We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. Preparazione di cellule e reagenti <ol><li> Il giorno prima del test, sulla piastra cellule ospiti per il virus in questione (Tabella 1 e 2) a 90 - 100% di confluenza. </li><li> Preparare soluzione di fissaggio del 10% di formaldeide in dH 2 O. A esempio, mescolare 5,56 ml di 36% stock di formaldeide con 14,44 ml di H 2 O distillata (dH 2 O). NOTA: uso sicuro appropriata pratiche di manipolazione e ventilazione durante l&#39;uso di formaldeide. </li><li> Preparare macchia di cristallo viola: 1% di cristallo viola (CV) in etanolo al 20% e dH 2 O. </li><li> Preparare il supporto targa 2x (tipo di cellula dipendente a concentrazione 2x; vedi tabella 2). Filtrare su un filtro da 0,2 micron se qualche reagenti non sono sterili. </li><li> Preparazione di sovrapposizioni immobilizzanti (Tabella 3) <ol><li> Per sovrapposizioni liquidi, fare una soluzione sterile 2,4% di Avicel in dH 2 O. Per evitare grumi, aggiungere la polvere in un pallone contenente acqua tha sta rapidamente mescolando con un ancoretta, versare Avicel lentamente e mescolare rapidamente a temperatura ambiente (RT). Quando la soluzione si rivela troppo viscoso per un ancoretta per omogeneizzare, passare a uno shaker pallone per&gt; 30 min con pesanti agitazione per assicurare una omogeneizzazione. NOTA: Le soluzioni madre possono essere effettuate a concentrazioni più basse, ma le soluzioni possono separare e dovranno essere remixato per garantire omogeneizzazione. Soluzioni di lavoro Avicel possono essere usate vanno 0,6-3%. </li><li> Dopo omogeneizzazione, autoclave la soluzione e conservare sigillato a temperatura ambiente. </li><li> Per agarosio e carbossimetilcellulosa (CMC) sovrapposizioni, preparare una soluzione madre in dH 2 O del 2% CMC o 0,6% di agarosio. Mescolare con un ancoretta e autoclave o forno a microonde per portare in soluzione. </li></ol></li></ol> 2. diluizioni e infezioni <ol><li> Il giorno dopo la placcatura, controllare visivamente la confluenza e la vitalità delle cellule prima di iniziare il test. Garantire standard di morfologia cellulare untrovare un monostrato confluente ~ 90% è presente. </li><li> Effettuare una diluizione seriale di dieci volte dei campioni infettive. Utilizzare i mezzi di crescita cellulare per la propagazione virale come diluente (Tabella 2). Variare il numero di diluizioni necessarie sulla base del titolo atteso del virus in questione, e utilizzare sempre un campione di controllo non infetto al fine di garantire in modo indipendente la vitalità cellulare e l&#39;aiuto nell&#39;identificazione della placca. </li><li> Dalle diluizioni seriali, di infettare le cellule per 45 minuti a 1 ora (Tabella 1). Utilizzare un volume sufficiente di inoculo a coprire le cellule, mantenendo il volume più basso possibile per massimizzare il contatto virale con il monostrato (Tabella 4). Lastre di roccia delicatamente ogni 20 min per assicurare una copertura uniforme e prevenire il monostrato cellulare si secchi. </li><li> Dopo l&#39;infezione, sovrapporre un volume adeguato di immobilizzare media direttamente ai inoculums nel pozzo (Tabella 2) utilizzando una miscela 1: 1 di supporti placca 2x e immobilizzione sovrapposizione di scelta (CMC, agarosio o Avicel). Agitare delicatamente per mescolare. <ol><li> Per sovrapposizioni liquido, miscelare 1: 1 con mezzi riscaldati placca 2x e 1,2-2,4% RT magazzino Avicel per ottenere una soluzione di lavoro di 0,6-1,2% Avicel mezzo di copertura. </li><li> Per una sovrapposizione di agarosio, utilizzare una miscela 1: 1 di supporti 2x placca riscaldate e una soluzione madre di riscaldamento 0,6% di agarosio, posto in un bagno d&#39;acqua a 56 ° per 30 minuti per equilibrare la temperatura ottenendo una concentrazione finale di agarosio / sovrapposizione di 0,3 %. </li><li> Per CMC, preparare una soluzione madre 2% e trattare come descritto per la sovrapposizione di agarosio. </li><li> Quando si applica la sovrapposizione al monostrato, equilibrare sempre agarosio caldo o CMC in acqua 56 ° C per evitare di danneggiare il monostrato. Assicurarsi che la soluzione è caldo, ma non bollente al tatto per prevenire la morte cellulare e titoli virali ridotti. La maggior parte delle sovrapposizioni agarosio inizierà a solidificarsi al di sotto di 42 ° C, lavorare velocemente e / o preparare piccoli lotti per evitare la solidificazione durante la manipolazione. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;aggiunta della sovrapposizione, incubare le piastre a produrre placche distinte che sono chiaramente numerabile. La formazione della placca può richiedere 2-14 giorni a seconda del virus in fase di analisi, la tabella 1. NOTA: Una volta che le piastre sovrapposte liquidi sono posti in incubatrice, non li sposta. Movimento delle sovrapposizioni liquido durante il periodo di incubazione si tradurrà in placche macchiate. Agarosio e CMC sovrapposizioni sono semisolida e possono essere spostati o controllati periodicamente al microscopio ottico per monitorare lo sviluppo della placca. </li></ol> 3. Fissaggio e Celle di colorazione <ol><li> Per fissare le cellule, travasare o aspirare la sovrapposizione Avicel, e fissare le cellule con la soluzione di formaldeide al 10% per 30 minuti per tutta la notte (&lt;1 ml per pozzetto di una piastra ben 6). <ol><li> Per agarosio o CMC, aggiungere direttamente la soluzione di formaldeide per la sovrapposizione per 1 ora a tutta la notte. NOTA: I campioni possono essere conservati per lunghi periodi di tempo nel fissativo a condizione che fanon evaporare e asciugare come questo può distorcere il monostrato. </li></ol></li><li> Prima di colorazione e dopo la fissazione, scartare la formaldeide e togliere i tappi semisolidi per l&#39;agarosio e CMC sia con acqua corrente o manualmente con una spatola. Sciacquare placche Avicel con acqua per eliminare residui di sovrapposizione / fissativo prima della colorazione. </li><li> Per la colorazione, coprire le cellule con una quantità minima di soluzione di violetto cristallo per ~ 15 min. Lastre di roccia se necessario per garantire anche la copertura. </li><li> Lavare delicatamente la macchia di cristallo viola con acqua. Una volta fissato, macchiato, e secco, negozio di placche a tempo indeterminato per le analisi future. </li></ol> 4. Determinazione virali I titoli <ol><li> Contare le placche in ciascun pozzetto, prendendo la media per eventuali repliche tecnici della stessa diluizione. Per i grandi formati lastra, pozzi di sconto con meno di 5 o superiore a 100 placche. Prendete nota di dimensioni della placca e morfologia. Il controllo negativo dovrebbe avere un monostrato uniforme epuò essere utilizzato come controllo di riferimento. </li><li> Determinare il titolo virale del campione magazzino prendendo il numero medio di placche di diluizione e l&#39;inverso del fattore di diluizione totale. </li></ol><img alt="Equazione 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> NOTA: Come esempio, 30 e 32 placche contato per replicati del 1 x 10 -7 diluizione [31 (medio) / 10 -7 (diluizione) x 0,4 ml (inoculo)] produrrebbe un titolo di 7,75 x 10 8 pfu / ml.

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The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

Il fattore più critico per un saggio di placca successo risiede nella ottimizzazione del protocollo per la coltura virale specifico in questione come condizioni possono variare significativamente. Punti chiave da prendere in considerazione sono: ospitare la compatibilità cellulare con il virus in questione, adeguate condizioni di crescita virale, gli intervalli di diluizione sufficienti al fine di distinguere chiaramente placche, e la selezione di sovrapposizione corretta e colorazione per le cellule e virus in questione. Mentre VeeV e RVFV sia crescere in condizioni molto simili utilizzando molti degli stessi tipi di cellula ospite, differenze di placca morfologia e cinetica di crescita variano notevolmente. Quando si utilizza cellule Vero per le prove di placca, che sono stati tradizionalmente utilizzati come una linea cellulare di propagazione e indicatore virus della febbre emorragica e alfavirus, VeeV cresce in genere a titoli più elevati rispetto RVFV e dimostra aumentato la cinetica di replica, lo sviluppo di placche di grandi dimensioni uniformi a 48 hpi 4, 10-12. In contrasto VeeV, RVFV richiede 72 hpi e dimostra placche che sono in genere molto più piccoli e di dimensioni variabili. In opposizione a RVFV e VeeV, il virus dell&#39;influenza è altamente cellula ospite specifico e può essere difficile da diffondere attraverso la cultura dei tessuti. Per il virus dell&#39;influenza, l&#39;ingresso del virus e la fusione è normalmente attivate dal legame del recettore sulla superficie cellulare con la glicoproteina virale hamagglutinin (HA), che media l&#39;ingresso nella cellula bersaglio attraverso il legame con il recettore di superficie di acido α-sialico della cellula ospite. HA è una glicoproteina trimeric che è presente nella busta membrana di tutti i virus influenzali e richiede fenditura nella subunità HA1 e HA2 da una proteasi specifica cellula ospite. A complicare ulteriormente la questione, questi siti di rottura possono spesso variare tra i ceppi virali 13. In quanto espressione di proteasi capaci di scindere HA è limitato a specifici tessuti, proteasi are spesso aggiunto al mezzo di coltura per facilitare la fusione e l&#39;ingresso del virus nella cellula ospite selezionata 13. TPCK-tripsina è un esempio di una proteasi di uso comune che viene utilizzato in colture cellulari sia MDCK e cellule Vero: agevolare replica multi-ciclo (in assenza di siero inattivare la tripsina) attraverso l&#39;attivazione proteolitica di HA virale 14,15. Come dimostrato in questo studio e di altri, le differenze di cicli di vita virali possono influenzare le selezioni di sovrapposizione, formati lastra, e dei tempi di incasso, con variazioni significative tra le classi diverse e specie di virus. Nel nostro studio, le sovrapposizioni di agarosio dimostrato placche più chiare a titoli più elevati rispetto sia CMC o sovrapposizioni liquidi sia per RVFV e virus dell&#39;influenza B, rafforzando la sua utilità tra una vasta gamma di virus e tipi di cellule. Utilizzando una bassa concentrazione finale di agarosio grande aiuto nel rimuovere i tappi solidi e colorazione semplificata. CMC generale ha dimostrato la poorest efficacia come un overlay per tutti e tre i virus testati e prodotti molto piccoli e indistinti placche per il virus dell&#39;influenza B. Anche se nel complesso CMC ha dimostrato le caratteristiche meno desiderabili, il suo uso in rapida crescita ed estremamente virulenti virus potrebbe rivelarsi vantaggiosa, come ha fatto apparire per ridurre le dimensioni della placca con solo una riduzione minima del titolo. La sovrapposizione del liquido si è rivelato il più versatile che era estremamente semplice da preparare, maggiore facilità di utilizzo, ed era paragonabile a agarosio su tutti i virus selezionati. In un formato piatto throughput più elevato a 96 pozzetti, l&#39;applicazione e la rimozione non è stata inibita a causa di solidificazione come con sovrapposizioni tradizionali, e ha fornito risultati accurati e coerenti. Una considerazione quando si utilizza sovrapposizioni liquido sta nella colorazione opaca e l&#39;incapacità di controllare la formazione della placca come le piastre non possono essere spostati fino al punto di raccolta, limitando questo adattamento per virus con una cinetica di replicazione precedentemente caratterizzati. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Le modifiche secondarie in condizioni di analisi della placca possono alterare significativamente i risultati, e la valutazione e le prestazioni di un nuovo sistema o tecnica è sempre garantito. Mentre un protocollo di test targa ottimizzato e standardizzato non esiste per ogni situazione, il nostro rapporto dimostra la versatilità e facilità d&#39;uso in tradizionale così come overlay liquidi innovativi per analisi di placca, fornendo un&#39;esperienza sufficiente per ulteriori modifiche da parte dell&#39;utente.

L&#39;isolamento e la quantificazione accurata di campioni virali vitali è stata sempre un obiettivo di ricerca in corso in virologia. Non è stato fino all&#39;avvento del saggio di placca nel 1952 che un mezzo per calcolare quantitativamente e qualitativamente titoli virali di origine animale per la prima volta messo a punto 1,2. Questa tecnica è stato adattato e modificato da saggi fagi, che era stato precedentemente utilizzato per calcolare titoli azionari di batteriofagi in biologia vegetale 1,2. Mentre mezzi alternativi per la quantificazione virale da allora sono stati sviluppati e adattati, come ad esempio immunologiche, fluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione, il rilevamento degli impulsi resistivo regolabile (TRPS), citometria a flusso, sistemi di giornalista ricombinanti, e inverso quantitativa reazione a catena della polimerasi della trascrizione (qRT-PCR) , questi metodi non riescono a identificare e quantificare replica virons competenti 1,3. Mentre i progressi delle tecnologie e delle tecniche continuano a perfezionare e modificare il paesaggio; plaque saggi continuano a rappresentare il gold standard per determinare le concentrazioni virali infettive per virons litiche 1,4. Nel corso di un saggio di placca, un monostrato confluente di cellule ospiti è stato infettato da un virus litico di una concentrazione sconosciuta che è stata diluita in serie ad una serie numerabile, in genere tra 5-100 virioni. Monostrati infetti vengono poi coperti con un mezzo di copertura immobilizzante per prevenire l&#39;infezione virale da diffondere indiscriminatamente sia attraverso il flusso meccanico o convezione del mezzo liquido durante la propagazione virale. Mentre sono stati tradizionalmente utilizzati sovrapposizioni solidi o semisolidi come agarosio, metilcellulosa e carbossimetilcellulosa (CMC), sovrapposizioni liquidi sono diventati un&#39;alternativa sempre più attraente con lo sviluppo di nuovi strati liquidi come Avicel 5- 7. Saggi placca che utilizzano liquido contro le sovrapposizioni tradizionali presentano diversi vantaggi come la sovrapposizione può essere applicato a temperatura ambiente, e l&#39;applicazione e la rimozione è molto più semplice. Come sovrapposizioni liquidi non necessitano di riscaldamento, virus labili delicate e di calore possono anche risultare più facile placca. Dopo l&#39;infezione iniziale e l&#39;applicazione della sovrapposizione immobilizzare, singole placche o zone di morte cellulare, inizierà a sviluppare infezione e la replicazione virale sono vincolati al monostrato circostante. Cellule infettate continuerà il ciclo di replica-lisi-infezione si propaga ulteriormente l&#39;infezione, con conseguente placche sempre più distinti e discreti. A seconda della cinetica di crescita e di accoglienza delle cellule virale utilizzato, una targa visibile normalmente formare entro 2-14 giorni. Monostrati cellulari possono poi essere contate con un microscopio a campo chiaro normale, o più tipicamente fissi e contrastate dal rosso neutro o violento cristallo per identificare prontamente placche ad occhio nudo. Vi è un&#39;ampia varietà di macchie contatore placca disponibili, ciascuna offerta thEIR vantaggi e svantaggi specifici. Cristal violetto è tipicamente aggiunto nel punto di raccolta e dopo il fissaggio / rimozione della sovrapposizione, fornendo una macchia contatore rapida e distinta che consente l&#39;identificazione di piccole placche quando morfologia mista è presente. Rosso neutro ha il vantaggio di prima applicazione e il contatto costante con la sovrapposizione, consentendo il monitoraggio in tempo reale di sviluppare la formazione della placca, che è particolarmente utile quando si lavora con uno sconosciuto virus o di replica cinetica. Abbiamo però scoperto che la colorazione non è in genere distinto durante l&#39;utilizzo rosso neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) offre numerosi vantaggi, come le macchie gialle colorante cellule vive scuro placche blu e virali possono essere contati senza rimozione della sovrapposizione come con rosso neutro. L&#39;elevato contrasto tra cellule vive e morte offerte dalla MTT permette anche la rilevazione di piccole placche in un momento precedente l&#39;infezione punto di post, Anche se lo stoccaggio sarebbe comunque richiedere la rimozione della sovrapposizione 8. Come cristal violetto può essere fatta semplicemente in una soluzione di acqua e alcol, e fornisce un elevato grado di sensibilità per la morfologia di placca mista, abbiamo scelto come un contatore macchia preferito e semplificato per il protocollo dimostrato come stiamo utilizzando diverse famiglie di ben virus caratterizzati. Dopo aver sistemato e colorare il monostrato cellulare infetto, placche sono contati per poi titolare azionari campioni virali in termini di unità formanti placca (PFU) per millilitro. Una goccia registro deve essere osservata tra diluizioni seriali e, a seconda delle dimensioni piatto, tra 5-100 placche contati, con un controllo negativo utilizzato come riferimento. Campioni statisticamente possono variare del 10% per ogni 100 placche contati quando si confrontano campione replica 3. Il vantaggio di utilizzare saggi placca per determinare i titoli virali risiede nella loro capacità di quantificare il numero effettivo di particelle virali infettive well&#39;ambito del campione. Come più virioni potrebbero potenzialmente infettare una singola cella, la terminologia di unità rispetto virons viene utilizzato durante titolazioni placca 1,2. La morfologia della placca può variare notevolmente in condizioni di crescita differenti e tra le specie virali. Dimensione della placca, la chiarezza, la definizione dei bordi, e la distribuzione dovrebbero essere annotate in quanto possono fornire informazioni preziose sui fattori di crescita e di virulenza del virus in questione. Principi di base del saggio di placca possono anche essere adattate e modificate in vari modi diversi, ad esempio nell&#39;uso di focus formare saggi (FFA). FFAs non si basano su lisi cellulare e di contrasto per rilevare la formazione della placca, ma piuttosto impiegano tecniche per rilevare direttamente le proteine ​​virali intracellulari mediante anticorpi marcati immunoistochimica. Aumento della sensibilità, riduzione tempi di incubazione dopo l&#39;infezione, e, soprattutto, la capacità di quantificare i virus non-litici sono tutti distintivantaggi quando si impiegano FFAs. Mentre ampiamente utilizzati, i fattori critici limitanti in FFAs differenziano un saggio di placca tradizionale risiede nella necessità di anticorpi appropriati e la capacità di rilevarne solo subunità proteiche virali infettive rispetto virons attuale 4. Ai fini di questo studio, ci limiteremo la nostra discussione di saggi placca classica e descrivere l&#39;uso di strati solidi e semisolidi tradizionali (agarosio e CMC), insieme a nuovi liquido microcristalline sovrapposizioni di cellulosa.

<table><tbody><tr><td>6-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>12-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>96-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>96-2ml deep well plate</td><td>USA Scientific</td><td>C15046314</td><td>For serial dilutions</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112 013 101</td><td>Cell Media/Diluent</td></tr><tr><td>2x EMEM for plaques</td><td>Quality Biologicals</td><td>115 073 101</td><td>Warm to 37 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>MEM 100x&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>Heat inactivate before use at 62 &amp;#176;C for 30 min</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol denatured Reagent Grade</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BioPolymer USA</td><td>RC-591 NF</td><td>Shake vigorously when reconsitiuting&amp;nbsp; for &gt;30 min to homogenize</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

Saggi placca rimangono uno dei metodi più accurati per la quantificazione diretta di virons infettivi e sostanze antivirali attraverso il conteggio delle placche discreti (unità infettive e le zone morte cellulare) in coltura cellulare. Qui mostriamo come eseguire un saggio di placca di base, e come sovrapposizioni e tecniche differenti in grado di influenzare la formazione di placca e la produzione. Tipicamente substrati sovrapposizione solidi o semisolidi, come agarosio o carbossimetilcellulosa, sono stati utilizzati per limitare la diffusione virale, impedendo l&#39;infezione indiscriminata attraverso il terreno di coltura liquido. Sovrapposizioni immobilizzati limitano infezione cellulare per il monostrato immediatamente circostante, consentendo la formazione di foci discreta numerabile e la successiva formazione della placca. Per superare le difficoltà insite nell&#39;uso sovrapposizioni tradizionali, una sovrapposizione di liquido romanzo utilizzando cellulosa microcristallina e carbossimetilcellulosa di sodio è stato sempre più utilizzato come sostituto nella normasaggio di placca. Overlay test placca liquidi possono essere facilmente eseguite in entrambi i formati lastra e standard di 6 o 12 secondo le tecniche tradizionali e non richiedono attrezzature speciali. Grazie al suo stato liquido e successiva facilità di applicazione e rimozione, formati lastra microcultura possono inoltre essere utilizzati come un rapido, preciso e throughput elevato alternativa titolazioni virali scala più grande. L&#39;uso di un polimero liquido viscoso riscaldato non offre la possibilità di snellire il lavoro, conserva i reagenti, spazio incubatore, e aumenta la sicurezza operativa quando viene utilizzato nei laboratori tradizionali o alti di contenimento, come il riscaldamento del reagente o vetreria sono obbligatori. Sovrapposizioni liquidi possono anche rivelarsi più sensibili di overlay tradizionali per alcuni di calore virus labili.

La capacità del test di placca per valutare con precisione titoli virali si basa su numerosi fattori: la selezione della cellula ospite appropriato, i media adeguati e condizioni di crescita per la vitalità cellulare e virale, la propagazione virale immobilizzato, e una determinazione accurata del periodo di incubazione del virus per consentire un tempo adeguato per distinti e la formazione della placca numerabile. Per questo studio, i virus provenienti da tre famiglie rappresentativi sono stati scelti per dimostrare le differenze di: selezione overlay, periodi di incubazione, e la morfologia della placca attraverso diversi tipi di campioni. Encefalite equina venezuelana (VeeV) è stato scelto come modello virale (+) ssRNA, che può causare significative malattie nelle specie equina e gli esseri umani e rappresenta la famiglia Togaviridae. Influenza B Taiwan ceppo, un segmentato (-) ssRNA virus di infettare gli esseri umani in primo luogo, rappresenta la famiglia Orthomyxoviridae. Rift Valley virus della febbre (RVFV), una - virus ssRNA artropode nato infettare principalmente artropodi, ()ruminanti e gli esseri umani, è stato selezionato come rappresentante della famiglia Bunyaviridae. Per RVFV (figura 1), i titoli sono stati determinati da una soluzione madre di un ricombinante vivo attenuato ceppo MP12 di RVFV in un formato a 12 pozzetti utilizzando CMC, agarosio, o sovrapposizioni Avicel che sono state incubate side-by-side per la post infezione 72 ore (hpi). Un piatto rappresentante che mostra diluizioni che vanno da 10 -4 a 10 -7 può essere visto in Pannello di A. placche con CMC e sovrapposizioni di agarosio ha mostrato piccole, chiare e distinte placche con un bordo circolare ben definito. Le placche con una sovrapposizione di liquido erano leggermente più abbondanti e più grande rispetto a agarosio e placche CMC, e hanno fornito un bordo meno distinte. Titoli virali sono stati confrontati in Pannello B con tutte le sovrapposizioni di eseguire in modo paragonabile. Per ottenere un confronto visivo più chiara tra overlay per MP12 insieme con un campione più grande per determinare riprodubilità, una piastra 6 pozzo è stato anche trialed in triplice copia (Figura 2). Nel formato piastra 6 bene, l&#39;uso di una sovrapposizione CMC mostrato placche più piccole sia sovrapposizioni agarosio o liquide, che erano di dimensioni paragonabili a vicenda. Mentre titoli virali sono risultati simili tra i tre strati (pannello D), placche formate in sovrapposizioni di agarosio e liquidi dimostrato più facile contare a causa della loro maggiore dimensione. In contrasto con RVFV, titoli VeeV e morfologia della placca tra le sovrapposizioni differenti variava notevolmente (Figura 3A). Le placche costituite sovrapposizioni CMC dimostrato una morfologia chiara e distinta quando si utilizza un formato a 12 pozzetti, a scapito della dimensione e sensibilità della placca (Pannello B). In contrasto con CMC, l&#39;uso di agarosio e liquidi sovrapposizioni provocato placche significativamente più grandi, indicando l&#39;inibizione virale inferiore e maggiore sensibilità alla replica VeeV. Ciò è stato già confermato quando si confrontano esclusivamente agarosio contro CMC in apaper pubblicato da Juarez et al. 4. Mentre agarosio e liquidi sovrapposizioni prodotte placche più grandi di CMC, le placche erano mal definiti confini ed erano difficili da contare in un formato 12 bene, con sovrapposizioni liquidi che forniscono la massima diffusione confine. Quando placche erano trialed in 6 pozzetti (Figura 4), ​​il più grande formato 6 ben negato il rilascio di apertamente grandi placche che sono difficili da differenziare in formato 12 bene, con agarosio e sovrapposizioni liquidi comprovanti superiore alle sovrapposizioni CMC in termini di definizione placca e sensibilità (Figura 4D). In confronto a RVFV o VeeV, l&#39;influenza fornisce diverse sfide uniche quando plaquing, come l&#39;obbligo di un proteasi esterna. La sensibilità del virus dell&#39;influenza a diverse selezioni di sovrapposizione è stato ben documentato in passato come cambiamenti significativi sono stati notati quando le modifiche come minori come marche di agarosio differenti hanno essereen usato 9. È interessante notare che per il ceppo influenzale B Taiwan, l&#39;uso di CMC come sovrapposizione provocato placche marcatamente più piccoli che sono difficili da contare e dimostrata difficilmente segnare affidabile (Figura 5A). L&#39;uso di una sovrapposizione agarosio fornito i migliori placche (pannello C), e portato a una macchia sfondo più scuro (probabilmente dovuto alla maggiore redditività monostrato), e ha mostrato placche chiare e nitide in confronto diretto con l&#39;uso della sovrapposizione liquido (Pannello B ). Un vantaggio di polimeri liquidi oltre sovrapposizioni solidi o semisolidi, come agarosio e CMC, sta nella facilità di rimozione e applicazione. Sovrapposizioni semiduri richiedono riscaldamento, e solidificazione possono risultare problematico durante la manipolazione e la rimozione. Al fine di capitalizzare questi vantaggi e per determinare la praticità di utilizzare Avicel in modo high-throughput per RVFV, un formato a 96 pozzetti è stato trialed a vari concentrazi overlayons (Figura 6). Per RVFV MP-12, diluizioni sono state eseguite in quadruplicato in entrambi 0.6 e 1.2% concentrazioni finali di Avicel. Applicazione e rimozione Overlay dimostrato semplice, senza differenze apparenti tra replicati o tra concentrazioni notato, dimostrando un alto grado di riproducibilità. Quando segnando, placche erano distinte e numerabile ad occhio nudo, dimostrando la fattibilità di utilizzare sovrapposizioni liquidi in modo elevato throughput per RVFV. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Figura 1:. RVFV placca confronti di sovrapposizione utilizzando piastre da 12 pozzetti Veros sono stati piastrati a 2,5 x 10 5 cellule in piastre da 12 pozzetti e infettati con 200 microlitri utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di MP12. Dopo l&#39;infezione 1,5 ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% CMC (c finaleconcentrazioni del), sono stati applicati al fine di confrontare direttamente le sovrapposizioni come dimostrato nel Pannello di A. placche sono stati contati e titolato nel Pannello B. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Figura 2:. RVFV placca confronti di sovrapposizione che utilizzano 6 pozzetti Veros sono stati piastrati a 5 x 10 5 cellule in 6 pozzetti e infettati con 400 microlitri utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di MP12. Tre ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel o 1% CMC, sono stati applicati al fine di confrontare le sovrapposizioni come dimostrato nel Pannello A, B, e C. esperimenti indipendenti sono stati eseguiti in modo identico come descritto per pannelli AC, con placche contati e titolati nel Pannello di D (N = 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figura 3: &lt;strong&gt; confronti di sovrapposizione VeeV placca utilizzando piastre da 12 pozzetti. Veros sono stati piastrati a 2,5 x 10 5 cellule in piastre da 12 pozzetti e infettati con 200 microlitri utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluito del ceppo del vaccino VeeV TC-83. Dopo l&#39;infezione 1,5 ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% CMC, sono stati applicati al fine di confrontare direttamente le sovrapposizioni come dimostrato nel Pannello di A. placche sono stati contati e titolato nel Pannello di B. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Figura 4:. V EEV confronti placca di sovrapposizione che utilizzano 6 pozzetti Veros sono stati piastrati a 5 x 10 5 cellule in 6 pozzetti e infettati con 400 microlitri utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di VeeV TC-83. Dopo l&#39;infezione, 3 ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel, o un 1% di CMC, sono stati applicati al fine di confrontare le sovrapposizioni come dimostratoin pannelli A, B e C. esperimenti indipendenti sono stati eseguiti in modo identico come descritto per Pannelli A - C, con placche contati e titolato in Pannello D (N = 3). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figura 5: Influenza confronti overlay placca cellule MDCK sono state piastrate a 5 x 10 5 cellule in 6 pozzetti e infettati con 400 ml di inoculo utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di influenza B Taiwan.. N siero fetale bovino (FBS) è stato utilizzato nei mezzi crescita o sovrapposizioni, come FBS può inibire influenza la propagazione attraverso l&#39;inibizione di alcune proteasi che sono necessari per la fusione virale. TPCK-tripsina inserito in tutti gli overlay prima dell&#39;applicazione al fine di facilitare la fusione virale e voce con le cellule ospiti. Dopo l&#39;infezione, 3 ml sovrapposizioni di agarosio 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% CMC sono stati applicati al fine di confrontare direttamentele sovrapposizioni come dimostrato nel riquadro A, B e C. esperimenti indipendenti sono stati eseguiti in modo identico come descritto Pannelli A - C, con placche contati e titolato in Pannello D (N = 3). Mentre in media è stata presa per placche CMC si sono dimostrati difficili da contare in modo affidabile come hanno dimostrato le frontiere diffuse e piccolissime dimensioni della placca. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Figura 6:. Alta velocità effettiva sovrapposizioni placca A 96 pozzetti di Veros placcato a 3 x 10 4 cellule per pozzetto, sono stati infettati con 50 ml di inoculo utilizzando lo stesso campione di partenza in serie diluita di RVFV MP12 per 1 ora, in quattro esemplari. Per le sovrapposizioni, 0.6 e 1.2% concentrazioni finali di Avicel stati trialed per determinare la fattibilità e la riproducibilità di utilizzare sovrapposizioni liquidi in maniera high throughput, pannelli A e B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VeeV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo di cella </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Periodo di infezione </td><td> 1 ora </td><td> 1 ora </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Tempo di incubazione </td><td> 3 giorni </td><td> 2 giorni </td><td> 3 giorni </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Targa del saggio di inoculazione Condizioni e cellulari Tipi <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VeeV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo di cella </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Tipo di Crescita</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Targa media </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco Modified Eagle Medium supplementato con 10% siero fetale bovino, 1% L-glutammina, 1% Penicllin / streptomicina. 2. Dulbecco Modified Eagle Medium integrato con 1% di L-glutammina, 1% Penicllin / streptomicina, 0,2% sieroalbumina bovina, lo 0,025% HEPES, DEAE-Destrano 50ug / ml. A. 2x minimo supporto essenziale (500 ml) supplementato con 5% FBS (25 ml), 1% minimo amminoacidi essenziali (5 ml), 1% di sodio piruvato (5 ml), 1% L-glutammina (5 ml), 2% Pen / Strep (10 ml). B. 2x minimo supporto essenziale (500 ml) integrato con 0,2% sieroalbumina bovina, un 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-Destrano, tripsina-TPCK * * Poco prima della preparazione, aggiungere 1 ml ogni 25ml di 2 mg / ml di brodo TPCK-tripsina alla aliquota che verrà utilizzato per mescolare con agarosio per placche. Tabella 2: Placca e Viral / Cellular crescita Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VeeV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo di cella </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Periodo di infezione </td><td> 1 ora </td><td> 1 ora </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Tempo di incubazione </td><td> 3 giorni </td><td> 2 giorni </td><td> 3 giorni </td></tr></tbody></table> Le soluzioni di sovrapposizione non scadono quando fatto fino a quando la sterilità è mantenuta. Tabella 3: Sovrapposizioni Archivio <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 bene </td><td> 12 bene </td><td> 96 bene </td></tr><tr><td> # Di cellule / pozzetto </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Volume di inoculum (ml) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> volume di sovrapposizione (ml) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0,100 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: formati lastra

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Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Determinazione Concentrazione Attraverso placca saggi: Sistemi overlay per mezzo di tradizionali e nuovi

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

111.8K Views.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

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Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Saggio di placca per Norovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

Tecniche di laboratorio asettico: Metodi Placcatura

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biologia

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Generazione, amplificazione e titolazione del virus sinciziale respiratorio ricombinante

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

Plaquing di herpes simplex virus

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

Propagazione del virus e quantificazione colorimetrica cellulare

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

High-throughput Titolazione della luciferasi che esprimono ricombinanti virus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

Saggio delle placche: un metodo per determinare il titolo virale in unità formanti placca (UFP)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

Didattica

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Biologia avanzata

Microbiologia

Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay

Source: Yadavalli, T., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/62195">Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the method to perform a plaque assay using a virus obtained from infected porcine cornea. The porcine cornea is used to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

Determinazione dell'efficacia antivirale di farmaci sperimentali attraverso un test a placca

1. Virus infection quantification
NOTE: Virus titers from porcine corneas should be evaluated every day to analyze the effect of drug treatment.

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Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

A Viral Attachment Assay for Screening of Antiviral Compounds

Source: Tai, C. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53124">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a viral attachment assay for screening antiviral compounds. Using genetically modified hepatitis C virus and luciferase, it assesses inhibitory effects on viral attachment, as indicated by lower light intensity in co-treated wells compared to wells treated with the virus alone.

Un test di attacco virale per lo screening di composti antivirali

NOTE: Ensure that all procedures involving cell culture and virus infection are conducted in certified biosafety hoods that are appropriate for the ...