Name: 3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii
Uploaded: 2014-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
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Ringraziamo l&#39;intero laboratorio Koshy per utili discussioni. Ringraziamo Patty Jansma e la University of Arizona Dipartimento di Neuroscienze per la consulenza e assistenza per l&#39;imaging. Ringraziamo anche il laboratorio Porreca per l&#39;uso del loro Vibratome. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK).

NOTA: I topi sono stati allevati e mantenuti in temperatura e umidità ambiente controllata con 12 hr invertito cicli di luce / buio, con cibo e acqua ad libitum presso la University of Arizona. Gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida e l&#39;approvazione della Cura e uso Comitato Animal Istituzionale della University of Arizona. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze. I topi Cre-giornalista sono su un C57BL / 6 di fondo 11 e sono disponibili in commercio. 1. mouse Infezione NOTA: Il metodo di infezione mouse con Toxoplasma gondii descritto qui di seguito è stato utilizzato in studi precedentemente pubblicati 10 - 12. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Grow ceppi Toxoplasma nell&#39;uomo prepuzio fibroblasti (HFFS) coltivate in Dulbecco alta glucosio Modificato (DMEM) integrato con il 10% FBS, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml streptomycin, e 2 mM L-glutammina (cDMEM) in un pallone T-25 all&#39;interno di un incubatore CO 2 5% fino parassiti hanno costituito grandi vacuoli parassitoforo. </li><li> Parassiti Siringa a rilascio raschiando cellule dal fondo del pallone e passando la soluzione risultante attraverso un ago calibro 25 collegato ad una siringa da 3 ml 2 volte all&#39;interno del pallone poi trasferire la soluzione in un caso siringa da 5 ml collegato ad un ago calibro 27 che è stato collocato capovolto all&#39;interno di un tubo da 15 ml. Collegare lo stantuffo alla siringa e passare la soluzione del parassita nel tubo conico. </li><li> Centrifugare la provetta per 10 min a 300 x g. Aspirare il surnatante quindi risospendere il pellet in 4-6 ml sterile di grado USP 1x tampone fosfato (PBS) pH 7.4 (Soluzione Stock). </li><li> Caricare un emocitometro con 10 ml di soluzione madre, aspettare 5-10 min per i parassiti di stabilirsi poi contare il numero di parassiti nei quattro angoli e centrali piazze della grande piazza centrale. </li><li> Diluire parasiti di adeguata dimensione inoculo di 100K / 200 ml PBS 1X poi iniettare topi per via intraperitoneale (ip) con un volume totale di 200 microlitri. NOTA: Per questa procedura, i topi sono stati inoculati con 100K tipo III (CEP) 13 tachizoiti a 200 microlitri 1x PBS. Quando infettare topi con altri ceppi di Toxoplasma, concentrazione di inoculo può essere necessario un aggiustamento per tenere conto di livello di virulenza. </li></ol> 2. perfusione cerebrale e raccolta NOTA: Questo protocollo è stato condotto a 21 giorni dopo l&#39;infezione (dpi) in quanto questo rappresenta il punto di tempo in cui un picco di cisti si trovano nel cervello di topo, ma altri punti di tempo può essere utilizzato. Size, il numero, la posizione e la presenza o assenza di cisti dipende da molti fattori, tra cui ceppo di topi, parassiti ceppo così come il formato inoculo 7,14 - 17. Gli investigatori dovranno stabilire individualmente l&#39;inoculo appropriato per il mouse e Toxoplasceppo ma lui / lei usa. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Installazione di tutti gli strumenti di raccolta chirurgici (Figura 1). </li><li> Per ogni mouse, preparare e tenere in ghiaccio: siringa 20ml riempito di sodio cloruro 0,9% (NaCl) + 10 U / ml di eparina in 1x sterile grado USP PBS (Eparina / Saline); Siringa da 20 ml riempito con 4% paraformaldeide (PFA); Scintillazione flaconcino con 15 ml 4% PFA. Per di più i topi, preparare un bicchiere pieno di l&#39;intero importo di ogni soluzione necessaria per tutti i mouse poi elaborare una siringa nuova completa di soluzioni per ogni perfusione. </li><li> Anestetizzare l&#39;ip mouse con 200 microlitri / 25 g di peso corporeo di ketamina / xilazina cocktail (24 mg / ml e 4,8 mg / ml) del giorno di interesse. Monitorare il mouse per il livello di anestesia controllando pizzico punta reflex. Continuare con protocollo solo quando il mouse mostra alcuna risposta ad una presa punta ferma. NOTA: Altri metodi di anestesia può essere usato fino a quando il livello appropriato di anestesia viene raggiunto primaprocedere con il protocollo. </li><li> Posizionare il mouse in posizione supina sulla piattaforma di schiuma coperto. Pin tutti e quattro gli arti fuori ai piedi poi spruzzare il petto e l&#39;addome con il 70% di etanolo (EtOH) (Figura 2A). L&#39;aggiunta di alcuni asciugamani di carta sterili sotto il mouse può essere utilizzato per assorbire troppo pieno di liquidi di perfusione. </li><li> Sollevare la pelle appena sotto lo sterno con una pinza poi usare le forbici per fare un&#39;incisione. Tirate la pelle per esporre il torace (Figura 2B). </li><li> Sollevare xiphoid processo ed effettuare una incisione addominale appena sotto il diaframma, esponendo il fegato che viene bruscamente sezionato distanza dal diaframma. Fare due incisioni, uno a sinistra e uno a destra attraverso il diaframma e la parte inferiore delle costole. Estendere le incisioni sinistro e destro circa 1 / 2-2 / 3 fino alla cassa toracica, che viene poi riflessa indietro per aprire la cavità toracica (Figura 2C). NOTA: Fare attenzione a non tagliare tutti gli organi o vasi sanguigni principali duanello questa procedura come in questo modo si compromette la qualità di perfusione. </li><li> Profumato transcardiaca con 10-20 ml eparina / Saline seguita da 10-20 ml 4% PFA. NOTA: Se la perfusione è fatto correttamente, il fegato si trasformerà da rosso a marrone (Figura 2D). Se non fatto correttamente, i vasi sanguigni saranno visibili (Figura 2E). </li><li> Capovolgere il mouse sul suo addome, i piedi ri-pin poi spruzzare testa e il collo con il 70% EtOH. Sollevare pelle dalla base del collo e fare una incisione. Togliere la pelle per esporre il cranio (Figura 2F). Decapitare testa a livello delle spalle. Rimuovere il cranio, rimuovere delicatamente il cervello, e metterlo in una fiala di scintillazione pieno di 4% PFA (Figura 2G-H). NOTA: Se ben perfuso, il cervello appare bianca senza vasi sanguigni visibili (Figura 2i). Se il cervello non è ben perfuso, vasi sanguigni saranno visibili (Figura 2J). </li><li> Posizionare la scintillazione flaconcino con cervello in 4% PFA a 4 ° C durante la notte, coperto dalla luce. Sciacquare il cervello in non-USP grado 1x PBS e trasferimento in un nuovo flacone scintillazione piena di freddo 1x PBS. Conservare il cervello in 1x PBS a 4 ° C, coperto dalla luce. NOTA: compensazione di successo e di imaging è stato realizzato con sezioni memorizzati in 1x PBS per fino a un mese, ma è meglio sezione cervello in pochi giorni lo stoccaggio prolungato in PBS inverte la fissazione PFA e potrebbe portare a meno di immagini ottimali . Autofluorescenza e una maggiore sfocatura sono stati notati in alcuni tratti imaged dopo stoccaggio in 1x PBS per un mese o più. </li></ol> 3. Cervello sezionamento <ol style="margin-left: 40px;"><li> Rimuovere il cervello da 1x PBS e metterlo in una matrice cerebrale (Figura 3A) per consentire una maggiore precisione e taglia anche attraverso il cervello. Tagliare i bulbi olfattivi cervelletto e, se presente, e poi tagliare il cervello coronale in 2 o 3 sezioni. <br /&gt; NOTA: rifilatura e taglio del cervello può essere fatto senza l&#39;aiuto di una matrice cerebrale. Numero di sezioni tagliate coronale dipenderà dalla distanza di taglio del Vibratome utilizzato. Il cervello può essere sezionato in qualsiasi orientamento, anche se le sezioni sagittali e coronali sono più comunemente utilizzati per l&#39;identificazione neuroanatomica. </li><li> Fissare ciascuna sezione del cervello su un blocco di montaggio campione con cianoacrilato. Applicare un piccolo blocco di 5% agarosio gel dietro la parte del cervello per il supporto (Figura 3B). NOTA: altri meccanismi di sostegno possono essere utilizzati, ma senza il sostegno, la Vibratome possono spingere sul cervello provocando sezionamento irregolare. </li><li> Tagliare il tessuto in 160 micron (distanza di lavoro dell&#39;obiettivo utilizzata per l&#39;imaging) sezioni spesse con Vibratome impostati ad una velocità di 4 e ampiezza 9. NOTA: Le impostazioni per la velocità e l&#39;ampiezza può essere regolata a seconda della particolare macchina utilizzata per ottenere anche, sezioni lisce. Se le impostazioni sononon è corretto, il risultato può essere sezioni irregolari, lacerazione dei tessuti marchi o chiacchiere. </li><li> Raccogliere sezioni di tessuto in una fiala di scintillazione pieno di fresche, refrigerate 1x PBS se stanno per essere liquidati entro una settimana. Se le sezioni non stanno per essere liquidati entro una settimana, luogo sezioni in provette da 1,5 ml microcentrifuga riempiti con una soluzione crioconservante e conservare a -20 ° C. </li></ol> 4. Compensazione ottica di tessuto cerebrale Sezioni NOTA: Questo protocollo è stato modificato da un metodo precedentemente pubblicato 8. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Preparare 25%, 50%, 75% e 90% vol / vol glicerolo in PBS 1x + 2% Tween-20 (Gl / PBST). </li><li> Rimuovere le sezioni da 1x PBS o, se in crioconservante, sciacquare in 1x PBS e trasferimento in una fiala di scintillazione contenente 10 ml di 25% Gl / PBST. Posizionare flaconcino su un agitatore a 4 ° C, coperto dalla luce, per 12 hr. </li><li> Verificare che tutte le sezioni sono affondate al bottom della fiala. Aspirare il 25% Gl / PBST, lasciando appena sufficiente a coprire le sezioni poi riempire la fiala con 10 ml 50% Gl / PBST e posto su un agitatore a 4 ° C, coperto dalla esposizione alla luce, per 12 ore. Ripetere questo processo per il 75% Gl / PBST poi il 90% Gl / PBST. Lasciare sezioni del 90% Gl / PBST per 24 ore per raggiungere la massima compensazione. Nel corso del processo di compensazione, osservare compensazione ottica graduale (Figura 4). NOTA: Questo processo può essere accelerato se le soluzioni sono cambiati immediatamente dopo sezioni sono affondate al fondo della fiala. Nelle soluzioni 75% e 90%, sezioni non affondare fino al fondo del flacone, ma galleggia nel mezzo. </li></ol> 5. montaggio Sezioni tessuto cerebrale <ol style="margin-left: 40px;"><li> Tagliare un No. 1.5 coprioggetto in 5 pezzi per creare un distanziatore. Con una matita righello e diamantata a segnare e rompere il vetrino lungo le linee tratteggiate in Figura 5A. Elimina tegli pezzo centrale, organizzare i 4 pezzi esterni su un vetrino semplice per creare una finestra, e poi spazzolare smalto trasparente sulle cuciture di aderire i pezzi del distanziale alla diapositiva nella configurazione corretta (Figura 5B). NOTA: Il distanziale viene utilizzato per creare lo spazio necessario tra il vetrino e coprioggetto per il montaggio delle sezioni eliminato. Il coprioggetto può essere tagliato in modi diversi per creare qualsiasi finestra dimensione necessaria. Pre-taglio distanziali schiuma sono anche disponibili in commercio. Per consentire smalto si asciughi completamente, è meglio fare le diapositive con distanziatori almeno un giorno prima le sezioni di montaggio. </li><li> Sezioni Trasferire una diapositiva con una pipetta di trasferimento in plastica con la punta tagliata. Assicurati di inserire dintorni con il 90% Gl / PBST. Abbassare delicatamente un coprioggetto sopra sezioni facendo attenzione a non introdurre bolle. Eccesso Gl / PBST può essere malvagio via con un libero di pelucchi. </li><li> Immagine GFP + neuroni contenenti RFP + <em&gt; Cisti Toxoplasma gondii con un microscopio confocale immediatamente (Figura 7A-B), quindi conservare i vetrini piano e coperto dalla luce a 4 ° C. NOTA: In alternativa, tenuta scivola completamente intorno tutti i bordi per memorizzare e ripreso in un secondo momento. L&#39;uso di smalto trasparente per sigillare diapositiva è opzionale e può rendere più difficile da rimuovere coprioggetto se si dovesse rimuovere le sezioni dal vetrino in un secondo momento per ulteriori elaborazioni. </li></ol> 6. Imaging NOTA: Ogni microscopio può essere utilizzato che ha la capacità di ottenere alta risoluzione z-stack. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Dopo aver trovato inizialmente piano focale a 10X, passare ad un obiettivo 20X e la scansione attraverso la sezione di identificare una ciste situata all&#39;interno di una GFP + cellule. Centra la regione di interesse (ROI) nel campo visivo. </li><li> Passare a un obiettivo 40X. Fuoco su e giù attraverso l&#39;intero ROI per assicurarsi che l&#39;intera cella e cyst sono visibili. NOTA: Le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 40X / 1.30 Olio DIC M27. </li><li> Utilizzando il software di imaging installati, ottenere una z-stack che include l&#39;intera cella con cisti. Impostazioni medi utilizzati per ottenere immagini sono mostrate in Figura 6. NOTA: Le impostazioni possono essere necessario modificare a seconda di ogni sezioni investigatori di tessuto e capacità microscopio. </li><li> Ottenere una immagine massima sporgenza del z-stack impostando il numero di proiezioni a 1. Ottenere una vista rotazionale intero impostando il numero di proiezioni a 64. NOTA: Altri pacchetti software sono disponibili e possono essere utilizzati per ottenere la sporgenza massima, rotazionale nonché altre viste immagini z-stack. </li><li> Analizzare l&#39;immagine con il software di analisi delle immagini. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Dato che i cambiamenti cellulari nelle cellule ospiti infette sono stati collegati a risultati malattia in infezioni da altri organismi intracellulari come l&#39;HIV, la rabbia, e Chlamydia 18,19, abbiamo sviluppato una tecnica che permetta di studiare le interazioni intime che si verificano tra il sistema nervoso centrale ospitare cellulare e Toxoplasma. Il metodo descritto qui realizza questo obiettivo, consentendo immagini efficiente di neuroni con infezione cronica. Prima dello sviluppo di questo...

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 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
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Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

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Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere alta risoluzione, immagini tridimensionali di singoli neuroni che sono infettati dal parassita intracellulare obbligato Toxoplasma gondii. Toxoplasma è spesso considerato uno dei parassiti di maggior successo per la sua vasta gamma ospite intermedio, che comprende l&#39;uomo e roditori. In entrambi gli esseri umani e roditori, dopo l&#39;infezione acuta attraverso l&#39;ingestione di cibo o acqua contaminati, Toxoplasma è in grado di causare una infezione persistente del sistema nervoso centrale convertendo dalla sua forma replica veloce (il tachizoite) per la sua lenta replicante e encysting forma (il bradyzoite ). In individui immunocompetenti, questa infezione CNS latente è pensato per essere relativamente asintomatica, ma in individui immunocompromessi, come i malati di AIDS o pazienti sottoposti a trapianto, recrudescenza del parassita può portare alla fatale encefalite toxoplasmic 1,2. Inoltre, studi recenti have dimostrato che l&#39;infezione latente da Toxoplasma può portare a cambiamenti comportamentali nei roditori 3,4, anche se il meccanismo rimane sconosciuto. Sorprendentemente, nonostante questi dati evidenziano l&#39;importanza dell&#39;interazione CNS- Toxoplasma, relativamente poco si sa su questo rapporto, soprattutto a livello cellulare e molecolare. La possibilità di studiare gli aspetti anche semplici dell&#39;interazione cervello parassita è stata ostacolata in parte dalle limitazioni tecnologiche. Ad esempio, la maggior parte del lavoro dimostrando che i neuroni sono le cellule in cui cisti persistono è stato fatto con microscopia elettronica (EM) 5,6. Anche se EM dà alta risoluzione, è ad alta intensità di tempo, di lavoro, e costoso. Immunofluorescenza (IF) saggi sono stati recentemente utilizzato in combinazione con la microscopia confocale per confermare il lavoro fatto da EM 7. Se le analisi sono tecnicamente facili da eseguire e relativamente poco costoso, ma utilizzando queste tecniche per undertand il rapporto spaziale tra la cisti e il neurone infettato richiede la ricostruzione di serie, che richiede molto tempo, tecnicamente difficile, e può portare alla perdita di preziose informazioni. Così, abbiamo sviluppato un metodo che può essere utilizzato con il modello murino di CNS toxoplasmosi e ci permette di immagine la totalità dei neuroni infetti senza EM o immunoistochimica (IHC). Sviluppando tale tecnica, possiamo cominciare a esplorare il rapporto cellulare tra la cellula infettata e la cisti in modo relativamente rapido e poco costoso. Il metodo abbiamo sviluppato combina più recenti tecniche di compensazione otticamente e sezioni di cervello spessore di imaging mediante microscopia confocale 8 con un sistema che segna in cellule in vivo che sono stati iniettati con proteine ​​parassita 9,10. In questo sistema, abbiamo infettare topi Cre-giornalista che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP) solo dopo 11 ricombinazione Cre-mediata con Toxoplasma </em&gt; Ceppi che esprimono una proteina fluorescente rossa (RFP) e iniettano Cre ricombinasi nelle cellule ospiti 9. Questa combinazione ci permette di raccogliere il cervello infetto del mouse dopo l&#39;infezione del sistema nervoso centrale è stabilita, tagliare sezioni di cervello di spessore, e rapidamente individuare le aree di pertinenza immagine trovando la RFP + cisti. È importante notare che, come espressione della GFP cellula ospite dipende unicamente dalla iniezione di Cre da parassiti, infezioni e non su una serie di cellule GFP + non contengono parassiti 10. Poiché l&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di essere in grado di immagine intere neuroni infettati, l&#39;attenzione è solo sulla GFP + neuroni che contengono anche un RFP + cisti, ma il protocollo può essere utilizzato anche per l&#39;immagine della GFP + / RFP - neuroni. Una volta che il cervello infetto è raccolto e sezionata, le sezioni sono resi trasparente glicerolo compensazione. Regioni appropriate di sezioni sono poi ripreso con microscopia confocale, almuggito visualizzazione senza precedenti di cellule ospiti infette e parassiti incistate nella loro interezza. Qui forniamo un protocollo completo per l&#39;identificazione, la compensazione ottica, e di imaging infetti neuroni.

<table><tbody><tr><td>Vibratome Series 1000 Sectioning System</td><td>Technical Products International, Inc.</td><td></td><td>Other vibratomes are compatible</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Premium Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Scriber</td><td>VWR</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;reg; Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml</td><td>Western Medical Supply, Inc.</td><td>4165</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed&amp;reg; Injection Xylazine 20 mg/ml</td><td>Lloyd Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZsGreen Mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>7906</td><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td></tr><tr><td>Surgical equipment</td><td></td><td></td><td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td></tr><tr><td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td><td></td><td></td><td>These are primary cells from human foreskins.&amp;nbsp; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>HyClone</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin Solution, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td><td>Corning</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Canted neck flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>1012639</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade</td><td>amresco</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hemocytometer</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Brain Slicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Disposable Scintillation Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td><td>In-house</td><td>17212945</td><td>This product is purchased from an in-house stockroom.&amp;nbsp; Other companies are compatible.</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td></td><td></td><td>Other brands are compatible</td></tr><tr><td>10 ml Syringe with Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td>Other syringes are compatible</td></tr><tr><td>Three-way Stopcock</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible</td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible</td></tr><tr><td>25 G x 12&quot; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450099</td><td>Other brands are compatible</td></tr></tbody></table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii è un obbligato, parassita intracellulare con una gamma ampia di accoglienza, compresi gli esseri umani e roditori. In entrambi gli esseri umani e roditori, Toxoplasma stabilisce una infezione persistente per tutta la vita nel cervello. Mentre questa infezione cervello è asintomatica nella maggior parte delle persone immunocompetenti, nel feto in via di sviluppo o individui immunocompromessi, come sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) pazienti, questa predilezione per la persistenza e nel cervello può portare a malattia neurologica devastante. Pertanto, è chiaro che l&#39;interazione cervelli Toxoplasma è fondamentale per la malattia sintomatica prodotto da Toxoplasma, ma abbiamo poco comprensione dell&#39;interazione cellulare o molecolare tra cellule del sistema nervoso centrale (CNS) e il parassita. Nel modello murino di CNS toxoplasmosi è noto da oltre 30 anni che i neuroni sono le cellule in cui il parassita persiste, ma poche informazioni sono disponibili su qualiparte del neurone è generalmente infettato (soma, dendriti, assoni) e se questo rapporto cellulare cambia tra i ceppi. In parte, questa mancanza è secondario alla difficoltà di imaging e visualizzazione interi neuroni infetti da un animale. Tali immagini richiede un complesso di sezionamento di serie e la cucitura del tessuto fotografato al microscopio elettronico o microscopia confocale dopo immunocolorazione. Combinando diverse tecniche, il metodo qui descritto consente l&#39;uso di sezioni spesse (160 micron) per identificare e celle di immagine intera che contengono cisti, permettendo la visualizzazione e analisi del singolo, neuroni cronicamente infette tridimensionale senza bisogno di immunocolorazione, microscopia elettronica , o sezionamento seriale e cuciture. Utilizzando questa tecnica, possiamo cominciare a capire il rapporto cellulare tra il parassita e il neurone infetto.

Figura 7 comprende immagini rappresentative di due cisti contenente GFP + neuroni da 160 micron due differenti sezioni spesse nonché una misurazione rappresentativa della distanza dal cisti-cellula-corpo Figura 7B. Figure 7 A e B illustrano che questa nuova protocollo permette la visualizzazione del neurone infetto nella sua interezza. Figura 7C mostra che con questa tecnica di imaging, è ora possibile quantificare la distanza tra la cisti ...

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3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Usando questo protocollo, siamo stati in grado di immagine di 160 micron di spessore sezioni di cervello di topi infettati con il parassita Toxoplasma gondii, che consente la visualizzazione e l&#39;analisi del rapporto spaziale tra il parassita encysting e il neurone infetto.

3-D imaging e analisi di neuroni infetti<em&gt; In Vivo</em&gt; Con<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K Views.  University of Arizona.  Usando questo protocollo, siamo stati in grado di immagine di 160 micron di spessore sezioni di cervello di topi infettati con il parassita Toxoplasma gondii, che consente la visualizzazione e l'analisi del rapporto spaziale tra il parassita encysting e il neurone infetto. 

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo</emImaging> della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Ricerca

Neuroscienze

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Immunologia e infezioni

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Imaging tridimensionale e l'analisi dei mitocondri all'interno di fibre nervose umane Intraepidermal

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

Isolamento concomitante di astrociti primari e microglia per l'infezione da parassiti di Protozoi

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is an obligate intracellular parasite with a diverse biology that infects several mammalian species, including humans, causing cardiac and digestive pathologies. Reliable detection of T. cruzi in vivo infections has long been needed to understand Chagas disease&#39;s complex biology and accurately evaluate the outcome of treatment regimens. The current protocol demonstrates an integrated pipeline for automated quantification of T. cruzi-infected cells in 3D-reconstructed, cleared organs. Light-sheet fluorescent microscopy allows for accurately visualizing and quantifying of actively proliferating and dormant T. cruzi parasites and immune effector cells in whole organs or tissues. Also, the CUBIC-HistoVision pipeline to obtain uniform labeling of cleared organs with antibodies and nuclear stains was successfully adopted. Tissue clearing coupled with 3D immunostaining provides an unbiased approach to comprehensively evaluate drug treatment protocols, improve the understanding of the cellular organization of T. cruzi-infected tissues, and is expected to advance discoveries related to anti-T. cruzi immune responses, tissue damage, and repair in Chagas disease.

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

The present protocol describes light-sheet fluorescent microscopy and automated software-assisted methods to visualize and precisely quantify proliferating and dormant Trypanosoma cruzi parasites and T cells in intact, cleared organs and tissues. These techniques provide a reliable way to evaluate treatment outcomes and offer new insights into parasite-host interactions.

Imaging 3D quantitativo di cellule infette da Trypanosoma cruzi, amastigoti dormienti e cellule T in organi chiarificati intatti

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Tracciamento di patogeni di tutto l'organo tramite quantificazione con reporter fluorescente

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

Autore in primo piano: Svelare le risposte batteriche agli antibiotici e al sistema immunitario nei tessuti

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

Tomografia tridimensionale tridimensionale ad alta risoluzione di infezioni microbiche

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

3-D imaging e analisi di neuroni infetti

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic

Imaging tridimensionale e l'analisi dei mitocondri all'interno di fibre nervose umane Intraepidermal

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

Isolamento concomitante di astrociti primari e microglia per l'infezione da parassiti di Protozoi

Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente

Imaging 3D quantitativo di cellule infette da Trypanosoma cruzi, amastigoti dormienti e cellule T in organi chiarificati intatti

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi

Tomografia tridimensionale tridimensionale ad alta risoluzione di infezioni microbiche