campione è essiccato, verificare la presenza di cellule sulle finestre utilizzando un microscopio ottico. Eseguire questa verifica, prima di preparare i campioni per il trasporto di un sincrotrone. </li><li> Pacchetto le finestre per il trasporto alla linea di luce di sincrotrone di hosting l&#39;esperimento. Apporre delicatamente le finestre con nastro su due lati di un vetrino, poi fissare il vetrino con nastro sul fondo di una piastra di Petri di plastica. Nastro il piatto chiusa Petri. NOTA: Prima di questo punto, la procedura può essere eseguita in qualsiasi laboratorio tipico. Le seguenti operazioni dovrebbero essere meglio fatto a una linea di luce di sincrotrone. </li><li> Rimuovere il nastro dalla finestra delicatamente con una pinzetta. Utilizzare smalto, in un sottile strato uniforme lungo il bordo della finestra, per fissare le finestre al possessore di alluminio fornito dai collaboratori beamline del sincrotrone. </li><li> Inserire il supporto di alluminio inuna cinematica di montaggio, e poi posto in posizione al microscopio a raggi X. Montare il campione su una staffa di collegamento alla fasi motorizzati, all&#39;interno della camera campione alla linea di luce. </li><li> Dopo essere usciti dalla radiografia zona strumento microscopio campione (una gabbia fatta di muri di piombo pieno), impostare la scansione. Utilizzando il software specifico linea di luce, selezionare la zona appropriata del campione da esaminare, mentre si visualizza la posizione del fascio di raggi X sul campione utilizzando una macchina fotografica dotata di un video mirino e pre-allineata con una fotocamera scintillatore valle. </li><li> Scegliere la risoluzione appropriata per il campione, sulla base di una stima della dimensione della funzione più piccolo di interesse. Per l&#39;imaging singole cellule di mammifero (~ 20-40 micron di dimensione), utilizzare una risoluzione di 0,25-0,5 micron. Per le zone di tessuti di imaging, e distinguendo strati cellulari tra loro, utilizzare una risoluzione di 2-20 micron. </li><li> Scegliere il tempo di permanenza adeguato per il campione, in base alla stima della quantità del riunitoal di interesse presenti. Per una scansione rapida panoramica, o se sono presenti elevate quantità di metalli, utilizzare scansioni Vola con tempi di sosta di 30-300 msec per pixel. Se poco materiale è presente, o per misurare i metalli di bassa abbondanza relativa, utilizzare scansioni passo con tempi di sosta di 1-2 sec per pixel. </li><li> Programmare le scansioni nel software specifico per linea di luce. Acquisire un&#39;immagine raster-scan. Lavorare insieme con i collaboratori linea di luce per analizzare i dati con il software che identificheranno i caratteristici picchi di energia per ogni elemento. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

X-ray imaging di fluorescenza è utile in molti campi, tra cui geoscienze, scienza dei materiali e biologia chimica 26-34. Advances in raggi X di sincrotrone, e la loro messa a fuoco, hanno prodotto molto fasci ad alta intensità. Focused X-ray travi sufficiente per eccitare i metalli endogeni nelle cellule ora esistono, segnale che può essere misurata con la tecnologia attualmente disponibile rivelatore al silicio deriva produzione. E studio della biologia chimica di metalli nella cella è un&#39;applicazio...

X-ray fluorescenza consente sia l&#39;identità e la quantità di elementi presenti in un campione da spazialmente risolto. Incidente raggi X, di una energia selezionata per essere maggiore dell&#39;energia dell&#39;elemento più pesante di interesse vincolante elettroni, superare l&#39;energia di legame degli elettroni interno-shell al nucleo 1. Questo crea un &#39;buco&#39; nel guscio di elettroni. Come elettroni ad alta energia cadono in questi fori, raggi X fluorescenti sono emessi cui lunghezza d&#39;onda dipende dalla separazione dell&#39;energia di tali orbitali. Poiché la spaziatura energia degli orbitali è caratteristica di un dato elemento, l&#39;emissione di fluorescenza a raggi X ha anche lunghezze d&#39;onda caratteristiche, dipendenti sull&#39;elemento. È questa emissione alla lunghezza d&#39;onda caratteristica che permette l&#39;identificazione degli elementi presenti. Calibrazione dell&#39;intensità di fluorescenza permette quantificazione degli elementi presenti. Fluorescenza a raggi X microscopy (XFM) è diventato sempre più utilizzato, in parte a causa dello sviluppo di fonti di sincrotrone a raggi X molto brillanti, come quelle in Primavera-8 in Giappone, l&#39;europeo di radiazione di sincrotrone (ESRF) in Francia, e l&#39;Advanced Photon Source ( APS) negli Stati Uniti 2. Queste fonti forniscono altissima intensità fasci di raggi X. Allo stesso tempo, il miglioramento ottica a raggi X, come la tecnologia zone plate, permesso la messa a fuoco di questi fasci a macchie sub-micron, anche se piuttosto inefficiente 3. Con molto fasci ad alta intensità, anche una quantità relativamente piccola di luce che può essere messo a fuoco è sufficiente per eccitare i metalli endogeni nelle cellule, producendo segnale che può essere misurata con la tecnologia attualmente disponibile rivelatore. Pertanto, lo studio della biologia chimica di metalli nella cella è un&#39;applicazione in particolare, che fa uso di molti dei recenti sviluppi in questa tecnica 4-10. Ci sono molti fattori critici da considerare durante la appmentire XFM per indagare la distribuzione elementare e la quantificazione di cellule di mammifero in coltura o altri campioni biologici. In primo luogo, il campione deve essere mantenuto integro, sia strutturalmente e rispetto alla sua composizione elementare, affinché la misura sia significativo. In secondo luogo, il campione deve essere conservato in qualche modo in modo che sia resistente al danno di radiazione che può essere causato da un fascio di raggi X focalizzato. Un modo che un campione può soddisfare entrambi i criteri contemporaneamente deve essere rapidamente congelati in un vetrosa, ghiaccio amorfo 11,12. Congelamento rapido è spesso raggiunto attraverso varie tecniche di crioconservazione, come tuffo il congelamento o alta pressione congelamento 13-16. E &#39;generalmente accettato che la crioconservazione conserva architettura cellulare complessiva e composizioni chimiche in campioni biologici il più vicino possibile allo stato nativo. Fissaggio chimico, d&#39;altra parte, a causa della penetrazione lenta e selettiva di fissativi in ​​cellule e tessuti come well le successive variazioni di permeabilità della membrana, possono consentire vari ioni cellulari soprattutto gli ioni diffusibili come Cl, Ca e K per essere colati, perse o ricollocate, rendendo così investigazione di questi elementi non ottimali 17-19. Nonostante il chiaro vantaggio di crio-over fissaggio fissaggio chimica in generale, per le cellule di mammifero aderenti in particolare, crioconservazione ha varie limitazioni 20-23. La più ovvia è che non tutti i laboratori di ricerca ha un facile accesso agli strumenti di crioconservazione. La maggior parte dei congelatori alta pressione correnti o anche immergono congelatori sono costosi e di proprietà solo da un sottoinsieme di strutture cryo, che può essere lontano da dove vengono incubate cellule. Il vantaggio di crioconservazione potrebbe essere scambiato per lo svantaggio di stress viaggi collocato sulle cellule. Così, mentre crioconservazione è sicuramente il modo più rigoroso per conservare campioni per analisi a raggi X di fluorescenza, non è certamente la più accessibile a tutti i ricercatori in tutte le circostanze;né è sempre essenziale - se i metalli di interesse sono strettamente legati alle macromolecole fissabili, e la risoluzione con cui viene ripreso il campione è superiore al danneggiamento del ultra-microstruttura che potrebbero verificarsi durante l&#39;essiccazione. Memore dei caveat 24, fissaggio chimico e asciugatura può essere una scelta adatta. Altri fattori in un esperimento di imaging di fluorescenza a raggi X di successo includono l&#39;analisi corretta. X-ray imaging di fluorescenza è fondamentalmente spettroscopia di emissione di fluorescenza di raggi X in combinazione con raster-scanning per fornire la risoluzione spaziale. Gli spettri di emissione di fluorescenza a raggi X raccolti contengono una combinazione di sovrapposizione picchi di emissione, di fondo, e le cime di scattering elastico e anelastico del fascio incidente. Software che consente la de-convoluzione di questi contributi, e il montaggio dei picchi di emissione, è stato uno sviluppo critico per questo campo 25. Inoltre, lo sviluppo e dist commercialeribution di norme a film sottile di composizione nota, usata per calibrare intensità della fluorescenza rispetto alla quantità di materiale, è stato molto importante anche. Questo protocollo fornisce una descrizione della preparazione di cellule aderenti da fissazione chimica ed essiccamento all&#39;aria. Un passo fondamentale in questo processo è la crescita delle cellule alle finestre di nitruro di silicio, che spesso non aderiscono bene, rendendo dolce risciacquo in una particolare chiave di modo di successo.

<table><tbody><tr><td>Silicon nitride windows</td><td>Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td><td>SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200&amp;nbsp;nm. Frame size: 5&amp;nbsp;mm x 5 mm. Frame thickness: 200 &amp;micro;m.</td><td>Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.</td></tr><tr><td>Reverse tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>78520-5X</td><td>EMS 5X, NC &amp;ndash; Ultra Fine Tweezers</td></tr><tr><td>Rubber grid mat</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>71170</td><td>Round Grid Mat</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>338826</td><td>trace metals grade concentrated acetic acid</td></tr><tr><td>PIPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>P6757</td><td>solid PIPES buffer</td></tr><tr><td>Formaldehyde stock solution</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>RT 17113</td><td>10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td></tr></tbody></table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

La capacità dell&#39;imaging fluorescenza a raggi X per fornire informazioni sui campioni biologici è subordinato questi campioni essere preparati in modo tale che essi sono robusti alle radiazioni sulla scala temporale dell&#39;esperimento, e tuttavia la loro caratteristiche chimiche e strutturali sono ben conservato. Nella visualizzazione del risultato di un campione che è stato preparato come sopra descritto e illustrato, è possibile vedere che c&#39;è variazione degli elementi presenti - indica che la fissazion...

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Preparazione cellule aderenti per X-ray Fluorescence Imaging da Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

preparing-adherent-cells-for-x-ray-fluorescence-imaging-chemical

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.4K Views.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

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In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. They offer new possibilities for the characterization of living systems and are particularly appropriate for detecting, localizing and quantifying the presence of metal oxide nanoparticles both in biological specimens and the environment. Indeed, these techniques all meet relevant requirements in terms of (i) sensitivity (from 1 up to 10 &#181;g.g-1 of dry mass), (ii) micrometer range spatial resolution, and (iii) multi-element detection. Given these characteristics, microbeam chemical element imaging can powerfully complement routine imaging techniques such as optical and fluorescence microscopy. This protocol describes how to perform a nuclear microprobe analysis on cultured cells (U2OS) exposed to titanium dioxide nanoparticles. Cells must grow on and be exposed directly in a specially designed sample holder used on the optical microscope and in the nuclear microprobe analysis stages. Plunge-freeze cryogenic fixation of the samples preserves both the cellular organization and the chemical element distribution. Simultaneous nuclear microprobe analysis (scanning transmission ion microscopy, Rutherford backscattering spectrometry and particle induced X-ray emission) performed on the sample provides information about the cellular density, the local distribution of the chemical elements, as well as the cellular content of nanoparticles. There is a growing need for such analytical tools within biology, especially in the emerging context of Nanotoxicology and Nanomedicine for which our comprehension of the interactions between nanoparticles and biological samples must be deepened. In particular, as nuclear microprobe analysis does not require nanoparticles to be labelled, nanoparticle abundances are quantifiable down to the individual cell level in a cell population, independently of their surface state.

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

We describe a procedure for the detection of chemical elements present in situ in human cells as well as their in vitro quantification. The method is well-suited to any cell type and is particularly useful for quantitative chemical analyses in single cells following in vitro metal oxide nanoparticles exposure.

In Situ Rilevazione e quantificazione di singola cellula delle nanoparticelle di ossido di metallo mediante analisi della microsonda del nucleare

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Ricerca

Chimica

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

Elaborazione della coltura embrionale, del guscio d'uovo e fungina per la microscopia elettronica a scansione

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Ambiente

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. These cell lines, after treatment with ascorbic acid (AA) and &#946;-glycerophosphate (&#946;-GP), undergo complete osteogenic transdifferentiation from proliferation to mineralization and produce matrix vesicles (MVs) that trigger apatite nucleation in the extracellular matrix (ECM).
Based on Alizarin Red-S (AR-S) staining and analysis of the composition of minerals in cell lysates using ultraviolet (UV) light or in vesicles using TEM imaging followed by EDX quantitation and ion mapping, we can infer that osteosarcoma Saos-2 and osteoblastic hFOB 1.19 cells reveal distinct mineralization profiles. Saos-2 cells mineralize more efficiently than hFOB 1.19 cells and produce larger mineral deposits that are not visible under UV light but are similar to hydroxyapatite (HA) in that they have more Ca and F substitutions.
The results obtained using these techniques allow us to conclude that the process of mineralization differs depending on the cell type. We propose that, at the cellular level, the origin and properties of vesicles predetermine the type of minerals.

We present a protocol to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. Their mineralization profiles were analyzed by Alizarin Red-S (AR-S) staining, ultraviolet (UV) light visualization, transmission electron microscopy (TEM) imaging and energy dispersive X-ray microanalysis (EDX).

Analisi di minerali prodotto da hFOB 1.19 e Saos-2 cellule mediante microscopia elettronica a trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions and their disturbed homeostasis is involved in various diseases. State-of-the-art synchrotron X-ray fluorescence nanoprobes provide the required sensitivity and spatial resolution to elucidate the two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) distribution and concentration of metals inside entire cells at the organelle level. This opens new exciting scientific fields of investigation on the role of metals in the physiopathology of the cell. The cellular preparation is a key and often complex procedure, particularly for basic analysis. Although X-ray fluorescence techniques are now widespread and various preparation methods have been used, very few studies have investigated the preservation of the elemental content of cells at best, and no stepwise detailed protocol for the cryopreparation of adherent cells for X-ray fluorescence nanoprobes has been released so far. This is a description of a protocol that provides the stepwise cellular preparation for fast cryofixation to enable synchrotron X-ray fluorescence nano-analysis of cells in a frozen hydrated state when a cryogenic environment and transfer is available. In case nano-analysis has to be performed at room temperature, an additional procedure for freeze-drying the cryofixed adherent cellular preparation is provided. The proposed protocols have been successfully used in previous works, most recently in studying the 2D and 3D intracellular distribution of an organometallic compound in breast cancer cells.

Presented here is a protocol for cell culture on silicon nitride membranes and plunge-freezing prior to X-ray fluorescence imaging with a synchrotron cryogenic X-ray nanoprobe. When only room temperature nano-analysis is provided, the frozen samples can be further freeze-dried. These are critical steps to obtain information on the intracellular elemental composition.

Coltura cellulare sulle membrane di nitride di silicio e criopreparazione per la fluorescenza a raggi X del sincrotrone Nano-analisi

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Biochimica

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Bioingegneria

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

Inclusione in paraffina e sezionamento sottile di biofilm di colonie microbiche per l'analisi al microscopio

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Immunologia e infezioni

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, an abundant supply of AAAs is important for cancer cells to maintain their rapid growth and division. With this, there is a rising demand for a highly specific, noninvasive imaging approach with minimal sample preparation to directly visualize how cells harness AAAs for their metabolism in situ. Here, we develop an optical imaging platform that combines deuterium oxide (D2O) probing with stimulated Raman scattering (DO-SRS) and integrates DO-SRS with two-photon excitation fluorescence (2PEF) into a single microscope to directly visualize the metabolic activities of HeLa cells under AAA regulation. Collectively, the DO-SRS platform provides high spatial resolution and specificity of newly synthesized proteins and lipids in single HeLa cell units. In addition, the 2PEF modality can detect autofluorescence signals of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin in a label-free manner. The imaging system described here is compatible with both in vitro and in vivo models, which is flexible for various experiments. The general workflow of this protocol includes cell culture, culture media preparation, cell synchronization, cell fixation, and sample imaging with DO-SRS and 2PEF modalities.

We present a protocol to directly visualize metabolic activities in cells regulated by amino acids using deuterium-oxide (heavy water D2O) probed stimulated Raman scattering (DO-SRS) microscopy, which is integrated with two-photon excitation fluorescence microscopy (2PEF).

Imaging chimico bioortogonale del metabolismo cellulare regolato da amminoacidi aromatici

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Biologia

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Una descrizione cartografica 3D della cellula mediante tomografia a raggi X Cryo Soft

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

Preparazione del campione mediante fresatura a fascio ionico focalizzato correlativo 3D per la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...