Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R01 HL109420 a WM e AHA 9320033N a LY.

Topo allotrapianto e singenico modello di trapianto di innesto Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali istituzionale e comitati uso di Yale. Per il modello di allotrapianto, segmenti di aorta toracica da maschio, 4-5 settimane vecchia WT (C57BL/6J) o IFN-γR-KO sono stati interposti in aorta addominale del destinatario femminile, 8-12 settimane di età WT utilizzando un end-to -end microchirurgico tecnica anastomotica (vedi successivo per i dettagli). Per il modello innesto singenico, segmenti di aortae toracica da Male, la settimana 4-5 topi WT sono stati interposti nella aortae addominale del maschio, 8-12 settimane di età IFN-γR1-KO con una soluzione end-to-end microchirurgico tecnica anastomotica. Dopo 1 settimana dopo l&#39;intervento, gli animali sono stati inoculati iv con Ad5.CMV-topo IFN-γ o Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) a 1 x 10 9 PFU. Siero del mouse IFN-γ livelli sono stati misurati mediante test ELISA (eBioscience) a 1 e 5 settimane dopo la somministrazione di adenovirus. Taluni animali hanno ricevuto BrdU(Sigma-Aldrich) a 100 mg / kg sc per 2 settimane prima del sacrificio. End-to-end microchirurgica tecnica anastomotica (video verranno intraprese per questa parte): 1. Procedura donatore <ol><li> Anestetizzare i topi donatori con iniezioni intraperitoneali di ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). </li><li> Dopo aver verificato l&#39;anestesia adeguata, mettere i topi donatori sotto il microscopio operatorio a X8-30 ingrandimento su un vassoio in posizione supina, e l&#39;uso di iodio Prep Pad e alcol Prep Pad per la preparazione della parete toracica. </li><li> Incidere la parete toracica anteriore attraverso le nervature e il diaframma per esporre il cuore. </li><li> Aprire l&#39;atrio destro, iniettare 10 ml di eparina (100 U / ml) di soluzione salina nel ventricolo sinistro per svuotare i topi utilizzando una siringa da 10 ml con un ago calibro 25. </li><li> Resecare cuore e polmoni per esporre l&#39;intera lunghezza dell&#39;aorta toracica. </li><li> Sezionare attentamente l&#39;aorta toracica per minimizzare il trauma diretto, while identificare, legare e sezionare i rami legname che utilizzano 11-0 sutura vicino l&#39;aorta. </li><li> Una volta che l&#39;aorta toracica è libera dal tessuto circostante, accise tutta aorta toracica per il trapianto. </li><li> Lavare l&#39;estremità del taglio dell&#39;aorta donatore con eparina (100 U / ml) di soluzione salina, e memorizzarlo nella stessa soluzione sul ghiaccio (fino a 6 ore) fino al trapianto. </li></ol> 2. Procedura destinatario <ol><li> Iniettare i topi riceventi con ip ketoprofene (5 mg / kg) per l&#39;analgesia, e thenanesthetize i topi con ketamina ip (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). I topi riceventi sono profondamente anestetizzati entro 10 minuti per una durata di 60-90 min. Durante l&#39;intervento, il livello di anestesia viene valutata ogni 15 min da pizzicare la parete addominale anteriore o il piede con pinze. Se l&#39;animale reagisce agli stimoli nocivi in ​​qualsiasi momento durante l&#39;intervento, un&#39;ulteriore dose di chetamina e xilazina (1/4 o 1/3 della dose originale) sarà somministrato per sc o im </li><li> Dopo aver verificato l&#39;anestesia adeguata, radere il pelo nella parete addominale anteriore con un rasoio elettrico, pulire la pelle con Iodio Prep Pad e alcol Prep Pad, coprire gli occhi con pomata oftalmica. Durante la chirurgia, le seguenti tecniche asettiche saranno utilizzati per le operazioni di pulizia, compreso il tavolo operatorio con 10% di candeggina, indossando guanti sterili e utilizzando strumenti di microchirurgia sterilizzati (strumenti sterilizzati per l&#39;inizio dell&#39;operazione, vetro poi caldo bead-sterilizzato strumenti tra i più operazioni, ecc.) </li><li> Collocare i topi riceventi al microscopio operativo ad un ingrandimento di X8-30 su un vassoio in posizione supina. </li><li> Incidere la parete addominale sulla linea mediana da xifoidea al pube, e diffondere la parete addominale le superfici usando un micro-retrattore per esporre la cavità addominale. </li><li> Ritrarre l&#39;intestino superiormente e avvolgere con una garza inumidita con soluzione fisiologica. I topi riceventi soffrano il freddo da perdita di heaT attraverso intestino esternalizzati. È importante mantenere il calore animale. Tuttavia, il bordo del riscaldamento non viene usato durante la chirurgia come modesta ipotermia è utile per prevenire lesioni spinali durante l&#39;occlusione del flusso ematico aortico e vi è poco efficiente trasferimento di calore con il flusso di sangue assente alla metà inferiore del corpo topi. </li><li> Spostare gli organi riproduttivi inferiormente, avvolgere le zone addome di topi riceventi con garza salina-soluzione-inumidito, e usarlo per ritrarre il retto al lato destro dell&#39;addome. I tessuti esposti sono irrigati periodicamente con soluzione salina durante il trapianto. </li><li> Sezionare senza mezzi termini un segmento di aorta sottorenale tra il vaso renale prossimale e distale biforcazione aortica e separare dalla vena cava inferiore (IVC) con attenzione. </li><li> Identificare e legare tutti i piccoli rami provenienti da questo segmento di aorta addominale utilizzando 11-0 poliammide monofilamento sutura. </li><li> Cross-clamp il segmento isolato di unaaorta bdominal utilizzando due morsetti vascolari proximately 5 millimetri a parte, uno ad ogni estremità. </li><li> Transezione l&#39;aorta addominale tra il morsetto con taglienti micro-forbici per creare i siti anastomosi. </li><li> Resecare un piccolo segmento di aorta addominale (fino a 0,4 mm di lunghezza) da una estremità tagliata di transected destinatario aorta per accogliere il graft aortico donatore. </li><li> Lavare i segmenti aortici tra i morsetti utilizzando soluzione fisiologica con eparina per rimuovere il sangue residuo. I segmenti aortici tra morsetti e l&#39;innesto aortico donatore sono irrigati periodicamente con eparina (100 U / ml) di soluzione salina (fino a 40 ml / kg) durante anastomosi. </li><li> Transezione entrambi i lati del donatore aorta con taglienti micro-forbici per creare un innesto segmento di 2,5 mm di lunghezza per il trapianto. </li><li> Posizionare l&#39;innesto aortico donatore in posizione ortotopico, anastomose estremità prossimale e distale del donatore dell&#39;innesto a fine taglio prossimale e distale del destinatario dell&#39;aorta addominale, rispettivamente, con un fine-tmodello o-end utilizzando 11-0 poliammide monofilamento sutura. </li><li> Per le continue suture, posizionare i punti di sutura soggiorno a 3 e 9 posizioni in primo luogo. Tra due suture a ogni lato del graft, anastomose entrambi i bordi tagliati in 3-4 punti utilizzando le suture in esecuzione, e legare le suture in esecuzione per rimanere suture con un doppio nodo. Poiché i due strati di chiusura sono continui, il rischio di deiscenza è aumentato. L&#39;innesto aortico donatore dovrebbe essere di lunghezza adeguata per collegare all&#39;estremità di taglio prossimale e distale del destinatario della aorta addominale. </li><li> Per i punti staccati, costruire quattro anastomosi a 3 e 9 posizioni in entrambi i lati del trapianto in primo luogo, e anastomose entrambi i bordi tagliati in 3-4 punti di sutura tra due punti di sutura soggiornare in ogni lato del trapianto. </li><li> Rilasciare il morsetto distale per consentire il flusso retrogrado in trapianto, identificare le sedi di sanguinamento e fare punti aggiuntivi entro 3 minuti. </li><li> Dopo aver accertato l&#39;emostasi soddisfacente, allentare il morsetto prossimale. </li><li> Confermare la pervietà dell&#39;innesto dalla presenza di pulsazione vigorosa l&#39;innesto e il segmento adiacente prossimale dell&#39;aorta addominale nativa, in particolare nel segmento adiacente distale dell&#39;aorta addominale e mesenterica inferiore. Considerare trombosi in siti anastomotiche se la pulsazione diminuisce nel giro di pochi minuti dopo il ripristino del flusso sanguigno. </li><li> Restituire l&#39;intestino nella cavità addominale. </li><li> Suturare chiudere la parete addominale utilizzando 5-0 sutura in nylon strato muscolare e lo strato della pelle, rispettivamente. </li><li> Mettere i topi riceventi in una gabbia pulita sulla sommità di una piastra elettrica, e aspettare 1-2 ore per i topi a riprendere coscienza e recuperare da anestesia. È importante mantenere un&#39;adeguata animale calore durante il recupero. Tenere i topi in gabbia caldo e asciutto prima di scia animale dall&#39;anestesia. </li><li> Valutare la funzione motoria degli arti posteriori dopo il recupero topi, e di nuovo il secondo giorno. Un intervento chirurgico di trapianto di successo verrà confermato if nessuna disfunzione degli arti posteriori è osservata in topi riceventi il ​​secondo giorno. </li><li> Amministrare i topi riceventi con ketoprofene in acqua potabile (5 mg / kg / d = 27 ug / ml in acqua potabile) per 48 ore. Se alcuni topi riceventi soffrono di dolore non trattato dagli analgesici postoperatori come dimostra la perdita di mobilità, il mancato sposo, anormale ricompattato postura, ecc, saranno sacrificati. Gli animali saranno sacrificati a fine punti predefiniti dopo 1-60 giorni. </li></ol> Analisi Graft Innesti di arteria del trapianto sono stati acquistati a 4 settimane e innesti a modello dell&#39;innesto singenico erano sei settimane dopo l&#39;intervento (5 settimane dopo l&#39;infezione virale) e analizzati mediante tecniche istologiche standard per Elastica-van Gieson (EVG) colorazione ematossilina eosina (HE) colorazione e colorazione di immunofluorescenza. Foto sono state scattate con un sistema di microscopia di immunofluorescenza (Zeiss). Conteggio delle cellule di nuclei circondati da immunoistochimica positiva è stata eseguireed in alto ingrandimento e in media da 5 sezioni per ogni innesto. Le misurazioni dell&#39;area innesto del lume (entro l&#39;endotelio), intimale (tra la lamina elastica interna ed endotelio, IEL), media (tra il IEL e della lamina elastica esterna, EEL), spessore di parete (tra la lamina elastica esterna ed endotelio) e vaso intero (entro l&#39;anguilla) sono stati calcolati da 5 seriali sezioni, 150 micron a parte per ogni innesto, utilizzando l&#39;analisi computer-assistita e NIH Immagine 1.60 ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/nih-image</a> ). L&#39;analisi statistica Tutti i dati sono espressi come media ± SEM. Due code, t test appaiati e un due vie ANOVA = analisi sono state eseguite utilizzando il programma software Prism (GraphPad Software). Differenze con p &lt;0,05 sono stati considerati come statisticamente significativi.

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Res. 109, 418-427 (2011).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

I protocolli descritti si concentrano su modelli murini GA. Le procedure possono essere applicate ad altri modelli di trapianto innesto. Questi modelli includono xenotrapianto umanizzato (cioè segmenti di arterie coronariche umane interposti nella aortae infra-renale di topi immunodeficienti), e il rigetto acuto del mouse modello GA (cioè una aorta mouse da un ceppo genetico in un altro ceppo ricevente genetica). I nostri modelli murini descritti sono più per chiudere le lesioni GA umani. Il primo m...

Arteriosclerois Graft (GA), chiamati anche vasculopatia allotrapianto, è una lesione patologica che si sviluppa nel corso di mesi o anni di organi trapiantati caratterizzate da diffusa, stenosi circonferenziale dell&#39;intero albero vascolare dell&#39;innesto 7. Fasi precoci possono causare stenosi eccentriche e focale che sono più evidenti nelle arterie, quindi più da vicino assomiglia stenosi visto in aterosclerosi convenzionale. La perdita lume dei vasi dell&#39;innesto risultati espansione intimale causa di infiltrazioni di cellule T e macrofagi ospite e soprattutto per l&#39;accumulo di matrice extracellulare e di muscolo liscio-come cellule originati da trapianto, host o entrambi 5, 13, 19, che è insufficientemente compensata da esterno nave rimodellamento. In allotrapianti cardiaci, le lesioni clinicamente più significative sono quelle nelle arterie coronarie e epicardiche intramiocardica. In definitiva, GA delle arterie coronarie provoca insufficienza cardiaca ischemica. GA è la principale causa di ritardo gr cardiacoperdita di poppa. Le stenosi di GA fermano le linee di sutura, che implica fortemente la risposta dell&#39;ospite a alloantigeni innesto nella sua patogenesi e che ci porta a classificare GA come una forma di rigetto cronico 3. Tuttavia, altre forme di lesione arteriosa può aumentare il rischio di GA, sia attraverso aumentando il carico netto di lesioni o intensificando e / o modulare la risposta allo immune. La cella (CE) rivestimento endoteliale delle arterie innesto viene conservata in GA umano e le regioni più superficiali del intimale adiacente al rivestimento CE è il sito più pesantemente infiltrati da host-derived IFN-γ-producono cellule T e macrofagi 11; nella alcuni pazienti GA è associato con lo sviluppo di alloanticorpi donatore-specifici che si legano a innesto EC 16 ma i vasi mostrano poca prova della necrosi fibrinoide che è caratteristica di rigetto acuto anticorpo-mediata 11. Il componente più critico di GA patogenesi è laproliferazione di cellule muscolari lisce-simili all&#39;interno del intima, se questo processo può essere arrestato, GA è improbabile a progredire. Precedente lavoro del nostro gruppo aveva dimostrato che intimas di segmenti di arterie coronariche umane interposti nella aortae infra-renale di topi immunodeficienti espandono in risposta a cellule T umane allogeniche adoptively trasferiti al donatore arteria e che questo processo potrebbe essere inibito neutralizzando umana IFN- γ 18. Inoltre esogeno IFN-γ umano potrebbe causare intimale (e mediale) cellule muscolari lisce (VSMC) proliferazione vascolare in questi innesti arteriosi in assenza di cellule umane T 15, 17. (E &#39;importante notare che uomo e topo IFN-γ non attraversare specie, escludendo gli effetti indiretti sulla ospite del mouse in questo sistema sperimentale). Questi modelli di topo umanizzato hanno il vantaggio di ricapitolare cellule T umano / interazioni delle cellule vascolari e il intimale Le lesioni sono in gran parte costituiti da cellule umane (cioè graft-derivato),Come è stato osservato in campioni clinici, ma non ricapitolare appieno la situazione clinica perché ignorano il ruolo dei macrofagi ospitanti e forse altri tipi di cellule coinvolte nelle lesioni trapianti clinici. Un modello convenzionale topo di questo processo potrebbe teoricamente risolvere questo problema, integrando le limitazioni del modello umanizzato coinvolgendo un sistema completo immunitario ospite e fornendo l&#39;ulteriore vantaggio di permettere la potenza di approcci genetici topo da applicare a GA. I due modelli di mouse più diffusi riguardano il trapianto di cuore eterotopico e arteria trapianto ortotopico 1. Le lesioni che si sviluppano nelle arterie dei trapianti di cuore eterotopico sono in gran parte costituiti da cellule ospiti, probabilmente di origine midollare, mentre le cellule intimale delle arterie a innesti cardiaci umani sono prevalentemente di origine innesto 5, 13, 19. Questa è una distinzione importante, che ha portato a sviluppare modelli alternativi del mouse. Interposizione diuna aorta topo da un ceppo in un altro ceppo ricevente mouse è ancora più limitata come modello per rigetto cronico nell&#39;uomo perché la risposta cellulo-mediata rigetto acuto in questo modello di topo elimina completamente tutte le cellule vascolari derivate dal donatore dal trapianto entro due-tre 19 settimane. Di conseguenza, le successive variazioni visti nel segmento del vaso interposto sono solo una risposta di cellule ospiti che hanno ripopolato il decellularized nave patibolo, creando una situazione estremamente artefatta di scarsa rilevanza come modello per i cambiamenti di vasi di innesto che si verificano nella clinica. Abbiamo recentemente sviluppato due nuovi modelli di mouse per aggirare questi problemi 21. Il primo modello prevede l&#39;interposizione di un segmento del vaso da un topo maschio in una femmina destinatario dello stesso ceppo inbred (C57BL/6J). Il secondo modello prevede l&#39;interposizione di un segmento di arteria da un tipo donatore C57BL/6J topo selvatico in un topo ospite dello stesso ceppo e genere che manca della receptor per IFN-γ (IFN-γR-KO), seguito da somministrazione di IFN-γ del mouse (distribuito mediante infezione del fegato del topo con un vettore adenovirale. Qui, descriviamo protocolli dettagliati ed i vantaggi dei nostri modelli murini GA.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J (H-2b)</td><td>Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)</td><td>000664</td><td>Donor (5 weeks)&lt;br/&gt; Recipient (8-12weeks)</td></tr><tr><td>Ketamine Hydrochloride Injection </td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td>Storage Solution(50 mg/ml)&lt;br/&gt; Working Solution(5 mg/ml)</td></tr><tr><td> Xylazine Sterile Solution</td><td>Lloyd Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td>Storage Solution(100 mg/ml)&lt;br/&gt; Working Solution(1 mg/ml)</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>NDC 0856-4396-01</td><td>Storage Solution(100 mg/ml)&lt;br/&gt; Working Solution-oral&lt;br/&gt; (0.027 mg/ml)</td></tr><tr><td>Heparin Sodium</td><td>Sagent Pharmaceticals</td><td>NDC 25021-400</td><td>Storage Solution(1000 U/ml)&lt;br/&gt; Working Solution(100 U/ml)</td></tr><tr><td>Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)</td><td>CareFusion</td><td>AL4109</td><td></td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride Injection</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td>To prepare the anesthetic </td></tr><tr><td>Petrolatum Ophthalmic Ointment </td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Iodine Prep Pads </td><td>Triad Disposables, Inc.</td><td>NDC 50730-3201-1</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Prep Pads</td><td>McKesson Corp.</td><td>NDC 68599-5805-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5693</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>F.S.T</td><td>15009-08</td><td>To transect the aorta of donor or recipient </td></tr><tr><td>Extra Narrow Scissors</td><td>F.S.T</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder/Forceps</td><td>MICRINS</td><td>MI1542</td><td>To hold the needle</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Standard Pattern Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>LANCASTER Eye Speculum</td><td>Zepf Medical Instruments</td><td>42-1209-07</td><td></td></tr><tr><td>Micro Vascular Clip</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-6472</td><td></td></tr><tr><td>Micro Clip Applying Forceps With Lock</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5440</td><td></td></tr><tr><td>Black Polyamide Monofilament Suture</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>Cat #T4A10Q07</td><td>10-0 suture, Needle=70 microns</td></tr><tr><td>Black Monofilament Nylon Suture</td><td>Syneture &lt;br/&gt; (Covidien)</td><td>SN-1956</td><td>6-0 suture</td></tr><tr><td>Non-Woven Songes</td><td>McKesson Corp.</td><td>Reorder No. 94442000</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>BD</td><td>REF 309659</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Syringe</td><td>BD</td><td>REF 309657</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>REF 309604</td><td></td></tr><tr><td>18G 1 1/2, Hypodermic Needle</td><td>BD</td><td>REF 305196</td><td></td></tr><tr><td>25G 7/8, Hypodermic Needle</td><td>BD</td><td>REF 305124</td><td></td></tr><tr><td>27G 1/2, Hypodermic Needle</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td></td></tr><tr><td>30G 1/2, Hypodermic Needle</td><td>BD</td><td>REF 305106</td><td></td></tr><tr><td>Hearting Pad</td><td>Sunbeam</td><td>Z-1228-001</td><td></td></tr><tr><td>Trimmer</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table 2. Specific reagents and equipment.&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

mouse models for graft arteriosclerosis

Arteriosclerois Graft (GA), chiamati anche vasculopatia allotrapianto, è una lesione patologica che si sviluppa nel corso di mesi o anni di organi trapiantati caratterizzate da diffusa, stenosi circonferenziale dell&#39;intero albero vascolare del trapianto. Il componente più critico di GA patogenesi è la proliferazione di cellule muscolari lisce-simili all&#39;interno dell&#39;intima. Quando un segmento di arteria coronaria umana è interposto nel aortae infra-renale di topi immunodeficienti, le intimas potrebbero essere espandono in risposta a cellule T umane adoptively trasferiti al donatore allogenico un&#39;arteria o esogena umana IFN-γ in assenza di cellule T umane. Interposizione di una aorta topo da un ceppo in un altro ceppo ricevente topo è limitato come modello per rigetto cronico nell&#39;uomo perché la risposta cellulo-mediata rigetto acuto in questo modello di topo elimina completamente tutte derivate dal donatore cellule vascolari del trapianto entro due-tre settimane. Abbiamo recentemente sviluppato due nuovi mOuse modelli per aggirare questi problemi. Il primo modello prevede l&#39;interposizione di un segmento del vaso da un topo maschio in una femmina destinatario dello stesso ceppo inbred (C57BL/6J). Rigetto in questo caso è diretto solo contro antigeni di istocompatibilità minori codificate dal cromosoma Y (presente nel maschio, ma non la femmina) e la risposta di rifiuto che ne deriva è sufficientemente indolente di conservare le cellule muscolari lisce derivate dal donatore per diverse settimane. Il secondo modello prevede l&#39;interposizione di un segmento di arteria da un tipo donatore C57BL/6J topo selvatico in un topo ospite dello stesso ceppo e genere che manca il recettore per IFN-γ seguita da somministrazione di topo IFN-γ (distribuito mediante infezione del mouse fegato con un vettore adenovirale. Non c&#39;è rigetto in questo caso come donatore e topi riceventi sono dello stesso ceppo e genere ma donatori cellule muscolari lisce proliferano in risposta alla citochina mentre ospitanti cellule derivate, privo recettore perquesta citochina, non rispondono. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, entrambi i modelli possono essere utilizzati per valutare l&#39;effetto di geni specifici sulla progressione GA. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per i nostri modelli di mouse GA.

Topo modello allotrapianto arteriosclerosi (GA): In questo modello, un donatore maschio aorta viene trapiantato nel ricevente femmina modo che l&#39;host induce risposte allo-mediate da cellule T alloreattive contro un antigene Y minore (il maschio-specifico minore di istocompatibilità HY) espressi sul l&#39;innesto 12, ed a sua volta prodotta da cellule T γ-IFN azionamenti VSMC proliferazione 20 come osservato in altri modelli di trapianto allogenico 2, 6, 8-10, 14. U...

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Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Descriviamo i protocolli per i nostri arteriosclerois innesto del mouse (GA) modelli che comportano l&#39;interposizione di un segmento di vaso del mouse in un destinatario dello stesso ceppo inbred. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, il modello è in grado di valutare l&#39;effetto di geni specifici in GA.

Modelli murini per l&#39;arteriosclerosi Graft

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Universidad de Cartagena UDEC

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Medicine

13.6K Views.  Yale University School of Medicine. Descriviamo i protocolli per i nostri arteriosclerois innesto del mouse (GA) modelli che comportano l'interposizione di un segmento di vaso del mouse in un destinatario dello stesso ceppo inbred. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, il modello è in grado di valutare l'effetto di geni specifici in GA.

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Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Aortica trapianto ortotopico in Mouse per lo studio della malattia vascolare

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Ricerca

Medicina

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. Its unique anatomy makes the spinotrapezius useful for investigation of ischemic injury and subsequent microvascular remodeling. Here, we demonstrate an arteriolar ligation model in the murine spinotrapezius muscle that was developed by our research team and previously published1-3. For certain vulnerable mouse strains, such as the Balb/c mouse, this ligation surgery reliably creates skeletal muscle ischemia and serves as a platform for investigating therapies that stimulate revascularization. Methods of assessment are also demonstrated, including the use of intravital and confocal microscopy. The spinotrapezius is well suited to such imaging studies due to its accessibility (superficial dorsal anatomy) and relative thinness (60-200 &mu;m). The spinotrapezius muscle can be mounted en face, facilitating imaging of whole-muscle microvascular networks without histological sectioning. We describe the use of intravital microscopy to acquire metrics following a functional vasodilation procedure; specifically, the increase in arterilar diameter as a result of muscle contraction. We also demonstrate the procedures for harvesting and fixing the tissues, a necessary precursor to immunostaining studies and the use of confocal microscopy.

We demonstrate a novel arterial ligation model in murine spinotrapezius muscle, including a step-by-step procedure and description of required instrumentation. We describe the surgery and relevant outcome measurements relating to vascular network remodeling and functional vasodilation using intravital and confocal microscopy.

Modello murino Spinotrapezius per valutare l&#39;impatto della legatura arteriolare sulla funzione microvascolare e rimodellamento

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating important information on the pathogenesis of lesion formation and the action of novel therapies. Use of atherosclerosis-prone mice, surgical methods of lesion induction, and dietary modification has dramatically improved understanding of the mechanisms that contribute to disease development and the potential of new treatments.
Classically, analysis of lesions is performed ex vivo using 2-dimensional histological techniques. This article describes application of optical projection tomography (OPT) to 3-dimensional quantitation of arterial lesions. As this technique is non-destructive, it can be used as an adjunct to standard histological and immunohistochemical analyses.
Neointimal lesions were induced by wire-insertion or ligation of the mouse femoral artery whilst atherosclerotic lesions were generated by administration of an atherogenic diet to apoE-deficient mice.
Lesions were examined using OPT imaging of autofluorescent emission followed by complementary histological and immunohistochemical analysis. OPT clearly distinguished lesions from the underlying vascular wall. Lesion size was calculated in 2-dimensional sections using planimetry, enabling calculation of lesion volume and maximal cross-sectional area. Data generated using OPT were consistent with measurements obtained using histology, confirming the accuracy of the technique and its potential as a complement (rather than alternative) to traditional methods of analysis.
This work demonstrates the potential of OPT for imaging atherosclerotic and neointimal lesions. It provides a rapid, much needed ex vivo technique for the routine 3-dimensional quantification of vascular remodelling.

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Generazione e quantificazione 3-Dimensional di arteriosa lesioni nei topi mediante tomografia ottica di proiezione

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Modello murino della alloimmune indotta Rifiuto vascolare e trapianto Arteriosclerosi

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

Utilizzando la tecnica di manica in un modello murino di trapianto aortico - un Video didattico

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.

Quantificazione dell'aterosclerosi nei topi

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Immunologia e infezioni

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor because of the acceleration of intimal hyperplasia due to the exposure to arterial blood pressure. The present protocol is designed for the establishment of experimental venous intimal hyperplasia by interposing rabbit jugular veins to the ipsilateral carotid arteries. The protocol does not require surgical procedures deep in the body trunk and the extent of the incision is limited, which is less invasive for the animals, allowing long-term observation after implantation. This simple procedure enables researchers to investigate strategies to attenuate the progression of intimal hyperplasia of the implanted vein grafts. Using this protocol, we reported the effects transduction of microRNA-145 (miR-145), which is known to control the phenotype of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the proliferative to the contractile state, into harvested vein grafts. We confirmed the attenuation of intimal hyperplasia of vein grafts by transducing miR-145 before implantation surgery through the phenotype change of the VSMCs. Here we report a less invasive experimental platform to investigate the strategies that can be used to attenuate intimal hyperplasia of vein grafts in revascularization surgeries.

The present protocol aims to experimentally create venous intimal hyperplasia by subjecting veins to arterial blood pressure for developing strategies to attenuate venous intimal hyperplasia following revascularization surgery using vein grafts.

Un modello di interposizione venosa di coniglio che imita la chirurgia di rivascolarizzazione usando grafts di venina per valutare l'iperplasia intima sotto la pressione sanguigna arteriosa

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor ...

Dolicoctasie: demenza vascolare e Alzheimer

A Visual Approach for Inducing Dolichoectasia in Mice to Model Large Vessel-Mediated Cerebrovascular Dysfunction

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to enter and expel excessive amino acids or toxins from the brain. To model how the BBB can be compromised in diseases like vascular dementia (VaD) or Alzheimer's disease (AD), researchers developed novel methods to model vessel dilatation. A compromised BBB in these disease states can be detrimental and result in the dysregulation of the BBB leading to untoward and pathological consequences impacting brain function. We were able to modify an existing technique that enabled us to inject directly into the Cisterna magna (CM) to induce dilatation of blood vessels using elastase, and disrupt the tight junctions (TJ) of the BBB. With this method, we were able to see various metrics of success over previous techniques, including consistent blood vessel dilatation, reduced mortality or improved recovery, and improving the fill/opacifying agent, a silicone rubber compound, delivery for labeling blood vessels for dilatation analysis. This modified minimally invasive method has had promising results, with a 19%-32% increase in sustained dilatation of large blood vessels in mice from 2 weeks to 3 months post-injection. This improvement contrasts with previous studies, which showed increased dilatation only at the 2 week mark. Additional data suggests sustained expansion even after 9.5 months. This increase was confirmed by comparing the diameter of blood vessels of the elastase and the vehicle-injected group. Overall, this technique is valuable for studying pathological disorders that affect the central nervous system (CNS) using animal models.

Autore in primo piano: Modellazione dei contributi vascolari alla malattia di Alzheimer nei topi transgenici

We demonstrate chemically inducing large blood vessel dilatation in mice as a model for investigating cerebrovascular dysfunction, which can be used for vascular dementia and Alzheimer's disease modeling. We also demonstrate visualizing the vasculature by injecting silicone rubber compound and providing clear visual guidance for measuring changes in blood vessel size.

Un approccio visivo per indurre la dolicoectasia nei topi per modellare la disfunzione cerebrovascolare mediata da grandi vasi

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to ...

Modelli murini per l'arteriosclerosi Graft

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Aortica trapianto ortotopico in Mouse per lo studio della malattia vascolare

Modello murino Spinotrapezius per valutare l'impatto della legatura arteriolare sulla funzione microvascolare e rimodellamento

Generazione e quantificazione 3-Dimensional di arteriosa lesioni nei topi mediante tomografia ottica di proiezione

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Modello murino della alloimmune indotta Rifiuto vascolare e trapianto Arteriosclerosi

Utilizzando la tecnica di manica in un modello murino di trapianto aortico - un Video didattico

Quantificazione dell'aterosclerosi nei topi

Un modello di interposizione venosa di coniglio che imita la chirurgia di rivascolarizzazione usando grafts di venina per valutare l'iperplasia intima sotto la pressione sanguigna arteriosa

Un approccio visivo per indurre la dolicoectasia nei topi per modellare la disfunzione cerebrovascolare mediata da grandi vasi

Un approccio visivo per indurre la dolicoectasia nei topi per modellare la disfunzione cerebrovascolare mediata da grandi vasi