Gli autori desiderano ringraziare S. Douglas per le discussioni di grande valore e consigli, e tutti i membri del laboratorio Bachelet per utili discussioni e lavoro. Questo lavoro è sostenuto da finanziamenti della Facoltà di Scienze della Vita e Istituto di Nanotecnologie e Materiali Avanzati alla Bar-Ilan University.

1. Preparazione di Staples Pool Miscela <ol><li> Ordinare liofilizzato DNA graffette nanorobot su piastre da 96 pozzetti come elencato nella tabella 1 (vedi Materiali) e normalizzare a 10 nmol. Per una descrizione dettagliata della progettazione e architettura del nanorobot DNA vedere Ben-Ishay et al. 14 e Douglas et al. 15). </li><li> Ricostituire ogni fiocco bene con DNasi / ultrapuro RNasi-free a una concentrazione di 100 micron. Per punti normalizzati a 10 nmol, ricostituire con 100 ml di acqua ultrapura. </li><li> Pool insieme 20 ml di ogni fiocco usando una pipetta multicanale e di una sterile, 55 ml di soluzione di bacino. Nota: Poiché la forma nanorobot è composto di 254 filamenti fiocco (compresi core, Bordi, maniglie e sequenze Guide, Tabella 1), la concentrazione di ciascuno dei punti in piscina Staples è 394 nm. Rimozione di graffette da piscina fiocco, o l&#39;aggiunta di un po &#39;diverso a volUmes, può ridurre notevolmente la resa, o comunque provocare aggregati spiegate. </li></ol> 2. Preparazione di Fabrication Reaction Miscela <ol><li> Per una miscela di reazione standard di utilizzare 40 ml di M13mp18 virale genoma circolare singolo filamento di DNA, corrispondenti a 4 pmol di ponteggio DNA (100 nM soluzione madre, vedi Materiali). Concentrazione finale del ponteggio nella miscela fabbricazione è di 20 nm, volume finale di 200 ml. <ol><li> Regolare la quantità di DNA patibolo in base alle esigenze specifiche; tuttavia, mantenere la concentrazione finale di scaffold DNA nella miscela di reazione ad una costante di 20 nM. </li></ol></li><li> Aggiungere punti per raggiungere un ponteggio di graffette rapporto di 1 a 10, rispettivamente. Per una concentrazione di 20 nM impalcatura di DNA, ciascuna delle concentrazione finale dei 254 punti &quot;è di 200 nm. Per un volume di reazione finale microlitri 200 aggiungere 102 ml di miscela Staples piscina (punto 1.2). <ol><li> Aggiungi specifiche sequenze di cancelli separatamente the miscela di reazione pieghevole in questo momento. Questi oligo sono ordinati separatamente e richiedono purificazione HPLC. Assicurarsi che oligo gate sono presenti in 1:10 scaffold Gate rapporto sequenza, cioè 200 nM di ciascun oligo di 20 nM concentrazione ponteggio. Per un volume di reazione di piegatura 200 microlitri, aggiungere 0,4 ml per ciascuna delle quattro oligo Gate a una concentrazione di 100 mM magazzino. </li></ol></li><li> Aggiungere 10x TAE magazzino tampone per raggiungere una concentrazione finale di 1x TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA). Per un volume di reazione pieghevole 200 ml, aggiungere 20 ml di 10x TAE. </li><li> Aggiungere 1 M MgCl 2 ad una concentrazione finale di 10 mM. Per un volume di reazione di piegatura 200 microlitri, aggiungere 2 ml di 1 M MgCl 2. </li><li> Aggiungere 36 ml di DNasi / RNasi acqua ultrapura gratuito per un raggiungere un volume finale di 200 ml. </li><li> Campioni Vortex e un&#39;aliquota di 100 microlitri in fiale per PCR. Nota: consultare le specifiche termociclatore per quanto riguarda i volumi massimi di reazione da utilizzare.Riducendo il volume di rispettare tali limiti non ridurrà le rese ottenute. Volumi di reazione al di sopra del massimo specificato metterà in pericolo le rese. </li></ol> 3. temperatura di ricottura Rampa di Fabrication Reazione <ol><li> Programma termociclatore come segue: <ol><li> Rampa 85 ° C a 60 ° C ad una velocità di 5 min / ° C. </li><li> Rampa 60 ° C a 4 ° C ad una velocità di 75 min / ° C. </li><li> Mantenere a 4 ° C indefinitamente. </li></ol></li><li> Dopo la fabbricazione è finita conservare i campioni a -20 ° C. </li></ol> 4. Rimozione di Staples in eccesso <ol><li> Aggiungere 100 pl di miscela di reazione di piegatura ad un filtro centrifugo 0,5 ml con MWCO di 100 kDa. Salvare un campione di 10 ml di nanorobot pre-purificazione per un&#39;analisi successiva. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 9.600 x g. </li><li> Aggiungere 400 ml di tampone pieghevole (1x TAE, 10 mM MgCl 2). </li><li> Ripetere i punti 4.2 e 4.3 per altre due volte. </li><li>Centrifugare per 5 min a 9.600 x g. </li><li> Recupero il concentrato posizionando il filtro capovolto in una provetta pulita e centrifugare per 1 min a 9.600 x g. Volumi finali possono variare a seconda del volume iniziale della miscela di reazione fabbricazione che è stato messo nel filtro. Tipicamente si ottiene un volume finale 25-60 microlitri di campione nanorobot concentrato. </li><li> Misurare la concentrazione di DNA nei campioni tramite spettrofotometro a 260 nm. Utilizzare peso molecolare di 5,3 mg / pmol quando calcolare le concentrazioni molari dei campioni nanorobot. Nota: Il coefficiente di estinzione molare per dsDNA, 50 ug / OD 260, è sufficiente per la maggior parte delle applicazioni. 48 mcg / OD 260 tiene conto della timina poli ssDNA estende ai bordi graffette. </li></ol> 5. Gel di Agarosio Analisi di Folded Nanorobots <ol><li> Preparazione di 0,5x TBE (45 mM Tris-borato, EDTA 1 mM), 2% gel di agarosio integrato con 10 mM MgCl 2 </sub&gt; (adattato da Ernesto Castro et al. 21): <ol><li> Preparare tampone TBE 0.5x diluendo 6,25 ml di 10x TBE buffer in magazzino 118.75 ml di DDH 2 O. </li><li> Sciogliere 2.5 g di agarosio in 125 ml di tampone TBE 0.5x. </li><li> Far bollire in forno a microonde fino agarosio è completamente sciolto. </li><li> Aggiungere 1,25 ml di 1 M MgCl 2 alla concentrazione finale di 10 mM. </li><li> Aggiungere 7 ml di 10 mg / ml di bromuro di etidio. </li><li> Attendere che la soluzione per un po &#39;freddo e riempire il vassoio gel prima si solidifica gel agarosio. Installa subito pettine desiderato. </li><li> Preparare 1 L 0,5x TBE tampone di corsa con l&#39;aggiunta di 50 ml di 10x TBE scorta regolatrice e 10 ml di 1 M MgCl 2-940 ml di DDH 2 O. </li><li> Una volta gel è add solido tampone di corsa al dispositivo elettroforesi e mettere dispositivo in un bagno di ghiaccio. </li></ol></li><li> Carico 1 mg DNA totale del nanorobot pre-purificazione (punto 3.2), e la purificazione posta (punto 4.7), a fianco di un ponteggioCampione di DNA e un marcatore DNA 1 kb, sul gel. Un esempio è riportato nella figura 2. Volumi di campioni effettivi dipendono dalle concentrazioni ottenute dopo purificazione. Ogni campione è caricato con tampone di caricamento in un rapporto 1: volume 6 finale. </li><li> Impostare fonte di alimentazione a 80 V e correre il gel per 3 ore. Eseguire il gel in un bagno riempito con acqua e ghiaccio. Nanorobot spiegheranno e appaiono come una macchia se il gel si riscalda durante l&#39;elettroforesi. Durante l&#39;elettroforesi aggiungere ghiaccio supplementare per mantenere dispositivo da riscaldamento. </li><li> Vista gel su un tavolo UV (Figura 2). </li></ol> 6. Macchia negativo di nanorobot con uranile-formiato <ol><li> Preparazione di soluzione uranile-formiato 2% (adattato da Castro et al. 23): <ol><li> Pesare 100 mg di polvere di uranile-formiato in un tubo da 15 ml. </li><li> Bollire DNase / RNase acqua ultrapura gratuito per 3 min per de-ossigenato. </li><li> Aggiungere 5 ml di acqua calda deossigenata (~ 60 ° C)nel tubo 15 ml contenente la polvere uranile-formiato (dal passo precedente). Chiudere bene il coperchio, avvolgere in un foglio di alluminio e vortex rigorosamente per 10 min (tubo a fissare un vortice). Soluzione deve apparire torbido con un colore giallo. </li><li> Filtro soluzione attraverso un 0,2 micron siringa fi ltro. Soluzione dovrebbe diventare trasparente. </li><li> Aliquota 200 ml di soluzione in microprovette. </li><li> Centrifugare alla massima velocità per 5 minuti in una centrifuga da tavolo per campioni piscina sul fondo della provetta. </li></ol></li><li> Caricamento di campione alla rete e colorazione negativa: <ol><li> Sbrinare un&#39;aliquota di 200 ml di soluzione di uranile-formiato 2% (preparato nella sezione 6.1). Aggiungere 10 ml di soluzione 0,5 M di NaOH e vortex rigorosamente per 3 min. Centrifugare a massima velocità per 5 minuti con una centrifuga da tavolo. </li><li> Nel frattempo, griglia glow-scarico con aria ambiente a 0,2 mbar e 25 mA per 30 sec. </li><li> Aggiungere 15 ml di 2 nm campione nanorobot dopo la purificazione (sectisu 4.7) sul lato superiore della griglia (tenuto con una pinza) e lasciate assorbire per 1 min. Utilizzare carta ltro fi per drenare il liquido in eccesso ponendo la griglia sulla parte superiore della carta da filtro. Non toccare la superficie della griglia. </li><li> Aggiungere 10 ml di uranile-formiato 2% (dal punto 6.2.1) sul lato superiore della griglia (tenuto con una pinza). </li><li> Utilizzare rapidamente carta ltro fi per drenare il liquido in eccesso ponendo la griglia sulla parte superiore della carta da filtro. Non toccare la superficie della griglia. </li><li> Ripetere i punti 6.2.4 e 6.2.5. </li><li> Aggiungere 10 ml di uranile-formiato 2% (dal punto 6.2.1) sul lato superiore della griglia (tenuto con una pinza). Lasciate soluzione colorante assorbe per 30 sec. </li><li> Utilizzare carta ltro fi per drenare il liquido in eccesso ponendo la griglia sulla parte superiore della carta da filtro. Non toccare la superficie della griglia. </li><li> Lasciate che la griglia di asciugare completamente per almeno 30 minuti, a faccia in su una carta da filtro, prima di iniettare nel TEM. </li></ol></li></ol>

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H., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+3D+DNA-origami+object.">Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo descritto la fabbricazione, la purificazione, e visualizzazione del nanorobot DNA. Dopo la fabbricazione del telaio esagonale del dispositivo, la funzione del nanorobot è programmato con la semplice introduzione di carico specifico e fili di rilevamento al robot che facilmente trovare la posizione designata causa idrogeno-bonding complementarità con siti di aggancio disponibile singolo filamento 14 , 15,22. Il protocollo di fabbricazione descritto utilizza una rampa di r...

Gli usi per gli acidi nucleici nanotecnologie sono sbalorditivi. La trattabilità della base Watson-Crick accoppiamento nonché la facilità e relativo basso costo della sintesi su larga scala di oligo misura 2 ha generato un&#39;esplosione di applicazioni 3 e ricerca nel campo delle nanotecnologie DNA. Nanotecnologie DNA strutturale, basato sul immobile 4,5 giunzione Seeman come un elemento fondamentale fa uso di DNA come unità elementare auto-assemblaggio per la costruzione di forme arbitrarie 6-8. Il recente sviluppo del DNA ponteggi origami 9 tecnica permette per la costruzione di complessi 2D / 3D nano-architetture 10-12 con precisione sub-nanometrica ed è un percorso efficace per la costruzione di nuovi oggetti funzionali con l&#39;aumentare della complessità e la diversità sorprendente. Il processo di costruzione si basa su un DNA a singolo filamento lungo scaffold, di solito derivato da un genom viralee che può essere piegato attraverso l&#39;ibridazione di centinaia di singoli brevi oligo filamento di DNA definito graffette. La risoluzione strutturale elevato ottenuto con questa tecnica è la diretta conseguenza delle dimensioni naturali del DNA a doppia elica, mentre la riproducibilità della fabbricazione è il risultato della modulazione dei brevi sequenze singolo filamento fiocco per facilitare la massima complementarità idrogeno-bonding realizzabile. Con l&#39;uso di una temperatura di ricottura lenta rampa la creazione più bassa energia, termodinamicamente nanostruttura preferito è raggiunto in alte rese e fedeltà. La semplice applicazione di regole di progettazione di giunzione in un codice di calcolo ha permesso lo sviluppo di strumenti CAD, come caDNAno 13, che semplifica molto il compito di progettare grandi strutture complesse che contengono centinaia di incroci collegati. Precedentemente abbiamo descritto la progettazione di un nanorobot DNA con l&#39;ausilio dello strumento 14,15 caDNAno. Qui ci raffiguriamo la fabbricazione evisualizzazione, tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM), del nanorobot, una cavità nanodevice esagonale 3D, con dimensioni di 35 x 35 x 50 nm 3, destinato a subire un cambiamento conformazionale in risposta a determinati stimoli predeterminati e presenti carico specifico, tale come proteine ​​o oligonucleotidi di acidi nucleici, sequestrati all&#39;interno. Mentre 12 stazioni di carico sono disponibili all&#39;interno del telaio cavità, il numero effettivo di carico legato differisce a carico di formato. Molecole cargo vanno da piccole molecole di DNA di enzimi, anticorpi e 5-10 nanoparticelle d&#39;oro nm. Cargocan essere sia uniforme o eterogenea, tale che ogni nanorobot contiene una miscela di diverse molecole. Rilevamento avviene tramite due porte a doppia elica disegno di bloccaggio per rilevare proteine, acidi nucleici o altre sostanze chimiche, basato sia su aptasensor 16,17 o filamento di DNA spostamento 18 tecnologie. I recenti sviluppi in aptamer protocolli di selezione 19-21 consentono la progettazione di nanorobot risponderead una gamma sempre crescente di molecole e tipi di cellule. Lavoro precedenza ha mostrato un nanorobot trasportano un anticorpo specifico, che in seguito al legame al suo antigene può trasmettere sia un inibitore o un segnale prolifica all&#39;interno di specifici tipi cellulari in una popolazione cellulare mista 15. Una caratteristica interessante di questi nanodispositivi è la loro capacità di svolgere compiti ancora più complessi e controllo logico con l&#39;introduzione di diversi sottotipi nanorobot in una singola popolazione. Recentemente abbiamo dimostrato specifici sottotipi di nanorobot che effettuano sia come regolatori positivi o negativi, che controlla una popolazione effettori contenente un carico molecola attiva 22. Il protocollo presentato qui descritta la realizzazione, la purificazione e l&#39;imaging di un nanorobot gated con sequenze sensori aptameri che si legano selettivamente al PDGF per facilitare l&#39;apertura del nanorobot 15,22. Il processo di fabbricazione descritto è simile al nprocesso di fabbricazione anorobot inizialmente descritto da Douglas et al. 15 con modifiche volte a ridurre la durata complessiva dei processi, aumentando i tassi di rendimento e purificazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNase/RNase free distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 ssDNA scaffold</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N4040S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15558-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC510024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide 10mg/ml solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA marker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3232S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7021S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl formate</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>24762</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbon-coated TEM grids&#160;</td>
			<td>Science services</td>
			<td>EFCF400-Cu-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler c1000 Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge K100X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV table Gel Doc EZ Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI-G12</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

folding and characterization of a bio-responsive robot from dna origami

Il nanorobot DNA è un dispositivo nanometrico cava esagonale, progettato per aprire in risposta a stimoli specifici e presentare merci sequestrate all&#39;interno. Entrambi gli stimoli e le merci possono essere personalizzati in base alle esigenze specifiche. Qui si descrive il protocollo di fabbricazione nanorobot DNA, con l&#39;uso della tecnica origami di DNA. Il procedimento inizia miscelando brevi graffette DNA filamenti singoli, in una miscela di magazzino che viene poi inserito in un lungo, circolare, scaffold DNA a singolo filamento in presenza di un buffer di piegatura. Un cycler termico standard viene programmato per ridurre gradualmente la temperatura di reazione di miscelazione per facilitare la ricottura graffette da ponteggio, che è la forza guida dietro la piegatura della nanorobot. Una volta che la reazione di piegatura 60 hr è completa, graffette eccesso vengono eliminati utilizzando un filtro centrifugo, seguita da visualizzazione tramite elettroforesi in gel di agarosio-(AGE). Infine, successo fabbricazione del nanorobot viene verificata mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM),con l&#39;uso di uranile-formiato come colorazione negativa.

Risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2A. Tutte le corsie contengono 1 mg di DNA totale, misurata mediante spettrofotometro (OD 260). Rispetto al ponteggio circolare DNA a singolo filamento (corsia 2), nanorobots sono ostacolati nel gel causa del loro peso molecolare più elevato, il risultato di graffette ibridazione al DNA ponteggio (Lane 3. Red freccia). La banda basso peso molecolare a Lane 3 rappresenta graffette in eccesso che non si legano al DNA patibol...

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Piegatura e caratterizzazione di un robot bioresponsivo da DNA Origami | Chimica | Video

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Pieghevole e caratterizzazione di un robot bio-reattiva da origami di DNA

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

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14.4K Views.  Bar-Ilan University. DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM). 

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Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

Origami Ispirato auto-assemblaggio di particelle Fantasia e riconfigurabile

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Ricerca

Chimica

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolamento e Caratterizzazione chimica del lipide A da batteri Gram-negativi

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nucleosidi trifosfati - Dalla sintesi di biochimica Caratterizzazione

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Sintesi e caratterizzazione di funzionalizzato metallo-organici quadri

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Preparazione di Mica e Silicon substrati per il DNA Origami Analisi e sperimentazione

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar concentration forming hydrophobic cores surrounded by hydrophilic shells in aqueous environments. The core of these micelles can be utilized to load hydrophobic, poorly water soluble drugs like docetaxel (DTX) and everolimus (EVR). Systematic characterization of the micelle structure and drug loading capabilities are important before in vitro and in vivo studies can be conducted. The goal of the protocol described herein is to provide the necessary characterization steps to achieve standardized micellar products. DTX and EVR have intrinsic solubilities of 1.9 and 9.6 &#181;g/ml respectively Preparation of these micelles can be achieved through solvent casting which increases the aqueous solubility of DTX and EVR to 1.86 and 1.85 mg/ml, respectively. Drug stability in micelles evaluated at room temperature over 48 hr indicates that 97% or more of the drugs are retained in solution. Micelle size was assessed using dynamic light scattering and indicated that the size of these micelles was below 50 nm and depended on the molecular weight of the polymer. Drug release from the micelles was assessed using dialysis under sink conditions at pH 7.4 at 37 oC over 48 hr. Curve fitting results indicate that drug release is driven by a first order process indicating that it is diffusion driven.

The goal of this protocol is to describe the preparation and characterization of physically entrapped, poorly water soluble drugs in micellar drug delivery systems composed of amphiphilic block copolymers.

Preparazione e caratterizzazione di individuale e Multi-droga Loaded Fisicamente intrappolate polimerici Micelle

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Sintesi e caratterizzazione di supramolecolari colloidi

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

Acido ftalico Ester-associazione DNA aptamero selezione, caratterizzazione e applicazione di un Aptasensor elettrochimica

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Motivi di DNA stabile, 1D e 2D nanostrutture costruito da molecole di DNA circolare piccola

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

Terapia genica ispirato Polycation rivestimento per la protezione di nanostrutture di DNA Origami

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...