Finanziamenti erogati dalla Western University of Health Sciences College of Optometry a DJC. Un ringraziamento speciale a Irisa Tam per la progettazione grafica.

Tutti zootecnia e gli esperimenti devono essere autorizzati e condotte in conformità con le linee guida definite dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso del rispettivo ente o di altri requisiti di legge. 1. Cura Zebrafish <ol><li> Mantenere zebrafish in condizioni standard a 28,5 ° C in un ciclo di 10 ore buio-luce 14 hr 16. </li><li> Tenere zebrafish adulto ad una densità deposito di circa 3 pesce / L. </li></ol> 2. Risposta Optokinetic (okr) <ol><li> Costruisci il dispositivo di registrazione okr personalizzata con un diametro di 14,5 centimetri tamburo rotante, un microscopio stereo con impostazioni di intensità della luce regolabile (300-8,000 lux) e un computer (Figura 1a). <ol><li> Attaccare una fotocamera al microscopio che fornirà un live feed su un monitor adiacente e consentire l&#39;acquisizione e la registrazione di immagini. </li><li> Controllare il tamburo rotante utilizzando un microcontrollore collegato a un computer che accommoData di varie selezioni di velocità e direzione. </li></ol></li><li> Anestetizzare il pesce in 0,016% tricaine per 2-3 minuti e poi mettere il pesce su una piccola piattaforma con gli occhi e le branchie sospesi sopra il bordo. </li><li> Posizionare un sottile spugna / asciugamano sopra il corpo del pesce e il pin 2-3 pezzi di schiuma, sagomati per ospitare il pesce, sopra il pesce per tenerlo immobilizzato. Limitando il movimento della coda del pesce è risultato essere un aspetto cruciale per l&#39;immobilizzazione senza causare lesioni ai pesci, e fu meglio realizzato utilizzando un pezzo di schiuma. (Figura 1b) </li><li> Posizionare il pesce in una vasca piena d&#39;acqua cilindrico, che si inserisce all&#39;interno del tamburo rotante del dispositivo di registrazione OKR. Utilizzare magneti sulla piattaforma per posizionare il pesce montante, con gli occhi circa 7,3 cm dal bordo del tamburo. I pesci dovrebbero rilanciare dall&#39;anestesia in pochi minuti - la respirazione normale riprenderà e movimenti oculari casuali deve essere rispettato. </li><li> Mettere un bassorilievoe grata di 0,07 cicli per grado (CPD) nel tamburo rotante e coinvolgere i comandi del computer per iniziare a rotazione e di acquisizione video (una velocità di 12 giri al minuto è stato utilizzato per questo lavoro, ma una velocità di 8-16 rpm dovrebbero dare risultati simili). </li><li> Dopo un primo okr è suscitato dalla base reticolo, mettere in pausa la rotazione brevemente, e sostituire la grata di una griglia più piccola (più alta frequenza spaziale). </li><li> Ripetere questo processo fino a quando un okr non può più essere suscitato. Ripetere il test con la grata più piccola che ha provocato un OKR seguendo un approccio scala modificata e quindi ripetere utilizzando la grata che non è riuscito a provocare una risposta di verifica delle perdite del OKR. Questo processo può essere ripetuto per verificare una vera risposta al più piccolo reticolo rilevabile se il reticolo finale differente rispetto alla prima estinzione. </li><li> Ottenere misure di acuità monoculare mettendo una plastica occlusore nero sopra le strisce adiacenti all&#39;occhio opposto. Ripetere la procedura di cui sopra (punti 2.6-2.7). </li><li>Ottenere l&#39;acutezza dell&#39;occhio opposto riposizionando il occluder e ripetendo di nuovo la procedura 2,6-2,7. </li><li> Nota la distanza di ogni occhio è dalle strisce durante la procedura di test utilizzando la striscia di misurazione di riferimento sotto il serbatoio pesce in modo che le misure di acuità accurate possono essere calcolate nei seguenti passi. </li></ol> 3. Calcolo acuità visiva <ol><li> Ottenere l&#39;acuità visiva calcolando la CPD: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="0.7in" src="/files/ftp_upload/50832/50832eq1.jpg" width="70px" /> dove a è la distanza dal centro della lente alla grata, e h è la lunghezza di un ciclo del reticolo più piccola alla quale OKR stato osservato (figura 1c). </li><li> Per le misure di acuità visiva combinati, la media viene utilizzato un valore sia dal occhio destro e sinistro. </li></ol>

<ol>
	<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects.">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10545-10549 (1995).</li><li>Neuhauss, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disorders+of+vision+revealed+by+a+behavioral+screen+of+400+essential+loci+in+zebrafish.">Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish.</a> J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).</li><li>Schumann, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+objective+determination+of+visual+acuity+on+the+basis+of+the+optokinetic+nystagmus.">The objective determination of visual acuity on the basis of the optokinetic nystagmus.</a> Am. J. Optom. Arch. Am. Acad. Optom. 29, 575-583 (1952).</li><li>Gorman, J. J., Cogan, D. G., Gellis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apparatus+for+grading+the+visual+acuity+of+infants+on+the+basis+of+opticokinetic+nystagmus.">An apparatus for grading the visual acuity of infants on the basis of opticokinetic nystagmus.</a> Pediatrics. 19, 1088-1092 (1957).</li><li>Fulton, A. B., Manning, K. 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Laryngol. 60, 927-947 (1951).</li><li>Tappeiner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Acuity+and+Contrast+Sensitivity+of+Adult+Zebrafish.">Visual Acuity and Contrast Sensitivity of Adult Zebrafish.</a> Front. Zool. 9, 10 (2012).</li><li>Mueller, K. P., Schnaedelbach, O. D., Russig, H. D., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VisioTracker,+an+innovative+automated+approach+to+oculomotor+analysis.">VisioTracker, an innovative automated approach to oculomotor analysis.</a> J. Vis. Exp. (56), e3556 (2011).</li><li>Zou, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+optokinetic+response+to+study+visual+function+of+zebrafish.">Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).</li><li>Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurements+of+the+optokinetic+response+in+adult+fish.">Quantitative measurements of the optokinetic response in adult fish.</a> J. Neurosci. Methods. 186, 29-34 (2010).</li><li>Li, L., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dominant+form+of+inherited+retinal+degeneration+caused+by+a+non-photoreceptor+cell-specific+mutation.">A dominant form of inherited retinal degeneration caused by a non-photoreceptor cell-specific mutation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 11645-11650 (1997).</li><li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish.">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li><li>Maaswinkel, H., Mason, B., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENU-induced+late-onset+night+blindness+associated+with+rod+photoreceptor+cell+degeneration+in+zebrafish.">ENU-induced late-onset night blindness associated with rod photoreceptor cell degeneration in zebrafish.</a> Mech. Ageing Dev. 124, 1065-1071 (2003).</li><li>Stujenske, J. M., Dowling, J. E., Emran, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bugeye+mutant+zebrafish+exhibits+visual+deficits+that+arise+with+the+onset+of+an+enlarged+eye+phenotype.">The bugeye mutant zebrafish exhibits visual deficits that arise with the onset of an enlarged eye phenotype.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4200-4207 (2011).</li><li>Veth, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+zebrafish+lrp2+result+in+adult-onset+ocular+pathogenesis+that+models+myopia+and+other+risk+factors+for+glaucoma.">Mutations in zebrafish lrp2 result in adult-onset ocular pathogenesis that models myopia and other risk factors for glaucoma.</a> PLoS Genet. 7, e1001310 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Cagenello, R., Arditi, A., Halpern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binocular+enhancement+of+visual+acuity.">Binocular enhancement of visual acuity.</a> J. Opt. Soc. Am. A Opt. Image Sci. Vis. 10, 1841-1848 (1993).</li><li>Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optokinetic+response+of+zebrafish+larvae.">Measuring the optokinetic response of zebrafish larvae.</a> Nat. Protoc. 1, 2448-2451 (2006).</li><li>Hodel, C., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-based+analysis+of+the+optokinetic+response+in+zebrafish+larvae.">Computer-based analysis of the optokinetic response in zebrafish larvae.</a> CSH Protoc. 2008, pdb prot4961 (2008).</li><li>Huber-Reggi, S. P., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+optokinetic+response+in+zebrafish+by+computer-based+eye+tracking.">Analysis of optokinetic response in zebrafish by computer-based eye tracking.</a> Methods Mol. Biol. 935, 139-160 (2013).</li><li>Tappeiner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+acuity+and+contrast+sensitivity+of+adult+zebrafish.">Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish.</a> Front. Zool. 9, 10 (2012).</li><li>Saszik, S., Bilotta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+temperature+on+the+dark-adapted+spectral+sensitivity+function+of+the+adult+zebrafish.">The effects of temperature on the dark-adapted spectral sensitivity function of the adult zebrafish.</a> Vision Res. 39, 1051-1058 (1999).</li><li>Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+acuity+in+larval+zebrafish:+behavior+and+histology.">Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology.</a> Front. Zool. 7, 8 (2010).</li><li>Curcio, C. A., Sloan, K. R., Kalina, R. E., Hendrickson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+photoreceptor+topography.">Human photoreceptor topography.</a> J. Comp. Neurol. 292, 497-523 (1990).</li><li>Kalloniatis, M., Luu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Acuity. , (1995).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In occasione i pesci possono sfuggire nel serbatoio dell&#39;acqua. E &#39;fondamentale per immobilizzare la coda. Inoltre, l&#39;uso di un sottile spugna / asciugamano sopra il corpo del pesce è stato trovato anche per essere prezioso per mantenere i pesci sospesi per periodi di tempo prolungati. Siamo riusciti a mantenere i pesci immobilizzati per più di 30 minuti utilizzando questa procedura senza danneggiare il pesce. Questo lasso di tempo è più che sufficiente per fare il binocolo e due acuità monoculare. La presentazione del reticolo può essere fatto come descritto qui e altrove utilizzando un tamburo rotante fisicamente o presentando un display digitale 18-22. Entrambi i tipi hanno vantaggi e svantaggi specifici. Abbiamo scelto di utilizzare la rotazione fisica, sia per ragioni di costo e le specifiche tecniche. Escludendo il computer e apparecchiature di imaging, il dispositivo okr qui descritto può essere costruito per circa $ 150. Il okr è un mezzo obiettivo di determinare vismanuale acutezza in zebrafish adulto. Mentre diversi altri saggi visuomotori per la visione sono stati utilizzati in precedenti esperimenti e anche dell&#39;elettroretinogramma è stato fatto con successo negli occhi di zebrafish adulto, anche se non è stato fortemente utilizzato, il okr zebrafish adulto apre le porte a molte nuove condizioni sperimentali 22. Questo studio ha dimostrato l&#39;utilità della OKR a misurare la variazione di acuità visiva nel tempo, identificando differenza visiva acuità in modelli di malattia oculare, e nel determinare monoculare acuità visiva. È interessante notare che, adulto visione zebrafish rispetto alla visione umana (20/20) è di circa 20/1, 000 (0.60 quando CPD è convertito a -0,3 logMAR). Anche se questo può sembrare poveri, gli occhi zebrafish sono molto adatti per il suo ambiente. Nonostante il compito visivo di guardare attraverso 6,5 centimetri di acqua, pochi millimetri di policarbonato, e un altro centimetro d&#39;aria, il pesce eseguire abbastanza bene! Abbiamo scoperto che l&#39;acuità zebrafish adulto è about 70% di quello che sarebbe prevedibile data la loro spaziatura dei fotorecettori. 23 Contrasto che, con le prestazioni umane ottimali ~ 20/12, che è circa il 80% del predetto 20/10, e la tecnica okr per misurare la capacità visiva in zebrafish adulto è impressionante 24 , 25. La tecnica di misura occhio acuità visiva indipendenti consentirebbe di studi in cui un occhio poteva essere trattata e l&#39;altro utilizzato come controllo. Inoltre, il pesce con lo sviluppo degli occhi asimmetrico come il lrp2/bugeye o pesce che si sviluppano cataratta potrebbero essere monitorati con maggiore precisione. Va notato che la cura deve essere presa per misurare con precisione la distanza tra gli occhi e le strisce e per occludere l&#39;intero campo visivo. Questa tecnica dovrebbe aprire la porta a misure più accurate e specifiche della funzione visiva zebrafish.

Zebrafish (Danio rerio) sono un buon modello per studiare la fisiologia visiva a causa della somiglianza della loro retina ad altri vertebrati, il loro ciclo di vita breve, e la disponibilità di mutanti geneticamente modificati 1,2. Il riflesso optocinetico / risposta / nistagmo (okr) è una combinazione di esercizio regolare e rapidi movimenti oculari saccadi. Per oltre 60 anni i clinici hanno dimostrato che la OKR può essere utilizzato per misurare oggettivamente acuità visiva in pazienti ed è particolarmente utile per determinare infantili capacità visive 3-5. Il primo uso documentato di okr in animali stava usando piccioni nel 1950 6. Più di recente, il okr è diventato uno strumento prezioso per valutare la funzione visiva in zebrafish larvale ed è spesso usato per schermare per mutanti genetici che hanno una compromissione 1,2 visiva. Mentre il OKR è stato ampiamente utilizzato per determinare la funzione visiva in zebrafish larvale ma solo recentemente è stato dimostrato in zebra adultopescare 7-10. Un recente articolo di Tappeiner et al. Utilizza un sistema di optomotor disponibile in commercio tradizionalmente usato per i topi, OptoMotry, per dimostrare che l&#39;acuità visiva di zebrafish adulto rimane abbastanza costante, ~ 0.59 cicli per grado (CPD), anche attraverso diverse velocità angolari 7 . Sebbene il OKR ha dimostrato di essere molto utile in studi zebrafish larvali, altri metodi per comportamento visivo sono stati utilizzati in zebrafish adulti con vari gradi di successo. Il saggio di risposta di fuga dimostrato che albino e rubino zebrafish, entrambi mutanti pigmentazione, hanno ridotto risposte visive in condizioni di luce intensa 11,12. Questa stessa analisi di risposta di fuga è successo anche individuato cecità notturna d mutanti, anche se a 2 anni di 13 anni. Tuttavia, il saggio risposta escape non è senza difetti. E &#39;difficile attribuire a una funzione visiva esatta ed è solo un approximatio lordon di cambiamenti visivi - il che significa che ci vuole un grande cambiamento prima che venga identificato il cambiamento. Un altro metodo che è stato sviluppato per identificare zebrafish adulto con disabilità visive è la risposta optomotor (OMR) 11. In questo saggio, pesce è messo in una vasca circolare con una colonna opaca al centro. Strisce bianche e nere ruotano attorno al serbatoio e il pesce ha il compito di nuotare nella direzione del moto striscia. Come la risposta di fuga, l&#39;OMR si concentra sulle capacità visuomotori di zebrafish adulto. Si è tuttavia usato con successo per identificare pesce con problemi di vista, come i mutanti lrp2/bugeye 14. I lrp2/bugeye buftalmo espositive zebrafish, elevata pressione intraoculare, diminuiti OMR, e progressiva degenerazione retinica 14,15. Molti studi hanno utilizzato le funzionalità visuomotori di zebrafish adulto, che sono spesso soggettivi e non possono essere quantitatively analizzato. Utilizzando il okr, si può studiare l&#39;acuità visiva dei pesci adulti più obiettiva. Abbiamo costruito il nostro dispositivo okr, sul modello di quello inizialmente usato per gli studi larvali 1. In questo studio dimostriamo che la okr può essere usata per calcolare sia monoculare e binoculare acuità visiva in zebrafish.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:209px;">Super Low Light Black White Video Security Camera</td>
			<td style="width:143px;">Super Circuits</td>
			<td style="width:119px;">PC164CEX-2</td>
			<td style="width:124px;"> Any low light camera may be used</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:209px;">Arduino Duemilanove microcontroller</td>
			<td style="width:143px;">Adafruit Industries</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:124px;"> The Arduino Uno is also compatible with the speed control software.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine Methanesulfonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101107-950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish

Zebrafish sono un modello collaudato per la ricerca di visione, tuttavia molti dei metodi precedenti generalmente focalizzati su larve o dimostrato una semplice risposta. Più di recente comportamento visivo adulto in zebrafish è diventato di interesse, ma i metodi per misurare risposte specifiche sono nuova venuta. Per colmare questa lacuna, abbiamo deciso di sviluppare una metodologia per utilizzare ripetutamente e con precisione la risposta optocinetico (okr) per misurare l&#39;acuità visiva in zebrafish adulto. Qui mostriamo che l&#39;acuità visiva del zebrafish adulto può essere misurata, inclusi sia i acuità visiva binoculare e monoculare. Poiché il pesce non è danneggiato durante la procedura, l&#39;acuità visiva può essere misurato e confrontato su brevi o lunghi periodi di tempo. Le misure di acuità visiva qui descritte possono anche essere fatto in fretta per consentire un elevato throughput e per le procedure visivi supplementari se lo desideri. Questo tipo di analisi è favorevole a studi di intervento droga o ricerche di progressione della malattia.

Okr funzionalità del dispositivo Il dispositivo OKR come spiegato sopra e mostrato in Figura 1 funziona con una manutenzione minima. Come osservato nella fase 2.3, immobilizzando la coda è fondamentale per mantenere il pesce trattenuto durante la registrazione. Sufficientemente immobilizzato, i pesci possono essere tenuti nel dispositivo okr per periodi di tempo prolungati. Di conseguenza, occorre prestare attenzione durante le fasi iniziali di immobilizzazione, in modo che più dati possono essere raccolti per ogni singolo pesce. Misure di acuità visiva Il binocolo okr è facilmente raggiunta in normale pesci adulti. Seguendo la procedura di cui sopra si possono trovare acuità visiva per zebrafish di molte età (Figura 2). La migliore acuità spaziale binoculare abbiamo registrato era 0,74 CPD. Come osservato in Figura 2, l&#39;acuità binoculare generalmente aumenta con l&#39;età (n = 46, p = 0,002 ANOVA utilizzando SPSS v14), ma si livelladopo circa 12 mesi di età. Quando abbiamo confrontato l&#39;acuità visiva misurata in 5 mesi wild type pesce pari età lrp2/bugeye pesce, abbiamo scoperto che il pesce lrp2/bugeye ha ridotto significativamente l&#39;acuità (p &lt;0,001; wild-type: 0.49 ± 0.05 CPD; n = 8; lrp2/bugeye: 0.35 ± 0.06, n = 10; T-test di Student utilizzando Excel). Occludendo l&#39;occhio destro l&#39;acuità visiva per l&#39;occhio sinistro può essere determinato e viceversa. Rispetto alla acutezza binoculare, sommatoria binocolo si osserva in modo simile alla visione umana 17 (Figura 3). L&#39;acuità binoculare era generalmente il 5-10% in più rispetto sia a destra (OD) oa sinistra (OS) acutezza misurati in maniera indipendente. Per alcuni singoli pesci la differenza era un miglioramento del 25%. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50832/50832fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Reco okrrding. A) Il dispositivo okr è costituito da un diametro di 14,5 centimetri tamburo e microscopio con le impostazioni di intensità di luce regolabile (300-8,000 lux) rotante. Una telecamera fornisce un feed in tempo reale su un monitor adiacente. Il tamburo rotante ha diverse impostazioni di velocità in entrambe le direzioni in senso orario e antiorario e grate di frequenze spaziali intercambiabili sono inserito e rimosso come necessario. B) I pesci sono garantiti e posta al centro del tamburo rotante. C) Cicli per grado (CPD) è calcolato utilizzando CPD = <img alt="" src="img2.png" /> <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50832/50832fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50832/50832fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. L&#39;acuità visiva cambia con l&#39;età. Il grafico mostra acuità visiva indipendenti di misura 5 -<html> 15 mesi di età. L&#39;acuità visiva aumenta in generale per tutto il primo anno di sviluppo e poi code fuori un po &#39;a 15 mesi di età (p = 0.002 ANOVA utilizzando SPSS v14). Ogni punto può sia rappresentare uno o più pesci. L&#39;acuità visiva è misurata in cicli / grado (CPD). (N = 46 in totale, 8 a 5 mesi, 4 a 6 mesi, 7 a 8 mesi, 6 a 9 mesi, 11 a 10 mesi; 2 a 11 mesi, 2 a 12 mesi e 6 a 15 mesi). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50832/50832fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50832/50832fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. Binoculare acuità visiva effetto sommatoria. Il binocolo (OU) acuità visiva è generalmente superiore rispetto a destra (OD) oa sinistra (OS) acutezza dell&#39;occhio. In questo particolare gruppo i acutezza OS erano significativamente più bassi. (* P = 0,006, N = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.

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The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish sono stati uno strumento prezioso per molte aree di ricerca. Qui mostriamo un metodo per provocare una risposta visiva e calcolare una acuità visiva funzionale nel zebrafish adulto.

La risposta Optokinetic come una misura quantitativa di acuità visiva in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

the-optokinetic-response-as-quantitative-measure-visual-acuity

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.4K Views.  Western University of Health Sciences.  Zebrafish sono stati uno strumento prezioso per molte aree di ricerca. Qui mostriamo un metodo per provocare una risposta visiva e calcolare una acuità visiva funzionale nel zebrafish adulto. 

Video: The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Ricerca

Neuroscienze

Hyponeophagia: A Measure of Anxiety in the Mouse

Before the present day, when fast-acting and potent rodenticides such as alpha-chloralose were not yet in use, the work of pest controllers was often hampered by a phenomenon known as "bait shyness". Mice and rats cannot vomit, due to the tightness of the cardiac sphincter of the stomach, so to overcome the problem of potential food toxicity they have evolved a strategy of first ingesting only very small amounts of novel substances. The amounts ingested then gradually increase until the animal has determined whether the substance is safe and nutritious. So the old rat-catchers would first put a palatable substance such as oatmeal, which was to be the vehicle for the toxin, in the infested area. Only when large amounts were being readily consumed would they then add the poison, in amounts calculated not to affect the taste of the vehicle. The poisoned bait, which the animals were now readily eating in large amounts, would then swiftly perform its function.
Bait shyness is now used in the behavioural laboratory as a way of measuring anxiety. A highly palatable but novel substance, such as sweet corn, nuts or sweetened condensed milk, is offered to the mice (or rats) in a novel situation, such as a new cage. The latency to consume a defined amount of the new food is then measured.
Robert M.J. Deacon can be reach at <a href="mailto:robert.deacon@psy.ox.ac.uk">robert.deacon@psy.ox.ac.uk</a>

Mice and rats, due to their innate cautiousness, are initially slow in consuming a novel food, particularly in a novel place. This hyponeophagia can readily be measured in the laboratory, even though laboratory animals are much less anxious than their wild counterparts

Hyponeophagia: una misura di ansia nel mouse

Before the present day, when fast-acting and potent rodenticides such as alpha-chloralose were not yet in use, the work of pest controllers was often ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Registrazione potenziale evocato visivo in un modello murino di sperimentale del nervo ottico demielinizzazione

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In Vivo Gene Transfer di cellule di Schwann nel nervo sciatico roditori da elettroporazione

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

Condizionamento del corteggiamento di Drosophila come misura dell&#39;apprendimento e della memoria

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for the investigation of processes of neurodegeneration, neuroprotection and neuro-repair involving the visual system, as these often correlate well with retinal changes. As a functional readout, visually evoked compensatory eye and head movements are commonly used in experimental models involving the visual function. Combining both techniques allows a quantitative in vivo investigation of structure and function, which can be used to investigate the pathological conditions or to evaluate the potential of novel therapeutics. A great benefit of the presented techniques is the possibility to perform longitudinal analyses allowing the investigation of dynamic processes, reducing variability and cuts down the number of animals needed for the experiments. The protocol described aims to provide a manual for acquisition and analysis of high quality retinal scans of mice and rats using a low cost customized holder with an option to deliver inhalational anesthesia. Additionally, the proposed guide is intended as an instructional manual for researchers using optokinetic response (OKR) analysis in rodents, which can be adapted to their specific needs and interests.

A detailed protocol for the assessment of structural and visual readouts in rodents by optical coherence tomography and optokinetic response is presented. The results provide valuable insights for ophthalmologic as well as neurologic research.

Tramite tomografia ottica di coerenza e risposta Optokinetic come strutturale e funzionale sistema visivo letture in topi e ratti

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% of the total stroke-related mortality with an important morbidity in terms of neurological outcome. A delayed cerebral vasospasm (CVS) may occur most often in association with a delayed cerebral ischemia. Different animal models of SAH are now being used including endovascular perforation and direct injection of blood into the cisterna magna or even the prechiasmatic cistern, each exhibiting distinct advantages and disadvantages. In this article, a standardized mouse model of SAH by double direct injection of determined volumes of autologous whole blood into the cisterna magna is presented. Briefly, mice were weighed and then anesthetized by isoflurane inhalation. Then, the animal was placed in a reclining position on a heated blanket maintaining a rectal temperature of 37 &#176;C and positioned in a stereotactic frame with a cervical bend of about 30&#176;. Once in place, the tip of an elongated glass micropipette filled with the homologous arterial blood taken from carotid artery of another mouse of the same age and gender (C57Bl/6J) was positioned at a right angle in contact with the atlanto-occipital membrane by means of a micromanipulator. Then 60 &#181;L of blood was injected in the cisterna magna followed by a 30&#176; downward tilt of the animal for 2 minutes. The second infusion of 30 &#181;L of blood into the cisterna magna was performed 24 h after the first one. The individual follow-up of each animal is carried out daily (careful evaluation of weight and well-being). This procedure allows a predictable and highly reproducible distribution of blood, likely accompanied by intracranial pressure elevation that can be mimicked by an equivalent injection of an artificial cerebral spinal fluid (CSF), and represents an acute to mild-model of SAH inducing low mortality.

We described in this protocol a standardized subarachnoid hemorrhage (SAH) mouse model by a double injection of autologous whole-blood into the cisterna magna. The high degree of standardization of the double-injection procedure represents a middle-to-acute model of SAH with relative safety regarding mortality.

Doppia iniezione diretta di sangue nella Cisterna Magna come modello di emorragia subarachnoide

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

La risposta Optokinetic come una misura quantitativa di acuità visiva in Zebrafish

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Doppia fluorescenza In situ nelle sezioni cervello fresco