We are grateful to the Canadian Institutes of Health Research (grant MT-5877), the National Institutes of Health (grants NS058668 and NS066664), and the US-Israeli Binational Foundation (grant 2003222) for funding these studies.

Sono stati effettuati i protocolli sperimentali su ratti femmine lungo Evans (250-350 g) in conformità alle linee guida per la cura degli animali e uso federale prescritti e sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso l&#39;Università della California a San Diego. 1. acclimatare il Ratto di Corpo Restraint NOTA: Posizionare il ratto su una dieta ristretta. Alimentare il topo una volta al giorno immediatamente dopo ogni sessione di trattamento al giorno per ambientarsi il ratto al sistema di ritenuta (descritto di seguito). Fornire abbastanza alimentazione per mantenere l&#39;animale al 80% del suo peso iniziale. Tale importo è di circa 6 grammi di mangime al giorno per 250 g femminile di lunga Evans ratto. <ol><li> Acclimatare il ratto di essere manipolati da esseri umani. Frenare delicatamente il ratto a mano per periodi di circa 5 sec ogni 30 sec. Fate questo per 15 minuti al giorno su 2 giorni consecutivi. Monitorare i ratti al giorno per i segni di stress durante il periodo di formazione. Segni includono lottando iRisposta n a moderazione, la vocalizzazione, e denti chattering. </li><li> Al 3 ° giorno, collocare il ratto in un panno calzino-limitante corpo (Figura 1) per 15 minuti al giorno per due giorni consecutivi. </li><li> Al 5 ° giorno, posizionare il ratto all&#39;interno della calza, e posizionare il calzino all&#39;interno di un tubo rigido sulla maschera sperimentale (Figura 4). Lasciare il ratto nel tubo per 15 min al giorno su 2 giorni consecutivi. </li><li> Concime subito il ratto dopo ogni sessione di allenamento. Al termine dell&#39;ultima sessione (6 ° giorno) darà accesso illimitato al cibo. Selezionare per l&#39;impianto solo i topi che non presentano segni di stress eccessivo l&#39;ultimo giorno di allenamento. NOTA: Sebbene selezione di ratti per l&#39;impianto è soggettiva, nelle nostre mani oltre il 90% dei ratti sono stati trovati per essere sensibili alle assuefazione e in grado di subire l&#39;impianto. </li></ol> 2. Impianto del meccanismo di camera di registrazione e poggiatesta <ol><li> Fare un reconferenza filo da saldatura filo di acciaio inossidabile nudo a un connettore pin. Tagliare il filo in modo che resti 3-5 mm scoperti dal perno. Sterilizzare il filo di riferimento, insieme a tutti gli strumenti chirurgici. </li><li> Somministrare ketamina / xylazina anestesia. Somministrare 95 mg / kg ketamina mescolato con 5 mg / kg per via intraperitoneale xilazina. La dose iniziale dura 1½ a 2 ore. Supplemento anestesia ogni 30-45 minuti, successivamente, se necessario. Lubrificare occhi dell&#39;animale con una pomata oftalmica. </li><li> Controllare il riflesso recesso punta per determinare il piano di anestesia, e mantenere l&#39;anestesia, se necessario. </li><li> Posizionare il topo in una cornice di partecipazione stereotassico con barre orecchio (Figura 3A). Radersi i capelli sulla testa e disinfettare la ferita con povidone-iodio (soluzione al 10%). Fare attenzione a inserire le barre di orecchio in modo appropriato in modo che non danneggino il timpano. Barre di orecchio con punte smussate sono preferibili. </li><li> Praticare un&#39;incisione con un approxi bisturinell&#39;intervallo lungo la linea mediana del cranio dal livello rostro-caudale degli occhi alla parte posteriore delle orecchie. Utilizzare forbici per tagliare e rimuovere una striscia di 2-3 mm di cute su entrambi i lati dell&#39;incisione. </li><li> Raschiare periostio per esporre la superficie del cranio verso le creste laterali. Coprire il cranio esposta con sottile strato di colla. </li><li> Praticare un piccolo foro con un diametro leggermente inferiore rispetto 0-80 viti, utilizzando un trapano bava ½ mm di diametro (vedi sezione Materiali). Praticare il foro posteriormente immediatamente a dove la sutura bregma incontra la cresta laterale, e con un angolo di 30-45 ° nel cranio, in modo che la vite può andare a cima più laterale rispetto al fondo. </li><li> Avvitare una vite 0-80 macchina a fondo piatto al foro (circa 3 giri), a 30-45 °. Fare attenzione a non avvitare troppo profondamente per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale sottostante. </li><li> Ripetere questa procedura per 6 viti supplementari nella configurazione mostrata <strong&gt; (Figura 3B). Applicare colla alla base di tutte le viti. </li><li> Inserire un ago della siringa nel manipolatore stereotax. Misurare dalla sutura bregma, e fare un&#39;ammaccatura nel cranio con l&#39;ago vicino, ma al di fuori del luogo craniotomia desiderata, come un marchio di riferimento. NOTA: In questa dimostrazione, le coordinate stereotassica del marchio sono di 3 mm posteriori e 1 mm laterali alla sutura bregma. </li><li> Segna il dente con un pennarello indelebile. Nota le coordinate stereotassica del marchio, in quanto servirà come punto di riferimento stereotassico (Figura 3B). </li><li> Fare una craniotomia centrato sulle coordinate desiderate (da 3 mm posteriormente e 3 mm laterali bregma in questo esempio). Lasciare la dura madre intatto. Coprire la craniotomia con liquido cerebro-spinale artificiale modificato (125 mM NaCl, il glucosio 10 mM, HEPES 10 mM, 3,1 mM CaCl 2, 1.3 mM MgCl 2, pH 7.4) 13 (Figura 3C). </li&gt; <li> Tagliare un tubo di 0,2 ml centrifuga a 4 - 5 mm di lunghezza, e tagliare il tappo. Posizionare il tubo sul cranio e centrare la craniotomia. </li><li> Applicare cemento dentale intorno alla parte inferiore del tubo per sigillare la base del tubo al cranio. Fare attenzione a non far trapelare il cemento in craniotomia esposta (Figura 3D). </li><li> Praticare un piccolo foro (circa ½ mm di diametro) nella piastra cranica controlaterale e inserire delicatamente il filo di riferimento. Costruire il filo di riferimento saldando un perno che si interfaccia con l&#39;amplificatore registrazione alla fine del filo (vedi sezione Equipment). Non spostare il cavo di riferimento una volta che è nel cervello in quanto ciò potrebbe causare danni. </li><li> Applicare colla al foro in cui è stato inserito il filo. Questo sigillare il perno e il filo in luogo temporaneamente. </li><li> Mescolare le due parti del kit gel di silicone (vedere la sezione Materiali) in porzioni di circa uguali. Attendere due minuti per la miscelazione e fill provetta di circa ⅓ completo con il gel. </li><li> Fissare un diritto pinza angolare posta (vedere la sezione Materiali) alla barra di poggiatesta. Fissare la piastra di testa (figura 2A) per la barra di tenuta (Figura 2B) con un angolo di passo di 45 ° in modo che la parte inferiore della piastra sia verso il naso dell&#39;animale. È utile utilizzare un inclinometro per impostare l&#39;angolo di inclinazione corrispondente a quello della dima sperimentale (Figura 4). </li><li> Fissare la barra di tenuta al braccio stereotax manipolatore in modo che la barra sia parallela alle barre orecchio. Abbassare la barra e la piastra in modo che la piastra è posteriore della sutura lambda e anteriore al caudale più a vite. </li><li> Afferrare la testa bullone anteriore (a 8-32 perno o vite, vedere la sezione Materiali) a circa 45 ° con una mano aiutando braccio e pinza, in modo che la testa della vite rivolto verso il basso e verso la coda dell&#39;animale. Abbassare la vite in modo che tocchi la formicaerior 0-80 viti (Figura 3F, G). </li><li> Fissare il bullone e la piastra in posizione con acrilico dentale. Applicare acrilico dentale attorno alle teste delle viti dell&#39;osso, perno di riferimento, e intorno ai lati del tubo da centrifuga. Attendere circa 10 minuti per l&#39;acrilico dentale asciugare (Figura 3H). </li><li> Applicare uno strato di cemento dentale attorno ai bordi del acrilico dentale, cementando la pelle per l&#39;impianto. Attendere che il cemento si asciughi. </li><li> Poke diversi fori nel tappo della provetta, e posizionare il tappo sul tubo. </li><li> Rimuovere la fascetta mani aiutare. Quindi rimuovere con attenzione la barra testa-holding dalla stereotax, e quindi rimuovere la piastra testa dalla barra (Figura 3I). </li><li> Rimuovere l&#39;animale dal stereotax e amministrare cure post-operatorie e il monitoraggio in conformità con tutte le norme, i regolamenti e le leggi (ad esempio, Buprenorfina 0,02 mg / kg, ogni 8-12 ore per un minimo di 24hr). Se l&#39;infiammazione si sviluppa intorno ai bordi della protesi, applicare uno strato sottile di unguento antibiotico al sito interessato giorni fino risolto. </li></ol> 3. Juxtacellular monitoraggio delle unità neuronali <ol><li> Tirare il tubo capillare di quarzo su un anidride carbonica micropipetta laser estrattore (vedi sezione Equipment) con diametro di punta di meno di 1 micron (Figura 5A). NOTA: i parametri di riscaldamento variano a seconda del particolare strumento, e che il diametro del collo richiesto varierà a seconda della struttura cerebrale di interesse. Per le registrazioni nel ratto talamo, micropipette sono colli che vanno da 5-7 mm. </li><li> Fissare la pipetta in luogo sotto un contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopio equipaggiato con obiettivi distanza di lavoro. Utilizzare plastilina per tenere la pipetta in posizione sul palco del microscopio. </li><li> Lentamente spostare un blocco di vetro (0,5 - 1 cm di spessore, un pezzo di vetro usato per making coltelli ultra-microtomo è conveniente) nel campo visivo, con la punta della pipetta. Utilizzando il micromanipolatore fase, toccare delicatamente la punta della pipetta di vetro, provocando la rottura. Ripetere se necessario fino a quando il diametro esterno punta della pipetta è tra 1-3 micron (Figura 5B, C). Assicurarsi che questi micropipette hanno impedenze tra circa 5-15 MW. </li><li> Preparare salina extracellulare (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,2 con NaOH) 8 e aggiungere 2% (w / v) Chicago Sky blu. Usando una siringa con un ago 30 G o minore, riempire la estremità posteriore della pipetta con la soluzione. In alternativa, per singola cellula etichettatura juxtacellular aggiungere 2% (w / v) Neurobiotin o biotinilato ammina destrano (BDA-3000 o BDA-10000) alla soluzione salina al posto di Chicago Sky blu. </li><li> Posizionare il topo all&#39;interno della calza panno all&#39;interno del tubo rigido in adeguato maschera sperimentale ( <strong&gt; Figura 4) .Wait un minimo di 72 ore dopo l&#39;intervento chirurgico prima di mettere l&#39;animale in maschera poggiatesta. Stringere la coulisse intorno sterno superiore, piuttosto che il collo, per evitare l&#39;ostruzione delle vie aeree. Se la respirazione sembra essere lavorato o ostacolato, allentare la coulisse o spostarlo posteriormente. Effettuare questa procedura, mentre il topo è vigile. </li><li> Fissare la piastra di testa di ritenuta sul ratto al pezzo corrispondente sulla maschera. Per fare questo, prima pin la piastra poggiatesta in luogo, e poi fissarlo con una vite 4-40. Ricordarsi di aspettare fino a quando l&#39;animale è calma per evitare di applicare una coppia eccessiva alla testa. Successivamente, posizionare un 8-32 dado sul bullone testa frenare che viene impiantato nel topo. Quindi avvitare in un tondino di acciaio inossidabile filettato per la testa del bullone. Fissare l&#39;asta alla maschera sperimentale in modo tale che possa essere serrato in posizione (figura 4). NOTA: Protezione animale con testa del bullone e la piastra poggiatesta minimizes piegatura dell&#39;apparato e migliora la stabilità di registrazione. Nella maggior parte dei casi la registrazione può iniziare il primo giorno l&#39;animale è capo-trattenuto. Tuttavia, se l&#39;animale si agita eccessivamente o vocalizza, fornire una giornata di formazione assuefazione poggiatesta prima di iniziare le registrazioni. In questo caso, l&#39;animale lasciato sulla maschera per 15 min e poi riposizionarlo nella sua gabbia. Ripetere questo passaggio il giorno successivo e continuare con il protocollo. </li><li> Aprire la camera di registrazione e rimuovere il gel di silicone. Pulire la craniotomia utilizzando una pinza sottile se il tessuto è nuovamente cresciuta in craniotomia. </li><li> Fissare la pipetta al micromanipolatore motorizzato, e collegare il headstage pre-amplificatore. NOTA: Nel presente dimostrazione, un piccolo circuito relè sul headstage viene utilizzato per passare i cavi amplificatore e una sorgente di corrente esterna con alta compliance (Figura 6A-C). Si noti che alcuni amplificatori hanno un adeguato incasso sorgente ad alta compliance(Vedi la discussione e Materiali sezioni). </li><li> Utilizzare il micromanipolatore motorizzato per spostare la punta della pipetta a volume stereotaxically identificato nella camera di registrazione. Nota le coordinate di questa posizione. Fare attenzione a non rompere la punta della pipetta sul cranio. </li><li> Spostare la pipetta nella posizione di registrazione desiderata negli assi antero-posteriore e medio-laterale. Poi avanzare la pipetta ventrale attraverso la dura fino a quando non è di circa 500 micron dorsale nella posizione di registrazione prevista. </li><li> Lentamente avanzare la pipetta durante l&#39;ascolto di chiodare eventi su un monitor audio della tensione amplificata registrata tra la punta della pipetta e il filo di riferimento. Una volta che gli eventi spiking sono identificati, continuano a spostare la pipetta 0-100 micron fino positive deviazioni di tensione in corso superiori si osservano circa 500 mV. NOTA: La resistenza dell&#39;elettrodo aumenterà di un fattore di circa 1,5-10 when ciò si verifica. </li><li> Iniziare a registrare una volta una unità è stato isolato come secondo punto 3.11, insieme a tutte le altre misure comportamentali e fisiologici di interesse. Nel presente manifestazione, i movimenti delle vibrisse auto-generati sono monitorati con videografia ad alta velocità (vedere la sezione Materiali). </li><li> Per etichettare il sito di registrazione, passare l&#39;elettrodo porta per la connessione al generatore di corrente. Ci sono diversi modi per farlo, utilizzando un circuito di relè (Figura 6A - C), dotato di un generatore di corrente dell&#39;amplificatore, o manualmente (Figura 6D, vedere il punto 3.8 e discussione). Passare -4 μA con 2 impulsi sec al 50% duty cycle per 4 minuti di iniettare iontophoretically Chicago Blue Sky attraverso la pipetta. </li><li> Uccidere e profumato l&#39;animale dopo diverse procedure di etichettatura secondo la prassi consueta. Sezione del cervello e di contrasto se necessario per identificare la posizione anatomica della registrazione sederee. Controcolorare il tessuto per la citocromo ossidasi reattività secondo 14. In alternativa, individuare i depositi di Chicago Sky Blu usando la microscopia a fluorescenza. NOTA: Per distinguere con precisione tra le diverse unità etichettati, è importante che tutte le etichette sono realizzati con la stessa pipetta lo stesso giorno, senza che lo sbloccaggio la pipetta tra le etichette. In questo caso i siti di registrazione possono essere differenziati dai loro posizioni relative in istologia post-hoc insieme alle coordinate manipolatore noti di ogni sito (vedere il punto 3.9). Per l&#39;identificazione univoca, contrassegnare le etichette di almeno 200 micron l&#39;uno dall&#39;altro, e non più di 3-5 etichette per regione del cervello. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Costruzione della maschera sperimentale La descrizione delle parti meccaniche utilizzate per costruire la maschera sperimentale (Figura 4) viene omesso dal protocollo, in quanto può essere realizzato in una varietà di modi. In questo standard manifestazione sono utilizzati opto-meccaniche parti e morsetti di supporto per il montaggio del bar poggiatesta e il tubo di ritenuta corpo (vedere la sezione Materiali). Parti simili o...

Monitoraggio attività neuronale in un animale avviso attivamente impegnato in un compito comportamentale è fondamentale per comprendere la funzione e l&#39;organizzazione del sistema nervoso. Registrazione extracellulare dell&#39;attività elettrica dalle unità neuronali singole è stato a lungo uno strumento fiocco di sistemi neuroscienze ed è ancora ampiamente in uso al momento. Una varietà di tipi di elettrodi e configurazioni sono disponibili a seconda delle esigenze scientifiche e tecniche di un particolare esperimento. Cronicamente impiantati microdrive o schiere di elettrodi vengono spesso utilizzati in animali liberi di muoversi, compresi gli uccelli, roditori e primati non umani 1-4. In alternativa, penetrazioni acuti di metallo o di vetro microelettrodi tramite un micromanipolatore esterna sono spesso utilizzati per registrare da animali anestetizzati o testa-trattenuto. Elettrodi micropipetta di vetro hanno il vantaggio che possono essere utilizzati nel juxtacellular o &quot;cellule attaccate&quot; configurazione per isolare l&#39;ambiguitàattività dei neuroni singoli senza le complicazioni di picco post-hoc di ordinamento 5. Questi elettrodi consentono ulteriori registrazioni da cellule o posizioni anatomicamente identificati, in quanto possono essere utilizzati per iniettare piccoli depositi di tintura o neuroanatomici traccianti, o anche per riempire l&#39;individuo registrato cella. Questa configurazione è stata applicata con successo in ratti, topi e uccelli 6-10. La tecnica attualmente descritta si concentra sul monitoraggio juxtacellular e depositi tintura extracellulari in allerta, ratti testa-trattenuto. Si noti che a differenza di singola cellula juxtacellular riempie, questi depositi di colorante non forniscono informazioni sulla morfologia cellulare o proiezioni assonale 11, ma consentire la localizzazione anatomica esatta a circa 50 micron e, criticamente, hanno un rendimento significativamente più alto in allarme animali. Informazioni riguardanti unicellulare juxtacellular riempie viene comunque fornito come una strategia alternativa per l&#39;etichettatura anatomica. In breve, laprotocollo consiste di tre fasi principali. Nella prima fase, il ratto è acclimatati per contenzione corpo in un calzino stoffa (Figura 1) in un periodo di 6 giorni. Nella seconda fase, un apparato poggiatesta (Figura 2) e la camera di registrazione vengono impiantati chirurgicamente tale che il topo può essere mantenuta nel piano stereotassico durante più sessioni di registrazione successivi (Figura 3); questa procedura consente lo sperimentatore di mirare determinati regioni sub-corticali del cervello per lo studio elettrofisiologico in base a coordinate di riferimento standard 12. La terza fase prevede il posizionamento del ratto in una maschera appropriato per effettuare gli esperimenti comportamentali ed elettrofisiologici (Figura 4), ​​costruendo l&#39;elettrodo da un tubo di quarzo capillare (figura 5), effettuare registrazioni neuronali juxtacellular che inequivocabilmente isolano singole unità 6-9, e segnando i locati anatomicisul sito di registrazione con Chicago Sky colorante blu (figure 6 e 7). Le registrazioni sono eseguite con monitoraggio comportamentale simultanea; tuttavia, i dettagli tecnici del comportamento dipenderanno gli obiettivi scientifici di ogni esperimento e sono quindi oltre la portata di un unico protocollo. Dopo il completamento della procedura sperimentale, che può essere ripetuta più giorni, l&#39;animale è eutanasia. Il cervello viene estratto e lavorato secondo le tecniche neuroanatomiche standard utilizzando sia in campo chiaro e microscopia a fluorescenza.

<table><tbody><tr><td>Ketaset (Ketamine HCl)</td><td>Fort Dodge</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine solution)</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Betadyne (Povidone-Iodine)</td><td>CVS Pharmacy</td><td>269281</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495</td><td>Grainger Industrial Supply</td><td>4KL86</td><td>20 - 40 cp cyanoacrylate</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Grip cement powder</td><td>Dentsply Intl</td><td>675571</td><td>For the base of the recording chamber</td></tr><tr><td>Grip cement liquid</td><td>Dentsply Intl</td><td>675572</td><td>For the base of the recording chamber</td></tr><tr><td>Silicone gel</td><td>Dow Corning</td><td>3-4680</td><td></td></tr><tr><td>Jet denture repair acrylic powder</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>For securing the head restraint apparatus to the cranium</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>For securing the head restraint apparatus to the cranium</td></tr><tr><td>Chicago sky blue</td><td>Sigma</td><td>C8679</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>For perfusion and tissue fixation</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>For perfusion and tissue fixation</td></tr><tr><td>Cytochrome C</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td>For cytochrome-oxidase staining, &lt;strong&gt;Figure 7&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td>For cytochrome-oxidase staining, &lt;strong&gt;Figure 7&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Rat sock</td><td>Sew Elegant (San Diego, CA)</td><td>N/A</td><td>Custom made, &lt;strong&gt;Figures 1, 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PVC tube 2 &amp;frac12;&amp;rdquo;</td><td>U.S. Plastic Co.</td><td>34108</td><td>&lt;strong&gt;Figure 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Subminiature D pins &amp;amp; sockets</td><td>TE Connectivity</td><td>205089-1</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stainless steel music wire 0.010&amp;rdquo; diameter</td><td>Precision Brand Products, Inc.</td><td>21010</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereotaxic holding frame</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereotaxic ear bars</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 957</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereotaxic manipulator</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 960</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;frac12; mm drill burr</td><td>Henry Schein</td><td>100-3995</td><td></td></tr><tr><td>Quiet-Air dental drill</td><td>Midwest Dental</td><td>393-1600</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel 0-80 &amp;frac18;&amp;rdquo; screw</td><td>Fastener superstore</td><td>247438</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>0.2 ml centrifuge tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-407-8A</td><td>&lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Custom head-holding bar</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>Custom made, &lt;strong&gt;Figures 2 - 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Custom head-holding plate</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>Custom made, &lt;strong&gt;Figures 2 - 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Right angle post-clamp</td><td>Newport</td><td>MCA-1</td><td>&lt;strong&gt;Figures 3, 4&lt;/strong&gt;; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (&lt;strong&gt;Figure 4&lt;/strong&gt;) are also from Newport Corp.</td></tr><tr><td>8-32 &amp;frac34;&amp;rdquo; screw</td><td>Fastener Superstore</td><td>240181</td><td>For head-restraint, &lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-40 &amp;frac14;&amp;rdquo; screw</td><td>Fastener Superstore</td><td>239958</td><td>For head restraint, &lt;strong&gt;Figures 3, 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Quartz capillary tubing</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF-100-60-10</td><td>&lt;strong&gt;Figure 5&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Carbon dioxide laser puller</td><td>Sutter instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Motorized micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td>Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Microelectrode amplifier head stage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Isolated pulse stimulator</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2100</td><td>Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Audio monitor</td><td>Radio Shack</td><td>32-2040</td><td></td></tr><tr><td>Pipette holder</td><td>Warner Instruments</td><td>#MEW-F10T</td><td>Alternate parts: see &lt;strong&gt;Discussion&lt;/strong&gt;, &lt;strong&gt;Figure 6A&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Electrode lead wire</td><td>Cooner wire</td><td>NEF34-1646</td><td>(optional), &lt;strong&gt;Figure 6D&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Relay for amplifier head-stage</td><td>COTO Technology</td><td>#2342-05-000</td><td>(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), &lt;strong&gt;Figure 6A-C&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Digital video camera</td><td>Basler</td><td>A602fm</td><td>(optional) For behavioral monitoring, &lt;strong&gt;Figure 7&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Puralube vet ointment</td><td>Amazon.com, Inc</td><td>NC0138063</td><td></td></tr></tbody></table>

juxtacellular monitoring and localization of single neurons within sub-cortical brain structures of alert, head-restrained rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

<html> Unità neuronali in ventrale posteriore mediale (VPM) talamo codificare la fase di movimento vibrissa durante autogenerata sbattere 15,16. Figura 7A mostra attività spiking del campione di un&#39;unità talamica VPM come un topo è attivamente sbattere. Figura 7B mostra un istogramma di picco tempi allineati alla fase istantanea di vibrissa movimento 17. Ci sono più picchi durante la fase di retrazione di sbattere. Dopo la registrazione, la posizione dell&#...

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Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Monitoraggio Juxtacellular e localizzazione dei singoli neuroni nelle strutture cerebrali Sub-corticali di Alert, Rats Testa-trattenuto

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.3K Views.  University of California, San Diego. This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Video: Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a living animal&#8217;s brain. Moreover, the lengthy recovery from anesthesia limits the frequency of repeated recording/imaging episodes in longitudinal studies. Hence, new methods that would allow stable recordings from non-anesthetized behaving mice are expected to advance the fields of cellular and cognitive neurosciences. Existing solutions range from mere physical restraint to more sophisticated approaches, such as linear and spherical treadmills used in combination with computer-generated virtual reality. Here, a novel method is described where a head-fixed mouse can move around an air-lifted mobile homecage and explore its environment under stress-free conditions. This method allows researchers to perform behavioral tests (e.g., learning, habituation or novel object recognition) simultaneously with two-photon microscopic imaging and/or patch-clamp recordings, all combined in a single experiment. This video-article describes the use of the awake animal head fixation device (mobile homecage), demonstrates the procedures of animal habituation, and exemplifies a number of possible applications of the method.

This method creates a tangible, familiar environment for the mouse to navigate and explore during microscopic imaging or single-cell electrophysiological recordings, which require firm fixation of the animal&#8217;s head.

Appartamento con pavimento Platform aria sollevata: Un nuovo metodo per la combinazione di Comportamento con microscopia o Elettrofisiologia su Awake liberi di muoversi Roditori

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

Ricerca

Comportamento

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Registrazione Ensembles neuronali su larga scala con sonde di silicio sotto Rat anestetizzati

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Neuroscienze

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Corticale multistrato Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging nei mouse con movimento libero con sonde a prisma e microscopia a fluorescenza miniaturizzata

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents 

The ability to measure extracellular basal levels of neurotransmitters in the brain of awake animals allows for the determination of effects of different systemic challenges (pharmacological or physiological) to the CNS. For example, one can directly measure how the animal's midbrain dopamine projections respond to dopamine-releasing drugs like d-amphetamine or natural stimuli like food. In this video, we show you how to implant guide cannulas targeting specific sites in the rat brain, how to insert and implant a microdialysis probe and how to use high performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection (HPLC-EC) to measure extracellular levels of oxidizable neurotransmitters and metabolites. Local precise introduction of drugs through the microdialysis probe allows for refined work on site specificity in a compound s mechanism of action. This technique has excellent anatomical and chemical resolution but only modest time resolution as microdialysis samples are usually processed every 20-30 minutes to ensure detectable neurotransmitter levels. Complementary ex vivo tools (i.e., slice and cell culture electrophysiology) can assist with monitoring real-time neurotransmission.

Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents

The monitoring of extracellular neurotransmitter levels in distinct brain regions of freely moving animals offers insights on the link between neurotransmitter release and behavior. In vivo microdialysis coupled with electrochemical detection provides excellent anatomical and chemical resolution; and information on how basal neurotransmission is altered by pharmacological or physiological manipulations.

Survivable Chirurgia Stereotassica in roditori

The ability to measure extracellular basal levels of neurotransmitters in the brain of awake animals allows for the determination of effects of different ...

Biologia

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomal biocitina Etichettatura per studiare la struttura-funzione relazioni dei singoli neuroni corticali

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

acuto<em&gt; In Vivo</em&gt; Registrazioni elettrofisiologiche dei potenziali del campo locale e dell&#39;attività multi-unità dal percorso iperdirezionale nei ratti anestetizzati

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Imaging multistrato con microprisma in animali con testa fissa e in movimento libero

Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for studying the structure, function, and plasticity of living brain tissues. In comparison to conventional electrophysiology, fluorescence microscopy can capture the neural activity as well as the morphology of the cells, enabling long-term recordings of the identified neuron populations at single-cell or subcellular resolution. However, high-resolution imaging typically requires a stable, head-fixed setup that restricts the movement of the animal, and the preparation of a flat surface of transparent glass allows visualization of neurons at one or more horizontal planes but is limited in studying the vertical processes running across different depths. Here, we describe a procedure to combine a head plate fixation and a microprism that gives multilayer and multimodal imaging. This surgical preparation not only gives access to the entire column of the mouse visual cortex but allows two-photon imaging in a head-fixed position and one-photon imaging in a freely moving paradigm. Using this approach, one can sample identified cell populations across different cortical layers, register their responses under head-fixed and freely moving states, and track the long-term changes over months. Thus, this method provides a comprehensive assay of the microcircuits, enabling direct comparison of neural activities evoked by well-controlled stimuli and under a natural behavioral paradigm.

Autore in primo piano: Imaging comparativo dell'attività neurale in stato di veglia e in movimento libero

When integrated with a head-plate and an optical design compatible with both single- and two-photon microscopes, the microprism lens presents a significant advantage in measuring neural responses in a vertical column under diverse conditions, including well-controlled experiments in head-fixed states or natural behavioral tasks in freely moving animals.

Imaging a lungo termine di popolazioni neurali identificate utilizzando microprismi in animali che si muovono liberamente e fissano la testa

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for ...

Monitoraggio Juxtacellular e localizzazione dei singoli neuroni nelle strutture cerebrali Sub-corticali di Alert, Rats Testa-trattenuto

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Appartamento con pavimento Platform aria sollevata: Un nuovo metodo per la combinazione di Comportamento con microscopia o Elettrofisiologia su Awake liberi di muoversi Roditori

Registrazione Ensembles neuronali su larga scala con sonde di silicio sotto Rat anestetizzati

Corticale multistrato Ca

Survivable Chirurgia Stereotassica in roditori

Juxtasomal biocitina Etichettatura per studiare la struttura-funzione relazioni dei singoli neuroni corticali

acuto

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Imaging a lungo termine di popolazioni neurali identificate utilizzando microprismi in animali che si muovono liberamente e fissano la testa

Imaging a lungo termine di popolazioni neurali identificate utilizzando microprismi in animali che si muovono liberamente e fissano la testa

Imaging a lungo termine di popolazioni neurali identificate utilizzando microprismi in animali che si muovono liberamente e fissano la testa