Vorremmo ringraziare Scott Hamilton, ed i membri del laboratorio di O&#39;Halloran per la lettura attenta di questo manoscritto. Ringraziamo anche il nostro anonimo recensore per eccellenti suggerimenti e commenti penetranti.

1. Costruzione di GFP Tagged EGL-4 Animali Esprimere <ol><li> Clonare il traslazionale fusione GFP :: EGL-4 sotto il promotore per l&#39;ODR-3 gene (uso 2678 bp direttamente a monte del codone di inizio): (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4. L&#39;ODR-3 unità promotore espressione nelle coppie neurone amphid: AWA, AWB, AWC e debolmente in ASH. </li><li> Iniettare il plasmide (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4 in di tipo selvatico (N2) gli animali a 50 ng / mL con i co-iniezione utilizzando le normali marcatori della linea germinale tecniche di trasformazione 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / pl), e (p) ODR-1 :: DsRed 10 (25 ng / pl). L&#39;ODR-1 espressione promotore unità nel AWC e AWB amphid coppie di neuroni, e la-1 ofm espressione promotore unità negli coelomocytes. </li><li> Sottoporre gli animali transgenici che esprimono le matrici extracromosomici descritti al punto 1.2 per la ultravioletti (UV) / trimethylpsoralen (TMP), il protocollo di integrazione11. </li><li> Bleach sincronizzare gli animali 12 e coltivarli in Nematode crescita media (NGM) piastre contenenti OP50 E. coli alla fase L4. Lavare L4 animali in piatti NGM con M9 tampone per rimuovere OP50 E. coli batteri. </li><li> Rimuovere tampone M9 e aggiungere 50-100 ml di 30 mg / ml soluzione TMP lavoro sul verme pellet nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Avvolgere la provetta 1,5 ml in un foglio di bloccare la luce ambiente, e agitare delicatamente su un mixer per 15 minuti nella pellicola protettiva provetta 1,5 ml microcentrifuga. Trasferire i vermi nel TMP / worm soluzione ad un grande piatto NGM testa di serie. </li><li> Esporre i vermi sulla piastra NGM ai raggi UV 350 μJ (X100) utilizzando un Stratalinker 2400. Quindi aggiungere i vermi ad una piastra contenente OP50 NGM e incubare al buio per 5 ore. </li><li> Scegli 50 vermi transgenici a circa 10 piastre di teste di serie (2-5 vermi ogni piastra). Trasferimento P0 è a piatti nuovi ogni 24 ore per 3 giorni. </li><li> Scegli 250 F1 clonale unnimals (1 animale per piastra). Clone out 2-4 animali F2 da F1 ogni piatto. Controllare animali F3 per cercare una linea di trasmissione 100% cercando in (p) ofm-1 :: pattern di espressione GFP sotto un microscopio da dissezione fluorescente. </li><li> Outcross la riga finale integrato (s) con gli animali di tipo selvatico N2 5 volte. Si farà riferimento alla linea finale integrato di pyIs500, e la GFP-tagged EGL-4 molecola come GFP :: EGL-4. </li></ol> 2. La coltivazione e la manutenzione degli animali da saggi traslocazione nucleare <ol><li> Coltivate le pyIs500 animali a 25 ° C su piastre standard di 10 centimetri NGM (vedi sotto per ricetta) seminato con OP50 E. coli 13 (Figura 1). </li><li> Il giorno 1, scegliere 4-5 L4 pyIs500 animali da piastre coltivate a 25 ° C su cinque distinti 10 centimetri OP50 E. coli seminato piastre e incubare a 25 ° C (cioè, L4 4-5 animali per piastra). </li><li> Il giorno 4, lavare adulto populations di pyIs500 animali al largo delle piastre NGM di grandi dimensioni utilizzando S-basale del buffer (vedi sotto per ricetta). Utilizzare pipette in vetro usa e getta per trasferire gli animali, in quanto si attaccano al lato della puntali in plastica. </li></ol> 3. A lungo termine indotta Odore saggi traslocazione nucleare <ol><li> Lavare le pyIs500 animali 3 volte in S-basale per rimuovere i batteri. Non centrifugare animali tra un lavaggio, ma piuttosto permettere agli animali di stabilirsi per gravità in un fermo 1,5 ml microcentrifuga tubo. E &#39;fondamentale per garantire tutti i batteri viene rimosso, e che i paté NGM sono esenti da contaminazione, i batteri residui influenzerà negativamente l&#39;esito del test traslocazione. Inoltre, abbiamo trovato che la sterilizzazione in autoclave le provette da 1,5 ml microcentrifuga produce una proprietà &quot;appiccicoso&quot; sulle pareti interne del tubo che causa gli animali di aderire alle pareti, ed utilizzare quindi non autoclave provette da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Mentre gli animali si stanno stabilendo tra un lavaggio, portare tegli adattamento soluzione. Aggiungere 100 ml di S-basale buffer su un cilindro graduato da 100 ml laurea. Aggiungi adattamento odore della S-basale e sigillare il cilindro con una striscia di parafilm. Se si esegue l&#39;adattamento benzaldeide aggiungere 7,5 ml di benzaldeide a 100 ml di S-Basal, per l&#39;adattamento butanone aggiungere 11 ml di 2-butaone a 100 ml di S-Basal. Capovolgere delicatamente (non agitare) il cilindro laurea contenente S-basali e l&#39;odore 30 volte per creare una emulsione uniforme. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio in S-basale, permettere agli animali di risolvere e rimuovere tutto il liquido. Etichettare una provetta &quot;+ ve&quot; o &quot;adattare&quot; e l&#39;altro tubo &quot;-ve&quot; o &quot;unadapt&quot;. Poi aggiungere 1 ml della miscela di adattamento alla provetta adattamento (+ ve), e aggiungere 1 ml di S-basale al tubo disadattato microcentrifuga di comando (-ve). Cercate di mantenere il numero di animali tra 100 e 200 in ciascun tubo. Con una certa pratica, è possibile stimare il numero approssimativo di animali in un pellet ad occhio. </li><li> Inserire un 1,5 ml microcentrifuga tubo tappo di protezionead ogni provetta (impedisce coperchi da aperto popping) e posizionare i tubi su un rotatore per 80 min. Abbiamo trovato che l&#39;esposizione odore tra 60 min e 80 min produce risultati simili (sia risultato a lungo termine risposte di adattamento). Tuttavia, l&#39;80 minuti di esposizione offre risultati più coerenti nelle nostre mani. Quindi tutti i nostri saggi a lungo termine di adattamento sono standardizzati utilizzando un odore di esposizione 80 min (Figura 2). </li><li> Dopo 80 minuti, lavare gli animali 3 volte in S-basale. Consentire agli animali di risolvere per gravità tra ogni lavaggio. </li></ol> 4. A breve termine Odore indotte saggi traslocazione nucleare <ol><li> In caso di breve termine dell&#39;adattamento odore, utilizzare lo stesso protocollo per lungo termine saggi traslocazione odore indotte (Fasi 3,1-3,4), ma invece di incubazione delle pyIs500 animali nell&#39;adattare odori per 80 min, utilizzare una esposizione 30 min . La quantificazione di odore indotte saggi traslocazione nucleare descritta di seguito (Passaggio 5) è lo stesso per lungo e breve term esposizioni. </li></ol> 5. Segnare l&#39;Odore indotto degli eventi nucleari Traslocazione <ol><li> Fai 2% pastiglie agarosio contenenti 5 mM sodio azide (NaN 3) sciogliendo elettroforesi su gel di agarosio in dH 2 0. Mettere una goccia di agarosio fuso contenente NaN 3 su un vetrino per microscopio. Porre immediatamente un altro vetrino da microscopio di vetro sulla prima diapositiva per appiattire la goccia di agarosio fuso. Lasciare agire per 30 secondi, e poi delicatamente prendere in giro a parte la vetrini lasciando un vetrino da microscopio con un tampone piatto agarosio di circa 1 mm. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio in S-basale, permettere ai vermi di stabilirsi nel tubo 1,5 ml microcentrifuga e rimuovere tutto il liquido. Quindi aggiungere gli animali goccia a goccia sui pad agarosio di vetrini da microscopio diversi. E &#39;importante mantenere il numero di animali per ogni diapositiva a tra 50 e 100. Troppi animali per vetrino si complicano punteggio e spesso creano un bagliore spargendo dopo blu-luce di eccitazione. Liquido in eccesso puòessere cattivi dai pad agarosio con un piccolo Kim-wipe. Collocare un bicchiere 0,5 millimetri copertura antiscivolo sul tampone e lasciare riposare per 2 min per consentire l&#39;NaN 3 per immobilizzare gli animali. Nota, gli animali possono essere recuperato presso le diapositive dopo aver segnato. Gli animali si riprenderà dal 3 NaN anestetico dopo ~ 1 ora in caso di cessione di una piastra NGM seminato in una goccia di tampone M9. </li><li> A questo punto è indispensabile che ogni sperimentatore elaborare una chiave per tenere traccia che scorrono è sperimentale (+ ve) diapositiva e che scorrono è il controllo (-ve) slitta, e passare le diapositive ad un&#39;altra persona che ciecamente segnerà il GFP: EGL-4 modello di localizzazione. Ciò permette di controllare per ogni pregiudizio sperimentatore. </li><li> Punteggio compreso tra 50 e 100 capi per vetrino utilizzando un microscopio a fluorescenza in posizione verticale con gli obiettivi di ingrandimento 10X, 40X e 63X e GFP / RFP filtri. In primo luogo, individuare gli animali a 10 ingrandimenti con campo chiaro illuminazione. In secondo luogo, individuare il neurone AWC spegnendo il bright-campo di illuminazione e utilizzando il filtro RFP. I (p) ODR-1 :: unità DsRed espressione in AWB e neuroni AWC. I neuroni hanno AWC distintivi corpi cellulari di forma ovale rispetto AWB corpi cellulari che sono più piccoli e di forma circolare (Figura 2). </li><li> Una volta che il corpo cellulare AWC è stato localizzato, passare al filtro GFP e registrare la localizzazione di GFP: EGL-4 come nucleare o citoplasmatico. Utilizzando un contatore permette di mantenere lo sperimentatore guardare nell&#39;oculare mentre segnando la diapositiva. Nota: 5,1-5,5 passaggi vengono ripetuti almeno 3 volte in giorni diversi per ottenere dati statisticamente significativi (figure 1-2). </li></ol> 6. Il monitoraggio GFP-tagged EGL-4 durante il recupero da lungo termine adattamento Odore <ol><li> Passo dopo 3,5, dividere le popolazioni di animali pyIs500 in aliquote multiple e punteggio per GFP nucleare rispetto citoplasmatica :: EGL-4 nel AWC punto al tempo zero (cioè, dopo 80 minuti di esposizione) ed multiple punti temporali successivi (Figura 3). </li><li> Trasferire sia il controllo (-ve) e sperimentali (+ ve) animali con pipette in vetro usa e getta su piastre NGM. </li><li> Consentire agli animali di recuperare per varie lunghezze di tempo e di riesaminare la localizzazione di GFP :: EGL-4in AWC ad ogni tempo, come nei passaggi 5,1-5,5. </li></ol> 7. Materiale Piastre NGM: Per 1 L aggiungere a 1 L DDH 2 0: 21 g Bacto-agar, 3 g Cloruro di sodio (NaCl), 2,5 g Bacto-peptone. Autoclave Media. Dopo la sterilizzazione in autoclave, raffreddare l&#39;agar fino a quando la temperatura indica 54 ° C. Aggiungere le seguenti soluzioni: 25 ml 1M tampone fosfato di potassio, 1 ml 1 M di solfato di magnesio (MgSO4), 1 ml 1 M di cloruro di calcio (CaCl 2); 1 colesterolo ml in etanolo (5 mg / ml di brodo). 1 M bibasico K 2 HPO 4 174,2 g / mol: Per 500 ml: In 400 ml DDH 2 O, sciogliere 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Regolare il volume a 500 L con DDH 2 O. Filtrare sterilizzare con un 500 ml Unità di filtro sterile. 1 M monobasico di KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Per 1 L: In 800 ml DDH 2 O, sciogliere 136,1 g monobasico di KH 2 PO 4. Regolare il volume a 1 L con DDH 2 O. Filtrare sterilizzare con un 500 ml Unità di filtro sterile. 1 M fosfato di potassio (K 3 PO 4) pH 6.0: Per 1 L: In una unità 1 L filtro sterile, aggiungere 868 ml di 1 M monobasico di KH 2 PO 4. Permettere all&#39;unità di filtrare, poi aggiungere 132 ml di 1 M bibasico K 2 HPO 4. Permettere all&#39;unità di filtrare tutto il liquido. Rimuovere l&#39;unità di filtro e aggiustare il pH a 6,0. Conservare a temperatura ambiente. S-basale: Per 1 L: aggiungere 50 ml 1M K 3 PO 4 tampone, pH ~ 6.0, e 20 ml di NaCl 5M aq. Riempire a 1 L conDDH 2 O. Autoclave soluzione. M9: Per 1 L: 3 g KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O. Riempire a 1 L con DDH 2 0. Sterilizzare in autoclave.

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Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+C.+elegans+Dopamine+Neuron+Degeneration+Assay+for+the+Validation+of+Potential+Parkinson's+Disease+Genes.">Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes.</a> J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).</li><li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity:+Aplysia+and+the+hippocampus.">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;odore indotta ingresso nucleare di GFP-tagged EGL-4 molecola qui descritta fornisce una lettura solida molecolare di adattamento olfattivo in C. elegans. L&#39;odore indotte saggi traslocazione nucleare sono semplici e richiedono solo pochi giorni di tempo di preparazione. Il pyIs500 animale che abbiamo costruito per questi test, esprime un marcatore che illumina il neurone AWC oltre ad esprimere la GFP-tagged EGL-4 proteine. Pertanto, riteniamo che uno sperimentatore con poca o nessuna esperienz...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> NGM piastre </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Fisher Chemical </td><td> S671-10 </td><td> NGM piastre </td></tr><tr><td> Bacto Peptone </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> NGM piastre </td></tr><tr><td> Fosfato di potassio bibasico </td><td> Fisher Chemical </td><td> S375-500 </td><td> S-Basal buffer e piastre NGM </td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico </td><td> Fisher Chemical </td><td> P285-500 </td><td> S-Basal buffer e piastre NGM </td></tr><tr><td> Kimwipes - Piccolo </td><td> Kimberly-Clark </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo 100% </td><td> Gold Shield chimicaCo. </td><td> 43196-115 </td><td> odori diluizione per saggi di chemiotassi </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C8106-500G </td><td> NGM piastre </td></tr><tr><td> Magnesio solfato </td><td> MP Biomedicals </td><td> 150136-500G </td><td> NGM piastre </td></tr><tr><td> Sodio azide 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> ICN10289180 </td><td> Anestetico </td></tr><tr><td> Agarosio - ultrapura </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> Agarosio pastiglie </td></tr><tr><td> Benzaldeide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1334-100G </td><td> Odore AWC </td></tr><tr><td> Butanone, ACS grado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 360473-500ML </td><td> Odore AWC </td></tr><tr><td> Tubi - microcentrifuga 1,5 ml colorati </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettare Pasteur monouso in vetro 5-3/4 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> Integrazione UV </td></tr><tr><td> Filtrare sotto vuoto bottiglia - 500 ml </td><td> Nalgene </td><td> 09-740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

a molecular readout of long-term olfactory adaptation in c. elegans

Durante la stimolazione prolungata più neuroni sensoriali si adatterà la loro risposta diminuendo la loro sensibilità al segnale. La risposta di adattamento aiuta attenzione la forma e protegge anche le cellule provenienti da oltre-stimolazione. Adattamento nel circuito olfattivo di C. elegans è stato descritto da Colbert e Bargmann 1,2. Qui, gli autori hanno definito i parametri del paradigma adattamento olfattivo, che hanno usato per la progettazione di uno screening genetico di isolare mutanti difettosi nella loro capacità di adattarsi agli odori volatili rilevati dalle Amphid cellule alari di tipo C (AWC) neuroni sensoriali. Quando tipo selvatico C. elegans animali sono esposti a un interessante AWC-sentito odore 3 per 30 minuti che si adatterà la rispondenza alle l&#39;odore e quindi ignorare l&#39;odore adattando in un saggio di chemiotassi comportamentale per ~ 1 ora. Quando tipo selvatico C. elegans animali sono esposti a un interessante AWC-sentito odore di ~ 1 ora saranno quindi ignorare l&#39;odore di adattare di achemotaxis test comportamentali per circa 3 ore. Queste due fasi di adattamento olfattivo in C. elegans sono stati descritti come breve termine l&#39;adattamento olfattivo (indotta dopo 30 minuti di esposizione odore), ea lungo termine adattamento olfattivo (indotto dopo 60 minuti di esposizione odore). Più tardi lavorare da L&#39;Etoile et al., 4 scoperto una proteina chinasi G (PKG) chiamato EGL-4 che è necessario sia per l&#39;adattamento a breve e lungo termine nei neuroni olfattivo AWC. Il-4 EGL proteina contiene una sequenza di localizzazione nucleare che è necessario a lungo termine risposte di adattamento olfattive, ma non indispensabili per il breve termine, le risposte di adattamento olfattivo nel AWC 4. Taggando EGL-4 con una proteina fluorescente verde, è stato possibile visualizzare la localizzazione di EGL-4 nel AWC durante l&#39;esposizione prolungata odore. L&#39;utilizzo di questo completamente funzionale GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) molecola siamo stati in grado di sviluppare una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel AWC 5. Utilizzando questo mlettura olecular di adattamento olfattivo siamo stati in grado di eseguire entrambi gli schermi in avanti e all&#39;indietro genetici per identificare gli animali mutanti che presentano i modelli difettosi localizzazione subcellulare di GFP :: EGL-4 nel AWC 6,7. Qui si descrive: 1) la costruzione di GFP :: EGL-4 animali che esprimono, 2) il protocollo per la coltivazione di animali a lungo termine saggi traslocazione odore indotta nucleari, e 3) il punteggio di lungo termine odore indotta traslocazione evento nucleare e il recupero (ri-sensibilizzazione) dal nucleare GFP :: EGL-4 Stato.

Un esempio del modello di localizzazione GFP :: EGL-4in l&#39;AWC prima e dopo esposizione prolungata odore è mostrato in Figura 2. Prima dell&#39;esposizione prolungata odore, GFP :: EGL-4 è localizzato al citosol della AWC (Figura 2B), e dopo 80 minuti di esposizione GFP odore :: EGL-4 è localizzata nel nucleo della AWC (Figura 2D). A livello comportamentale, gli animali con citosolica GFP :: EGL-4 in AWC sono attratti da una sorgente puntiforme di odore (F...

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A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Qui descriviamo una lettura molecolare di lungo termine dell&#39;adattamento olfattivo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. La proteina chinasi G, EGL-4, è necessario per le risposte di adattamento stabili nella coppia primaria neurone sensoriale chiamato AWC. Durante prolungati odore di esposizione EGL-4 trasloca dal citosol al nucleo della AWC.

Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

a-molecular-readout-of-long-term-olfactory-adaptation-in-c-elegans

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

10.7K Views.  George Washington University. Qui descriviamo una lettura molecolare di lungo termine dell'adattamento olfattivo Caenorhabditis elegans. La proteina chinasi G, EGL-4, è necessario per le risposte di adattamento stabili nella coppia primaria neurone sensoriale chiamato AWC. Durante prolungati odore di esposizione EGL-4 trasloca dal citosol al nucleo della AWC.

Video: A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Learning Positivo Butanone, a breve termine e lungo termine saggi di memoria associativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Ricerca

Neuroscienze

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biologia

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Analisi automatizzata di un esame preferenziale di Chemosensory basato sulla popolazione di Nematode

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamento

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates movement. Additionally, gravity sensation, which occurs in the mammalian inner ear, is closely related to hearing - thus, understanding this process has implications for auditory and vestibular research. Gravitaxis assays exist for some model organisms, including Drosophila. Single worms have previously been assayed for their orientation preference as they settle in solution. However, a reliable and robust assay for Caenorhabditis gravitaxis has not been described. The present protocol outlines a procedure for performing gravitaxis assays that can be used to test hundreds of Caenorhabditis dauers at a time. This large-scale, long-distance assay allows for detailed data collection, revealing phenotypes that may be missed on a standard plate-based assay. Dauer movement along the vertical axis is compared with horizontal controls to ensure that directional bias is due to gravity. Gravitactic preference can then be compared between strains or experimental conditions. This method can determine molecular, cellular, and environmental requirements for gravitaxis in worms.

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

The present protocol outlines methods for conducting a large-scale gravitaxis assay with Caenorhabditis dauer larvae. This protocol allows for better detection of gravitaxis behavior compared with a plate-based assay.

Saggio gravitazionale su larga scala delle larve di Caenorhabditis dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Estrazione e quantificazione delle risposte volatili ai feromoni sessuali in C. elegans

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Esame dell'influenza volatile dei feromoni sessuali sul comportamento del maschio di C. elegans

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Estrazione di feromoni sessuali volatili e test di chemioattrazione in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Analisi di Aversione di rame basata sullo stato nutrizionale

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

Tramite un Chip olfattiva di microfluidica adattato per l'Imaging dell'attività neuronale in risposta ai feromoni in neuroni di testa maschio C. Elegans

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel

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C. elegans Learning Positivo Butanone, a breve termine e lungo termine saggi di memoria associativa

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Analisi automatizzata di un esame preferenziale di Chemosensory basato sulla popolazione di Nematode

Saggio gravitazionale su larga scala delle larve di Caenorhabditis dauer

In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans

Estrazione di feromoni sessuali volatili e test di chemioattrazione in Caenorhabditis elegans

Estrazione di feromoni sessuali volatili e test di chemioattrazione in Caenorhabditis elegans

Estrazione di feromoni sessuali volatili e test di chemioattrazione in Caenorhabditis elegans

UN

Tramite un Chip olfattiva di microfluidica adattato per l'Imaging dell'attività neuronale in risposta ai feromoni in neuroni di testa maschio C. Elegans