Questo lavoro è stato supportato da NSF carriera premio 1553023 e premio NIH/NIAID R01AI103369.

1. crescita di Pseudomonas aeruginosa Colonia biofilm
<ol><li>Preparazione delle piastre Medium-Bilayer<ol>
<li>Preparare un tryptone di 10 g/L, agar 10 g/L (Vedi Tabella materiali) soluzione in acqua deionizzata.</li>
		<li>Autoclave per raffreddare a 50-60 ° C per 20 min. in un bagno d'acqua.</li>
		<li>Versare 45 mL della soluzione di agar-tryptone in un piatto quadrato 100 x 100 mm (Vedi Tabella materiali) utilizzando una provetta conica da 50 mL. Consentire l'agar solidificare (~ 20-30 min). Versare un secondo strato sopra strato prima 15 mL. Lasciare solidificare durante la notte, rimozione di condensazione da coperchi se necessario strofinando con un panno privo di lanugine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spotting Colonia biofilm<ol>
<li>Inoculare i ceppi di interesse dalle scorte di congelatore sul LB agar piastre13 ed incubare al buio per 12-16 h a 37 ° C e 80-100% di umidità relativa.</li>
		<li>Per ogni ceppo o replicate, è possibile utilizzare una singola Colonia per inoculare 2 mL di LB e incubare al buio per 12-16 h a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min.</li>
		<li>Sub-cultura diluendo 1: 100 in LB fresco e incubare al buio per 2.5-3 h a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min.</li>
		<li>Misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro e regolare con LB sterile per ottenere una sospensione di cellule con un OD500 nm ~ 0,5.</li>
		<li>A seconda della Colonia desiderata taglia, dispensare 2.5-10 µ l di sospensione cellulare su un piatto di mezzo-doppio strato (preparato al punto 1.1) e consentire il posto ad asciugare per ~ 20 minuti lasciando il coperchio petri socchiusa vicino a fiamme può facilitare asciugarsi.</li>
		<li>Incubare il campione colonie a 25 ° C e 80-100% di umidità relativa, al buio fino a 4 giorni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione della soluzione fissante
<ol><li>Preparare la soluzione fissante il giorno della raccolta del campione. Diluire il 37% di formaldeide (FA) in PBS 1X a una concentrazione finale del 4% FA. Attenzione: FA è volatile e tossico. Indossare indumenti protettivi e lavorare in una cappa ben ventilata.</li>
	<li>Immediatamente prima dell'uso, sciogliere L-lisina cloridrato in 4% FA (preparata al punto 2.1) a temperatura ambiente per una concentrazione finale di 50 millimetri L-Lisina HCl.</li>
</ol>3. diretta applicazione di fissativo per il Biofilm di Colonia [opzionale]
Nota: Abbiamo trovato che la morfologia di biofilm è meglio conservato quando agar molle viene aggiunto prima della fissazione. Tuttavia, questo passaggio costituisce anche un cambiamento delle condizioni ambientali che potrebbero influenzare l'espressione genica. Modelli di espressione di reporter fluorescente dovrebbero quindi essere verificati utilizzando un protocollo separato in cui il punto di fissazione è effettuato prima dell'aggiunta della sovrapposizione agar, come descritto qui.
<ol><li>Il giorno della fissazione e lavorando in una cappa ben ventilata, dispensare il fissativo preparato al punto 2 direttamente alla superficie dell'agar intorno a bordo della Colonia, permettendo così di raggiungere la periferia della Colonia senza sommergendola. Applicare solo come molto fissativo come è necessario completamente circondano la Colonia, circa 500 µ l. consentire il fissativo diffondere in Colonia e l'agar circostante.</li>
	<li>Una volta che il fissativo è stato completamente assorbito nella Colonia e mezzo circostante, circa 20-30 min, e FA residua non è più visibile sulla piastra, ripetere il punto 3.1. Permettere questo fissativo diffondere in Colonia e l'agar circostante.</li>
	<li>Una volta che il fissativo è stata completamente assorbito nella Colonia e mezzo circostante ripetizione passaggio 3.1, questa volta l'applicazione fissativo alla superficie della Colonia direttamente. Permettere questo fissativo diffondere in Colonia e l'agar circostante, procedere al passaggio 4 solo dopo tutto fissativo è stata assorbita e non è più visibile sulla piastra.</li>
</ol>4. overlaying colonie con Agar
<ol><li>Il giorno della fissazione, preparare un 10 g/L soluzione agar in acqua deionizzata e autoclave per 10-20 minuti sciogliere. Raffreddare a bagnomaria a 50 ˚ c.</li>
	<li>Delicatamente versare 15 mL della soluzione di agar sopra la coltura e la Colonia. Consentire l'agar formare un gel a temperatura ambiente per 5 min (Figura 1B).</li>
	<li>Usare una lama di rasoio affilata per tagliare un mandrino quadrato, 3 strati con la Colonia laminata tra i due strati superiori. Se preparare campioni multipli, assicurarsi che ciascun mandrino è tagliato a dimensioni comparabili.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente l'eccesso agar dal mandrino Colonia-contenente.</li>
	<li>Per estrarre i due strati superiori dell'agar (contenente la Colonia) dallo strato inferiore del mandrino (Figura 1), bagnare la testa piatta di una spatola in 1X PBS o acqua e inserire delicatamente tra gli strati superiore ed inferiore. La colonia di laminato deve separare dallo strato inferiore. Fare attenzione a non distorcere o piegare la Colonia laminata quando solleva dalla sua base.</li>
</ol>5. fissazione
<ol><li>Lavorando in una cappa ben ventilata, trasferire immediatamente la Colonia laminata (cioè, chuck 2 strati) in una cassetta incasso (Vedi Tabella materiali), etichettati con un pennarello resistente alle sostanze chimiche. Inserire la cassetta di incorporamento in un mailer di diapositive di vetro (Vedi tabella materiali) contenente il fissativo preparato nei passaggi 2.1-2.2. Assicurarsi che non ci sono nessun bolle d'aria intrappolate all'interno della cassetta incasso.</li>
	<li>Incubare il campione nel fissativo pernottamento in al buio a temperatura ambiente.</li>
</ol>6. campione di elaborazione: Tampone di lavaggio, disidratazione, schiarimento e infiltrazione
<ol><li>Dopo la fissazione durante la notte, lavare il campione due volte in PBS 1X per 1h ciascuna. Per risultati ottimali, automatizzare omogeneizzazione di reagente utilizzando lo spin funzione di un processatore automatico (Vedi tabella materiali) impostata su un'impostazione bassa. Se nessun processore è disponibile, il trattamento può essere eseguito manualmente.</li>
	<li>Seguire il tampone di lavaggio da disidratazione attraverso una serie graduata di diluizioni di etanolo (EtOH) in PBS 1X (25%, 50%, 70%, 95%) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Disidratare in tre lavaggi del 100% EtOH per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deselezionare il campione disidratato in tre lavaggi dell'agente arancione a base di olio schiarimento 100% (Vedi tabella materiali) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Si infiltra nell'esempio cancellato due volte con paraffina fusa cera (Vedi Tabella materiali), riscaldato a 55 ° c, per 2 h ogni.</li>
</ol>7. campione incorporamento
<ol><li>Riempire uno stampo di cera con cera di paraffina fusa riscaldata a 55 ˚ c. Utilizzare una spatola riscaldata, piatta per trasferire rapidamente il mandrino infiltrato dalla cassetta incasso nello stampo di cera, garantendo che il mandrino si riposa parallela alla base dello stampo. Evitare di applicare una pressione eccessiva sul mandrino. Stampi di cera possono essere personalizzati 3D stampato, o sono disponibili in commercio (vedere Tabella materiali).</li>
	<li>Consentire la cera di solidificare durante la notte a 4 ˚ c. Modellato in cera solida campioni possono essere conservati a tempo indeterminato a 4 ˚ c.</li>
	<li>Una volta che la cera si è solidificato, asportare il campione dallo stampo e tagliare la cera in eccesso da intorno al campione con una lama di rasoio. Lasciare la cera in eccesso che si estende da un'estremità del campione, parallelo al piano di taglio, che può essere utilizzato per il bloccaggio nel microtomo (Vedi Tabella materiali). Anche lasciare una guaina di cera, di circa 1 mm di spessore, intorno al campione e lisciare le sue facce.</li>
</ol>8. sezionamento
<ol><li>Riscaldare a bagnomaria a 42 ° c. Fissare il campione nel microtomo con la superficie della Colonia orientata perpendicolarmente al bordo della lama (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Sgrossare il campione a intervalli di 50 µm fino a quando è stato raggiunto il piano desiderato della Colonia, da cui sezioni saranno raccolti.</li>
	<li>Tagliare un nastro del numero desiderato di sezioni spesse 10-µm utilizzando un microtomo impostato una velocità di taglio di 75-80 giri/min e un angolo di spoglia inferiore di 6-10 ˚. Utilizzare un pennello a punta fine per staccare il nastro dalla lama.</li>
	<li>Utilizzando una goccia d'acqua sulla punta di una pipetta di Pasteur (preferito) o il forcipe, trasferire delicatamente il nastro nel bagnomaria. Fare attenzione a evitare bolle d'aria intrappolamento nella sezione.</li>
	<li>Immediatamente inserire una diapositiva nel bagno di acqua e posizionarla sotto la barra multifunzione a un angolo di 45 ˚.</li>
	<li>Toccare il bordo stretto del nastro per la diapositiva, appena sotto l'etichetta smerigliato. Il nastro deve aderire.</li>
	<li>Tirare la diapositiva dal bagno di acqua, regolazione dell'angolo di diventare perpendicolare alla superficie dell'acqua e consentendo la barra multifunzione per laici piatto contro lo scivolo lungo la sua lunghezza. Evitare di intrappolare l'acqua in eccesso sotto la barra multifunzione.</li>
	<li>Si levano in piedi delicatamente il vetrino su un panno privo di lanugine assorbente, traspirante acqua in eccesso dalla sezione.</li>
	<li>Porre il vetrino su un tovagliolo di carta e lasciare asciugare a temperatura ambiente durante la notte nel buio. Diapositive possono essere conservati a tempo indeterminato a 4 ° c al buio.</li>
</ol>9. calore-fissaggio, reidratazione e montaggio
<ol><li>Scaldare una piastra calda livellata a 45 ˚ c. Scaldare il vetrino per 30-60 min. La cera diventerà semi-fusa e appiattire contro la diapositiva.</li>
	<li>Delicatamente sollevare il vetrino dalla piastra scaldante e adagiarlo piatto su una superficie liscia, livellato, temperatura ambiente, facendo attenzione ad assicurare che la cera fusa non tirare su entrambi i lati della diapositiva, fino a quando la cera si solidifica (~ 1 min).</li>
	<li>Utilizzando un mailer di diapositive di vetro, de-cera diapositive in quattro lavaggi di compensazione agente per 5 minuti ciascuno, utilizzando un aspiratore di Büchner per rimuovere la soluzione tra i lavaggi.</li>
	<li>Lavare i vetrini tre volte in 100% EtOH per 1 min ciascuna.</li>
	<li>Reidratare le diapositive in una serie graduata di etanolo in ordine inverso di elaborazione (95%, 70%, 50% e 25%) per 1 min che ciascuna seguita da due 1-min lavaggi in PBS 1X.</li>
	<li>Montare immediatamente le sezioni in un mezzo di montaggio tamponata (Vedi Tabella materiali) e applicare un vetrino coprioggetti, evitando l'introduzione di bolle d'aria. Consentire il mezzo di montaggio a polimerizzare durante la notte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Una volta polimerizzato, sigillare il coprioggetto alla diapositiva utilizzando smalto trasparente. Sigillato vetrini possono essere conservati a tempo indeterminato al buio a 4 ° c.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-quantitative+approach+to+assess+biofilm+formation+using+wrinkled+colony+development.">A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development.</a> J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).</li><li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms.">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Campioni di tessuto di inclusione in paraffina e sottile-sezionamento è una tecnica istologica classica che permette l'imaging delle strutture micro-morfologica e viene comunemente utilizzata sui tessuti negli eucarioti è stata applicata con successo ai campioni microbici8 ,9. Mentre crioinclusione consente una forte ritenzione del segnale endogeno ed immunofluorescente, inclusione in paraffina è generalmente preferibile in quanto fornisce migliore conservazi...

Maggior parte dei microbi hanno la capacità di forma biofilm, comunità di cellule tenute insieme da matrici autoprodotti. I biofilm possono essere coltivati in molti tipi di configurazioni fisiche, con vari regimi di fornitura di nutrienti e substrato. Test specifici per la formazione di biofilm tendono a produrre strutture multicellulari riproducibile e architetture comuni sono osservate per specie filogeneticamente diversificata a livello macroscopico o comunità. Quando i microbi vengono coltivati come colonie su terreno solido sotto atmosfera, morfologia macroscopica trasmette informazioni sulla capacità per la produzione della matrice e spesso correla con altri tratti 1,2,3. L'architettura interna di colonie microbiche possa anche fornire indizi riguardo specifici del biofilm chimica e fisiologia, ma è stato difficile da caratterizzare. Recenti applicazioni delle tecniche di crioinclusione e cryosectioning di colonie batteriche hanno permesso la formazione immagine e la visualizzazione di specifiche caratteristiche a risoluzione senza precedenti 4,5,6. Tuttavia, studi con tessuto animale hanno dimostrato che inclusione in paraffina fornisce superiore conservazione della morfologia rispetto a crioinclusione 7 e viene utilizzato per visualizzare i batteri in tessuti 8,9. Abbiamo pertanto sviluppato un protocollo per la fissazione, inclusione in paraffina e sezionamento sottile di colonie microbiche biofilm. Qui, descriviamo la preparazione di Pseudomonas aeruginosa PA14 Colonia-biofilm sezioni sottili 10,11, ma abbiamo applicato con successo anche questa tecnica a biofilm formato dai batteri Synxantha Pseudomonas, Bacillus subtilis, e Vibrio cholerae12.
Il processo di inclusione in paraffina e sottile-sezionamento biofilm segue una logica semplice. In primo luogo, il biofilm sono racchiusi in uno strato di agar per preservare la morfologia durante l'elaborazione. In secondo luogo, il biofilm racchiusi sono sommerse in un fissativo di crosslink macromolecole e preservare micromorfologia. Questi sono poi disidratati con alcool, ha eliminati con un solvente non polare più e quindi infiltrati con cera di paraffina liquida. Una volta infiltrato, i campioni sono incorporati in mattoncini di cera per il sezionamento. Sezioni sono tagliati, montate su slitte e poi reidratati al fine di riportarli a uno stato più nativo. Da questo punto, possono essere macchiati o coperto in mezzo di montaggio per l'analisi al microscopio.
Questo protocollo produce sezioni sottili di biofilm microbici adatto per l'analisi istologica. Sottostrutture di biofilm di Colonia sono visibili quando sezioni sottili preparati utilizzando questo metodo sono immaginate da microscopia chiara. Biofilm possono essere anche coltivati sulle macchie fluorescenti contenenti supporti specifici per le singole funzionalità o macchiati nella fase di reidratazione, immediatamente prima del montaggio (passaggi 9.5-9.6). Infine, i microbi possono essere progettati per produrre proteine fluorescenti in modo costitutivo o regolamentato, permettendo in caso di segnalazione in situ di espressione di gene o distribuzione delle cellule all'interno di queste comunità. Abbiamo usato questi metodi per determinare la profondità di biofilm di Colonia, distribuzione delle cellule, distribuzione della tabella, modelli di crescita ed espressione genica spatiotemporal.

<table><tbody><tr><td>5 3/4&quot; Pasteur pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agar&amp;nbsp;</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Buchner Aspirator (Vacuum) Flask&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chemically-resistant Marking Pen</td><td>VWR</td><td>103051-182</td><td>Manufacturer: Leica</td></tr><tr><td>Clear Fingernail Polish&amp;nbsp;</td><td>********</td><td>********</td><td>Store bought</td></tr><tr><td>Congo Red Indicator Grade</td><td>VWR</td><td>AAAB24310-14</td><td>Manufacturer: Alfa Aesar</td></tr><tr><td>Coomassie Blue&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>EM-3340</td><td>Manufacturer: EMD Millipore</td></tr><tr><td>TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 247 04</td><td>Manufacturer: Electron Microscopy Sciences</td></tr><tr><td>Embedding Mold&amp;nbsp;</td><td>********</td><td>********</td><td>3D printed in-house</td></tr><tr><td>Embedding Mold (commercial)&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200P</td><td>Decon Labs, Inc.&amp;nbsp;</td><td>2701</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine-tipped Brush</td><td>********</td><td>********</td><td>Store bought, paint brush</td></tr><tr><td>Glass Coverslips 60x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-519-21C</td><td></td></tr><tr><td>Glass Rehydration Mailer&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>21043</td><td>20 slide mailer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histoclear-II, orange oil-based clearing agent&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 899 90150</td><td>Manufacturer: National Diagnostics&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histosette, Embedding Casette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 182 701A</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP386 100</td><td></td></tr><tr><td>Low Profile Microtome Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 210 048</td><td>Manufacturer: Sturkey&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipette&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89080-004</td><td>Promo-pack</td></tr><tr><td>Micropipette Tips&amp;nbsp;</td><td>See comments section</td><td>See comments section</td><td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td></tr><tr><td>Microtome&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>905200U/00016050</td><td>Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050</td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-500A</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Xtra (paraffin wax)</td><td>VWR</td><td>15159-486</td><td>Manufacturer: McCormick Scientific&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Petri Dishes Square 100x100x15mm</td><td>Laboratory Disposable Products&amp;nbsp;</td><td>D210-16</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals&amp;nbsp;</td><td>PX1405-1</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Potassium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P380-500</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Razor Blades&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Slide Warmer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0865259</td><td>NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D</td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9296.500</td><td>,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Suprafrost Histology Slides&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Flotation Water Bath&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0815797</td><td>Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B</td></tr><tr><td>Automatic Tissue Processor&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>813160U/Q#00009061</td><td>Model: STP120 Tissue Processor</td></tr><tr><td>Tryptone&amp;nbsp;</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>T9012</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>Y9010</td><td></td></tr></tbody></table>

paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis

Sezionamento tramite inclusione in paraffina è una tecnica ampiamente consolidata in sistemi eucariotici. Qui forniamo un metodo per la fissazione, l'incorporamento e sezionamento dei biofilm intatto di colonie microbiche utilizzando irrorato di cera di paraffina. Per adattare questo metodo per l'utilizzo su biofilm di Colonia, abbiamo sviluppato le tecniche per mantenere ciascun campione il suo substrato di crescita e di esso di laminazione con un strato di agar e aggiunto alla soluzione fissante lisina. Queste ottimizzazioni migliorano la conservazione del campione e mantenimento delle caratteristiche di micromorphological. Campioni preparati in questo modo sono favorevoli a sottile di sezionamento e di imaging da microscopia elettronica di trasmissione, fluorescenza e della luce. Abbiamo applicato questa tecnica a Colonia biofilm di Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilise Vibrio cholerae. L'elevato livello di dettaglio visibile in campioni generati da questo metodo, combinato con ceppo reporter ingegneria o l'uso di coloranti specifici, può fornire spunti interessanti sulla fisiologia e sullo sviluppo delle comunità microbiche.

Questo metodo genera sottili sezioni di biofilm in cui le caratteristiche morfologiche distinte e zone di espressione genica possono essere ripreso da DIC, microscopia a fluorescenza e TEM. Mentre imaging DIC utilizzando un 40 X obiettivo a immersione in olio può essere sufficiente a mostrare alcune caratteristiche morfologiche (Figura 2E), abbiamo trovato quello fluorescenza microscopia di ceppi ingegnerizzati per proteina costitutivamente espresso fluoresc...

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Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Inclusione in paraffina e sezionamento sottile di biofilm di colonie microbiche per l'analisi al microscopio

Descriviamo la fissazione, inclusione in paraffina e sottili tecniche di sezionamento per colonie microbiche biofilm. In campioni preparati, modelli di espressione di sottostruttura e reporter di biofilm possono essere visualizzati da microscopia.

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.2K Views.  Columbia University. Descriviamo la fissazione, inclusione in paraffina e sottili tecniche di sezionamento per colonie microbiche biofilm. In campioni preparati, modelli di espressione di sottostruttura e reporter di biofilm possono essere visualizzati da microscopia.

Video: Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

Un metodo per ottenere il seriale sezioni ultrasottili di microrganismi in microscopia elettronica a trasmissione

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Ricerca

Ingegneria

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Immunologia e infezioni

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Lievito Colony metodo di inserimento

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Biologia

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rigida incorporamento di fisso e macchiato, complesso, scala millimetrata esemplari per l'istologia privo di sezione 3D da Micro-tomografia computerizzata

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Bioingegneria

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

Tecniche di microscopia per l'interpretazione della colonizzazione fungina nei tessuti delle piante micoeterotrofiche e della germinazione simbiotica dei semi

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Histological Sample Preparation for Light Microscopy

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope. The preparation of histological samples can vary greatly based on the inherent properties of the samples such as size and hardness as well as expected post-processing which includes planned staining techniques or other down-stream applications. As described in this video, specimen preparation typically begins with a fixation procedure to prevent degradation of the sample by naturally occurring enzymes that are released by the cells upon death. Once fixed, samples are placed into an embedding medium that is able to sufficiently support the sample. Most commonly this is paraffin wax, but other materials such as a glycerin based freezing medium and agars are also used to surround the sample during sectioning. Sectioning then takes place on a microtome or other cutting device that allows the user to shave the sample into thin slices ranging from a few microns to a few millimeters in thickness. Once cut, sections are mounted on a glass slide and stained to bring out specific features of the sample before being imaged on a microscope.

Histological Sample Prep for a Light Microscope

Preparazione del campione istologico per microscopia ottica

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope.  The preparation of histological samples can vary ...

Didattica

JoVE Science Education

Biologia di base

Tecniche generali di laboratorio

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Source: Nagaraj A.S., et al., <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58569/establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.

Conservazione dei tessuti con paraffina fissata in formalina (FFPE): un metodo per studiare la morfologia dei tessuti

Source: Nagaraj A.S., et al., Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. J. Vis. Exp. (2018)
The ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Ricerca sul cancro

Lung Cancer

Ex vivo study

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Source: Guennoc, Cora Miquel, et al, <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54771">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

Un metodo per la preparazione del campione per visualizzare i batteri che formano biofilm sulle ife fungine

1. Preparation of an In Vitro Biofilm of Bacteria on the Fungal Colony

	Centrifuge the bacterial culture at 5,000 x g for 3 min and suspend the pellet in ...

Immunology

Immunodiagnostics

In Vitro and In Vivo Models

Fixation and Sectioning

Two basic types of preparation are used to visualize specimens with a light microscope: wet mounts and fixed specimens.
The simplest type of preparation is the wet mount, in which the specimen is placed in a drop of liquid on the slide. A liquid specimen can be directly deposited on the slide using a dropper. Solid specimens, such as skin scraping, can be placed on the slide before adding a drop of liquid to prepare the wet mount. Sometimes the liquid is simply water, but stains are often added to enhance contrast. Once the liquid has been added to the slide, a coverslip is placed on top, and the specimen is ready for examination under the microscope.
The second method of preparing specimens for light microscopy is fixation. The &#8220;fixing&#8221; of a sample refers to the process of attaching cells to a slide. Fixation is often achieved by heating (heat fixing) or chemically treating the specimen. In addition to attaching the specimen to the slide, fixation also kills microorganisms in the specimen, stopping their movement and metabolism while preserving the integrity of their cellular components for observation.
To heat-fix a sample, a thin layer of the specimen is spread on the slide (called a smear), and the slide is then briefly heated over a heat source. Chemical fixatives are often preferable to heat for tissue specimens. Chemical agents such as acetic acid, ethanol, methanol, formaldehyde (formalin), and glutaraldehyde can denature proteins, stop biochemical reactions, and stabilize cell structures in tissue samples.
In addition to fixation, staining is almost always applied to color certain features of a specimen before examining it under a light microscope. Stains, or dyes, contain salts made up of a positive ion and a negative ion. Depending on the type of dye, the positive or the negative ion may be the chromophore (the colored ion); and the other uncolored ion is called the counterion. If the chromophore is the positively charged ion, the stain is classified as a basic dye; if the negative ion is the chromophore, the stain is considered an acidic dye.
Dyes are selected for staining based on the chemical properties of the dye and the specimen being observed, which determine how the dye will interact with the specimen. In most cases, it is preferable to use a positive stain, a dye that will be absorbed by the cells or organisms being observed, adding color to objects of interest to make them stand out against the background. However, there are scenarios where it is advantageous to use a negative stain absorbed by the background but not by the cells or organisms in the specimen. Negative staining produces an outline or silhouette of the organisms against a colorful background.
Because cells typically have negatively charged cell walls, the positive chromophores in basic dyes tend to stick to the cell walls, making them positive stains. Thus, basic dyes such as basic fuchsin, crystal violet, malachite green, methylene blue, and safranin typically serve as positive stains. On the other hand, the negatively charged chromophores in acidic dyes are repelled by negatively charged cell walls, making them negative stains. Commonly used acidic dyes include acid fuchsin, eosin, and rose bengal.
Some staining techniques involve the application of only one dye to the sample; others require more than one dye. In simple staining, a single dye is used to emphasize particular structures in the specimen. A simple stain will generally make all of the organisms in a sample appear the same color, even if the sample contains more than one type of organism. In contrast, differential staining distinguishes organisms based on their interactions with multiple stains. In other words, two organisms in a differentially stained sample may appear different colors. Differential staining techniques commonly used in clinical settings include Gram staining, acid-fast staining, endospore staining, flagella staining, and capsule staining.
This text is adapted from <a href="https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-4-staining-microscopic-specimens">Openstax, Microbiology 2e, Section 2.4: </a><a href="https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-4-staining-microscopic-specimens">Staining microscopic specimens</a>

Fissazione e sezionamento

Two basic types of preparation are used to visualize specimens with a light microscope: wet mounts and fixed specimens.
The simplest type of preparation ...

Inclusione in paraffina e sezionamento sottile di biofilm di colonie microbiche per l'analisi al microscopio

Riepilogo

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