Die Autoren danken S. Douglas für äußerst wertvolle Diskussionen und Beratung, und alle Mitglieder der Bachelet Labor für hilfreiche Diskussionen und Arbeit danken. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse von der Fakultät für Lebenswissenschaften und Institut für Nanotechnologie und Neue Materialien an der Bar-Ilan-Universität unterstützt.

1. Herstellung von Staples Pool Mixture <ol><li> Sortieren lyophilisiert DNA Nanorobotik Heftklammern auf 96-Well-Platten, wie in Tabelle 1 aufgeführt (siehe Materialien) und zu normalisieren, um 10 nmol. Für eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion und Architektur des DNA Nanoroboters siehe Ben-Ishay et al. 14 und Douglas et al. 15). </li><li> Rekonstituieren Stapel gut mit DNase / RNase-freies Reinstwasser auf eine Konzentration von 100 uM. Für Heftklammern bis 10 nmol normalisiert, auflösen mit 100 ul von ultrareinem Wasser. </li><li> Pool zusammen 20 ul jeder Klammer mit einer Mehrkanalpipette und ein steriles 55 ml-Lösung Becken. Hinweis: Da der Nanorobotik Form von 254 Heftstränge (einschließlich Kern, Kanten, Griffe und Guides Sequenzen, Tabelle 1), die Konzentration von jedem der Heftklammern in der Heftklammern Pool umfasste ist 394 nM. Entfernen von Heftklammern aus der Heftklammer-Pool oder das Hinzufügen einige an verschiedenen volUMEs, kann die Ausbeute deutlich zu reduzieren, oder auf andere Weise in ungefalteten Aggregate führen. </li></ol> 2. Herstellung von Fabrication Reaktionsgemisch <ol><li> Für ein Standard-Reaktionsgemisch zu verwenden 40 ul M13mp18 viralen Genoms kreisförmigen Einzelstrang-DNA, entsprechend 4 pmol Gerüst DNA (100 nM Stammlösung, siehe Materialien). Endkonzentration von Gerüst bei der Herstellung Gemisch 20 nM, Endvolumen 200 ul. <ol><li> Stellen Sie die Höhe der Gerüst DNA nach deren spezifischen Bedürfnissen; Jedoch halten die Endkonzentration von Gerüst-DNA in der Reaktionsmischung auf einem konstanten 20 nM. </li></ol></li><li> Hinzufügen Klammern an ein Gerüst, Klammern Verhältnis von 1 zu 10 zu erreichen sind. Für ein 20 nM Gerüst-DNA-Konzentration ist jede Endkonzentration 254 Staples 200 nM. Für eine 200 ul Endreaktionsvolumen fügen 102 ul der Heftklammern Pool Mischung (Abschnitt 1.2). <ol><li> In bestimmten Gate-Sequenzen getrennt zu the Klappreaktionsgemisch zu diesem Zeitpunkt. Diese Oligos sind separat zu bestellen und erfordern HPLC-Reinigung. Stellen Sie sicher, dass Tor Oligos in einer 1.10 Gerüst Tor Sequenz Verhältnis vorliegen, dh 200 nM jedes Oligos für eine 20 nM Gerüst Konzentration. Für ein 200 &amp; mgr; l Reaktionsvolumen Falten, je 0,4 &amp; mgr; l für jede der vier Gatter Oligo bei 100 uM Stammkonzentration. </li></ol></li><li> Hinzufügen 10x TAE Lager Puffer zu einer endgültigen Konzentration von 1x TAE (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) zu erreichen. Für eine 200 ul Klappreaktionsvolumen, fügen Sie 20 ul 10x TAE. </li><li> 1 M MgCl 2 zu einer Endkonzentration von 10 mM. Für eine 200 ul Klappreaktionsvolumen, fügen Sie 2 ul 1 M MgCl 2. </li><li> Hinzuzufügen 36 ul DNase / RNase frei Reinstwasser ein Erreichbarkeits ein Endvolumen von 200 ul. </li><li> Vortex und aliquoten 100 ul Proben in PCR-Röhrchen. Hinweis: Wenden Thermocycler-Spezifikation in Bezug auf die zu verwendenden maximalen Reaktionsvolumina.Verringerung des Volumens, um diese Grenzen erfüllen nicht die erzielten Ausbeuten reduzieren. Reaktionsvolumina über dem angegebenen werden die Erträge beeinträchtigen Maximum. </li></ol> 3. Temperaturglühen Ramp von Fabrication Reaction <ol><li> Programm Thermocycler wie folgt: <ol><li> Rampe 85 ° C bis 60 ° C mit einer Geschwindigkeit von 5 min / ºC. </li><li> Rampe 60 ° C bis 4 ° C bei einer Geschwindigkeit von 75 min / ºC. </li><li> Halten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit. </li></ol></li><li> Nach der Herstellung hat Proben bei -20 ° C beendet. </li></ol> 4. Entfernung von überschüssigem Staples <ol><li> 100 ul Klappreaktionsgemisch auf ein 0,5 ml Zentrifugalfilter mit einem MWCO von 100 kDa. Speichern Sie eine 10 ul Probe der Nanoroboter Vorreinigung für eine spätere Analyse. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 9.600 x g. </li><li> Fügen Sie 400 ul Faltungspuffer (1x TAE, 10 mM MgCl 2). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.2 und 4.3 zwei weitere Male. </li><li>Zentrifuge für 5 min bei 9.600 x g. </li><li> Wiederherstellen des Konzentrats, indem Sie den Filter auf den Kopf in einem sauberen Mikrozentrifugenröhrchen und Spin für 1 min bei 9600 x g. Endvolumina je nach Ausgangsvolumen der Fertigung Reaktionsmischung, die in den Filter gesetzt wurde, variieren. Typischerweise ein 25-60 ul Endvolumen konzentrierte Nanoroboters Probe erhalten. </li><li> Messung der DNA-Konzentration in den Proben mittels Spektrophotometer bei 260 nm. Verwenden Molekulargewicht von 5,3 g / pmol bei der Berechnung der molaren Konzentrationen von Nanorobotik Proben. Anmerkung: Der molare Extinktionskoeffizient für dsDNA, 50 ug / OD 260, reicht für die meisten Anwendungen. 48 &amp; mgr; g / OD 260 berücksichtigt die Poly Thymin ssDNA erstreckt sich an den Rändern Klammern. </li></ol> 5. Agarose-Gel-Elektrophorese Die Analyse der Folded Nanoroboter <ol><li> Herstellung von 0,5x TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA), 2% Agarosegel mit 10 mM MgCl 2 supplementiert </sub&gt; (von Ernesto Castro et al angepasst. 21): <ol><li> Bereiten 0,5x TBE-Puffer durch Verdünnen von 6,25 ml 10x TBE stock Puffer in 118,75 ml ddH 2 O. </li><li> Aufzulösen 2,5 g Agarose in 125 ml 0,5 x TBE-Puffer. </li><li> Sieden Mikrowelle, bis die Agarose vollständig gelöst ist. </li><li> Hinzufügen 1,25 ml 1 M MgCl 2 zu einer Endkonzentration von 10 mM. </li><li> Hinzufügen 7 ul 10 mg / ml Ethidiumbromid. </li><li> Warten Sie, bis Lösung etwas abkühlen lassen und füllen Sie den Gelträger, bevor die Agarose-Gel verfestigt. Installieren Sie die gewünschten Kamm sofort. </li><li> Vorbereitung 1 L 0,5x TBE Laufpuffer durch Zugabe von 50 ml 10x TBE Stammpuffer und 10 ml 1 M MgCl 2 bis 940 ml ddH 2 O. </li><li> Sobald Gel ist solide Add Laufpuffer in die Elektrophoresevorrichtung und legte Gerät in einem Eisbad. </li></ol></li><li> Last 1 &amp; mgr; g Gesamt-DNA des Nanoroboter Vorreinigung (Schritt 3.2), und nach der Reinigung (Schritt 4.7), neben einem GerüstDNA-Probe und eine 1 kb DNA-Marker, auf das Gel. Ein Beispiel ist in Abbildung 2 wiedergegeben. Die tatsächliche Probenvolumina hängen von den nach der Reinigung erhalten Konzentrationen. 6 Endvolumen Verhältnis: jeweils Proben mit Beladungspuffer bei einer 1 geladen. </li><li> Set Stromquelle auf 80 V und führen Gel für 3 Stunden. Führen Sie das Gel in einem Bad mit Eis und Wasser gefüllt. Nanoroboter wird sich entfalten und erscheinen als ein Abstrich, wenn das Agarose-Gel erwärmt sich während der Elektrophorese. Während der Elektrophorese fügen Sie zusätzliche Eis zum Gerät von Heizung zu halten. </li><li> Anzeigen Gel auf einem UV-Tabelle (Figur 2). </li></ol> 6. Negative Stain von Nanoroboter mit Uranyl Formiat- <ol><li> Herstellung von 2% Uranyl Formiat-Stammlösung (Castro et al angepasst. 23): <ol><li> Wiegen Sie 100 mg Uranyl Formiat-Pulver in einen 15-ml-Tube. </li><li> Boil DNase / RNase frei von ultrareinem Wasser für 3 min zu de-Sauerstoffverbindung. </li><li> 5 ml desoxygeniertem heißem Wasser (~ 60 ° C)in die 15 ml Röhrchen mit dem Uranyl Formiat-Pulver (aus dem vorherigen Schritt). Dicht schließende Deckel, in Alufolie wickeln und Wirbel konsequent für 10 min (fasten Rohr zu einem Vortex). Lösung sollte trüb mit gelber Farbe angezeigt. </li><li> Filter-Lösung durch einen 0,2 um Spritzenfilter. Lösung sollte klar sein. </li><li> 200 ul Aliquot der Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 5 min in einer Tischzentrifuge zur Poolproben an der Unterseite des Rohres. </li></ol></li><li> Laden der Probe auf Raster und negative Färbung: <ol><li> Tauen Sie eine 200-ul-Aliquot von 2% Uranylacetat-Formiatlösung (in Abschnitt 6.1) hergestellt. In 10 ul 0,5 M NaOH-Lösung und Wirbel konsequent für 3 min. Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 5 Minuten unter Verwendung einer Tischzentrifuge. </li><li> Inzwischen Glimmentladung Gitter mit Raumluft bei 0,2 mbar und 25 mA für 30 Sekunden. </li><li> In 15 ul 2 nM Nanorobotik Probe nach der Reinigung (Abschnitauf 4.7) auf Oberseite des Gitters (mit einer Pinzette gehalten) und lassen Sie absorbieren für 1 min. Verwenden Filterpapier, um die überschüssige Flüssigkeit, indem das Gitter über dem Filterpapier abtropfen. Die Gitteroberfläche nicht berühren. </li><li> Zugabe von 10 ul 2% Uranylacetat-Formiat (aus Schritt 6.2.1) auf der Oberseite des Gitters (mit einer Pinzette gehalten werden). </li><li> Benutzen schnell Filterpapier, um die überschüssige Flüssigkeit, indem das Gitter auf der Oberseite des Filterpapier abtropfen lassen. Die Gitteroberfläche nicht berühren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6.2.4 und 6.2.5. </li><li> Zugabe von 10 ul 2% Uranylacetat-Formiat (aus Schritt 6.2.1) auf der Oberseite des Gitters (mit einer Pinzette gehalten werden). Lassen Färbelösung absorbieren 30 Sek. </li><li> Verwenden Filterpapier, um die überschüssige Flüssigkeit, indem das Gitter über dem Filterpapier abtropfen. Die Gitteroberfläche nicht berühren. </li><li> Ließ das Gitter vollständig trocknen für mindestens 30 min, nach oben auf ein Filterpapier, vor dem Einspritzen in das TEM. </li></ol></li></ol>

<ol>
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G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+scalable+preparation+of+pure+and+dense+DNA+origami+solutions.">Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).</li><li>Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+3D+DNA-origami+object.">Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschrieben die Herstellung, Reinigung und Visualisierung der DNA-Nanoroboter. Nach der Herstellung des hexagonalen Chassis der Vorrichtung wird die Funktion des Nanoroboters mit der einfachen Einführung spezifischer Ladung und Erfassen Stränge an den Roboter, die leicht zu finden ihre bestimmten Position aufgrund von Wasserstoffbrücken Komplementarität vorhanden einsträngigen Andockstellen 14 programmiert , 15,22. Die beschriebenen Herstellungsprotokoll verwen...

Die Einsatzmöglichkeiten für Nukleinsäuren Nanotechnologie sind erstaunlich. Die Lenkbarkeit des Watson-Crick-Basenpaarung sowie die einfache und relativ kostengünstige großtechnische Synthese von maßgeschneiderten Oligos 2 hat eine Explosion von Anwendungen 3 und Forschung auf dem Gebiet der DNA-Nanotechnologie erzeugt. Strukturelle DNA Nanotechnologie, bezogen auf das immobile Seeman Kreuzung 4,5 als grundlegender Baustein macht Verwendung von DNA als eine selbstorganisierende Elementareinheit für die Konstruktion von beliebigen Formen 6-8. Die jüngste Entwicklung der rüstet DNA-Origami-9-Technik ermöglicht die Konstruktion von komplexen 2D- / 3D-Nanoarchitekturen 10-12 mit Sub-Nanometer Präzision und ist ein effizienter Weg für den Bau neuer funktionale Objekte mit zunehmender Komplexität und erstaunliche Vielfalt. Der Bauprozess wird auf eine lange Gerüsteinzelstrang-DNA basiert, in der Regel von einem viralen Genom abgeleitete, der durch die Hybridisierung von Hunderten von kurzen Einzelstrang-DNA-Oligos gefaltet werden kann bezeichnet Heftklammern. Die hohe Strukturauflösung durch diese Technik erhalten ist das direkte Ergebnis der natürlichen Dimensionen der DNA-Doppelhelix, während die Reproduzierbarkeit der Herstellung ist das Ergebnis der Anpassung der kurzen Einzelstrang-Stapelsequenzen, um die maximale Wasserstoffbrücken Komplementarität erreichbar zu erleichtern. Mit dem Einsatz von einem langsamen Temperaturglühen Rampe die entworfen niedrigsten Energie, in hohen Ausbeuten und Treue thermodynamisch bevorzugte Nanostruktur erreicht wird. Die einfache Umsetzung der Kreuzung Design-Regeln in einem Computercode aktiviert die Entwicklung von CAD-Tools, wie caDNAno 13, die extrem vereinfachen die Aufgabe der Gestaltung großer, komplexer Strukturen, die Hunderte von Übergängen verbunden. Zuvor beschrieben wir die Konstruktion eines DNA-Nanoroboter mit Hilfe des caDNAno Werkzeug 14,15. Die Herstellung Hier zeigen wir, undVisualisierung, über Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), der Nanoroboter, einem 3D hohlen sechseckigen Nanovorrichtung, mit den Abmessungen von 35 x 35 x 50 nm 3, entworfen, um eine große Konformationsänderung in Reaktion auf eine vorbestimmte Stimuli und Gegenwart spezifische Ladung, unterzogen werden wie wie Proteine ​​oder Nukleinsäure-Oligos, abgesondert innen. Während 12 Verladestationen stehen innerhalb der hohlen Gehäuse, die tatsächliche Anzahl der gebundenen Ladung unterscheidet mit Ladung groß. Cargomoleküle reichen von kleinen DNA-Moleküle, Enzyme, Antikörper und 5-10 nm Goldnanopartikel. Cargocan entweder einheitlich oder heterogen, so dass jedes Nanoroboters enthält ein Gemisch aus verschiedenen Molekülen. Sensor ist über zwei Doppelschräg Sperriegel Design entweder aptasensor 16,17 oder DNA-Strang-Verdrängungs-18-Technologien erreicht werden, um Proteine, Nukleinsäuren oder andere Chemikalien zu erfassen, beruht. Jüngste Entwicklungen in der Aptamer Selektionsprotokolle 19-21 ermöglichen die Gestaltung von Nanoroboter reagiertzu einer ständig wachsenden Palette von Molekülen und Zelltypen. Frühere Arbeiten zeigten eine Nanoroboter, der einen spezifischen Antikörper, der nach der Bindung an sein Antigen kann entweder eine hemmende oder ein produktiver Signal an der Innenseite von spezifischen Zelltypen in einer gemischten Zellpopulation 15 weiterzuleiten. Eine spannende Merkmal dieser Nanomaschinen ist ihre Fähigkeit, auch komplexere Aufgaben und Logic-Control mit der Einführung von verschiedenen Nanorobotik-Subtypen in einer einzigen Population durchzuführen. Kurzem zeigten wir bestimmte Subtypen von Nanoroboter Führen entweder positive oder negative Regulatoren, Steuern eines Effektorpopulation enthaltend einen aktiven Frachtmoleküls 22. Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Herstellung, Reinigung und Bildgebung eines Nanoroboter mit Aptamer-Sensor-Sequenzen, die selektiv an PDGF binden, um die Öffnung der Nanorobotik 15,22 erleichtern gated. Das beschriebene Herstellungsverfahren ist ähnlich dem nanorobot Herstellungsverfahren zunächst von Douglas et al. 15 mit Änderungen zur Verringerung der Gesamtprozessdauer ausgerichtet dargestellt, während die Erhöhung der Ausbeute und Reinigungsraten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNase/RNase free distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 ssDNA scaffold</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N4040S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15558-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC510024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide 10mg/ml solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA marker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3232S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7021S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl formate</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>24762</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbon-coated TEM grids&#160;</td>
			<td>Science services</td>
			<td>EFCF400-Cu-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler c1000 Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge K100X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV table Gel Doc EZ Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI-G12</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

folding and characterization of a bio-responsive robot from dna origami

Die DNA-Nanoroboter ist eine hohle hexagonale Nanometereinrichtung, entworfen, um als Reaktion auf bestimmte Reize und Gegenwart Fracht innerhalb abgesondert zu öffnen. Beide Reize und Ladung kann nach spezifischen Bedürfnisse zugeschnitten werden. Hier beschreiben wir die DNA Nanoroboters Herstellungsprotokoll, wobei die Verwendung des DNA-Origamitechnik. Das Verfahren startet, indem man kurze einsträngige DNA von Klammern in einer Stammischung, der dann in Gegenwart eines Faltungspuffer zu einem langen, kreisförmigen, einsträngigen DNA-Gerüst aufgenommen. Ein Standard-Thermocycler so programmiert ist, allmählich gesenkt werden das Mischen der Reaktionstemperatur, um die Klammern zu Gerüstglühen, die die treibende Kraft hinter der Faltung des Nanoroboters ist erleichtern. Sobald die 60 h Faltungsreaktion vollständig ist, werden die überzähligen Klammern unter Verwendung einer Filterzentrifuge, gefolgt von Visualisierung über Agarose-Gelelektrophorese (AGE) verworfen. Schließlich wird erfolgreiche Herstellung des Nanoroboters durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) überprüft wird,mit der Verwendung von Uranyl-Formiat als negative Färbung.

Repräsentative Ergebnisse sind in 2A gezeigt. Alle Spuren enthalten 1 &amp; mgr; g Gesamt-DNA über Spektrophotometer (OD 260) gemessen. Im Vergleich mit dem kreisförmigen Einzelstrang-DNA-Gerüst (Spur 2), sind Nanoroboter im Gel aufgrund ihrer höheren Molekulargewicht behindert, ist das Ergebnis von Klammern Hybridisierung an das Gerüst DNA (Spur 3 roter Pfeil). Das Gewicht Band mit niedrigem Molekular in Spur 3 stellt überschüssige Heftklammern, die nicht auf das Schafott DNA (grüne...

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Faltung und Charakterisierung eines bioresponsiven Roboters aus DNA-Origami | Chemie | Video

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

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14.4K Aufrufe.  Bar-Ilan University. DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM). 

Serie: Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

Origami Inspired Selbstorganisation von Patterned und Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Forschung

Chemie

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Synthese und Charakterisierung von funktionalisierten Metall-organische Gerüste

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Herstellung von Mica und Siliziumsubstraten für die DNA-Origami-Analyse und Experimentieren

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar concentration forming hydrophobic cores surrounded by hydrophilic shells in aqueous environments. The core of these micelles can be utilized to load hydrophobic, poorly water soluble drugs like docetaxel (DTX) and everolimus (EVR). Systematic characterization of the micelle structure and drug loading capabilities are important before in vitro and in vivo studies can be conducted. The goal of the protocol described herein is to provide the necessary characterization steps to achieve standardized micellar products. DTX and EVR have intrinsic solubilities of 1.9 and 9.6 &#181;g/ml respectively Preparation of these micelles can be achieved through solvent casting which increases the aqueous solubility of DTX and EVR to 1.86 and 1.85 mg/ml, respectively. Drug stability in micelles evaluated at room temperature over 48 hr indicates that 97% or more of the drugs are retained in solution. Micelle size was assessed using dynamic light scattering and indicated that the size of these micelles was below 50 nm and depended on the molecular weight of the polymer. Drug release from the micelles was assessed using dialysis under sink conditions at pH 7.4 at 37 oC over 48 hr. Curve fitting results indicate that drug release is driven by a first order process indicating that it is diffusion driven.

The goal of this protocol is to describe the preparation and characterization of physically entrapped, poorly water soluble drugs in micellar drug delivery systems composed of amphiphilic block copolymers.

Herstellung und Charakterisierung von Einzel-und Multi-Wirkstoff beladen Körperlich Eingeschlossene Polymermicellen

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Synthese und Charakterisierung von supramolekularen Kolloid-

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

Phthalsäure Acid Ester-Bindung DNA-Aptamer Auswahl, Charakterisierung und Anwendung eines elektrochemischen Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Stabile DNA-Motive, 1D und 2D Nanostrukturen aus kleinen kreisförmigen DNA-Moleküle gebaut

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

Gentherapie inspiriert Polykation Beschichtung zum Schutz der DNA Origami Nanostrukturen

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...