La ricerca qui presentata è stata sostenuta da Charles River. Gli autori sono molto grati ai modelli Genetically Engineered and Services Group e il personale embriologia per la cura degli animali e l&#39;iniezione dell&#39;ormone.

1. Topo crioconservazione degli spermatozoi <ol><li> Per ogni linea da crioconservati, i seguenti elementi prima di iniziare. <ol><li> 1 vasca di un 4-ben piatto con 240 l di kit CPA </li><li> 15 cannucce crioconservazione degli spermatozoi come segue <ol><li> Collegare il 0,25 ml cannucce al siringhe da 1 ml con il tappo di cotone più vicino alla siringa. In ogni paglia, carico di 8 cm (circa 160 microlitri) di media FIV, quindi 1 cm di aria. Etichettare il cannucce con il nome della linea da conservare. </li></ol></li></ol></li><li> LN 2 dovrebbe essere di 15 cm di profondità nella casella di schiuma. Chiudere il coperchio. </li><li> Euthanize 2 topi maschi da ogni riga di essere crioconservati. I topi dovrebbero essere tra 10 e 60 settimane di età. Rimuovere le due epididimi caudale insieme al dotto deferente di ogni topo. </li><li> Posizionare il epididimi nel precedentemente preparato CPA contenenti anche di un 4-ben piatto (passo 1.1). </li><li> Fare 5-7 tagli longitudinali in ogni epididimo e delicatamentespremere ogni dotto deferente per spingere lo sperma fuori. </li><li> Agitare la miscela e CPA epididimo a mano delicatamente a temperatura ambiente per 3-5 minuti. Questo permetterà spermatozoi a nuotare fuori. </li><li> Utilizzando la paglia precedentemente preparato, aspirare 5 mm (circa 10 microlitri) di sospensione di spermatozoi e quindi 1 cm di aria. </li><li> Ripetere questa operazione fino a un totale di 15 cannucce. Carico e di tenuta cannucce entro 10 minuti per la sopravvivenza degli spermatozoi migliori. </li><li> Si chiude entrambi i lati della paglia con attenzione. Posizionare il cannucce nel contenitore con la colonna congelamento dello sperma prima. </li><li> Fissare il 1 pipetta ml fornito come parte del kit per il canestro di estendere la maniglia. Posizionare il contenitore in LN 2 nella casella schiuma attraverso il foro nel coperchio. Lasciare che il canestro di galleggiare verticalmente nel LN 2 per 10 minuti. </li><li> Immergere il contenitore nel LN2. Lo sperma è ora crioconservati e può essere spostato lungo termine LN 2 di stoccaggio. </li><li> Il contenitore non deve essere utilizzato perla riga successiva fino a quando è riscaldato a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Topo superovulazione <ol><li> In generale, l&#39;uso di giovani topi di sesso femminile lo stesso sfondo i donatori di sperma. </li><li> I topi devono essere ~ 12 g (3-4 settimane di età). </li><li> Eseguire un&#39;iniezione intraperitoneale con 5-10 UI di gravidanza siero di cavalla gonadotropina (PMSG). </li><li> Attendere 46-48 ore. </li><li> Eseguire un&#39;iniezione intraperitoneale con 5-10 UI di gonadotropina corionica umana (hCG). </li><li> Ovociti vendemmia 14-16 ore dopo l&#39;iniezione di hCG come descritto di seguito. </li></ol> 3. Topo di recupero degli spermatozoi e fecondazione in vitro <ol><li> Prima di fecondazione in vitro, per ogni paglia di essere scongelati, i seguenti elementi ed equilibrare per almeno un&#39;ora a 37 ° C CO 2 incubatore. <ol><li> Spermatozoi piatto di incubazione: un piatto 35 millimetri Petri, con un calo 90 l di media sperma trattamento (STM) ricoperto di olio. </li><li> Taglio piatto: Per la raccolta degli ovociti da un massimo di 10 superovulated femmine, una 35 millimetri Petri piatto con 3 ml di terreno fecondazione in vitro. </li><li> FIV bene: per ogni gruppo di 5 femmine superovulated per la FIV, un pozzetto di un piatto ben 4 con 500 l di media FIV (se si utilizza superovulated 10 femmine, per esempio, avrete bisogno di 2 pozzi...) </li><li> Lavaggio delle stoviglie: una piatto 35 millimetri Petri con 3 ml di simplex di potassio medio ottimizzato (KSOM) per lavare ogni pozzetto del 4-ben piatto FIV utilizzate </li><li> Cultura piatto: un piatto di 35 millimetri di Petri con 50 gocce l di media KSOM ricoperto di olio per coltura degli embrioni da ogni pozzetto del piatto FIV. </li></ol></li><li> Rimuovere una cannuccia da LN 2 e mettere in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 2-3 minuti. </li><li> Rimuovere la paglia dal bagnomaria e pulire per rimuovere l&#39;acqua in eccesso. Effettuare il primo taglio vicino alla colonna d&#39;aria al più vicino la spina cotone. Tagliare la paglia nel medio FIV ci saranno ancora una colonna d&#39;aria visibile prima della colonna sperma. </li><li> Poi tagliare la fine della paglia nel seconda colonna d&#39;aria, facendo attenzione a evitare di tagliare la colonna sperma. Tagliata in un angolo di 45 - questo renderà molto più facile per aspirare lo sperma. </li><li> Aspirare la sospensione dello sperma a partire dalla fine distale della paglia con una pipetta 200 l. </li><li> Posizionare la sospensione spermatozoi nel centro della goccia STM e incubare il piatto per 45-60 minuti a 37 ° C 5% CO 2 incubatore. </li><li> Durante l&#39;incubazione degli spermatozoi, sezionare gli ovidotti delle femmine superovulated nel piatto di taglio. Utilizzare un ago 30 g o pinze per strappare ogni ovidotto, rilasciando il cumulo-ovocita complessi (COC). Evitare grassi e sangue nel medio FIV come sporco dei media rende fasi di lavaggio in più. </li><li> Una volta che tutti gli ovidotti sono stati strappati, trasferire i contraccettivi orali combinati da 5 femmine per ogni pozzi fecondazione in vitro. Il numero di COC prodotta da superovulazione è molto sforzo dipendente. </li><li> Raccogliere 10-15 ml di sperma dalla periferia della goccia STM e fertilizzare uno FIV e circa 14-16 ore dopo hCG injezione. Ripetere per ogni fecondazione ben utilizzato. Concentrazione dello sperma finale sarà di circa 1 milione / ml. </li><li> Co-coltura spermatozoi e ovociti per 4-6 ore a 37 ° C 5% CO 2 incubatore. </li><li> Lavare gli embrioni con KSOM un minimo di 2 volte e la cultura in gocce KSOM per lo sviluppo a 37 ° C 5% CO 2 incubatore. </li><li> Tasso di fecondazione in vitro è stato calcolato come embrioni di cellule a doppio stadio di ovociti totale utilizzata dopo una notte della cultura. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Spermatozoi dal 5 Charles River ceppi di topi inbred è stato congelato. Rapporti di protezione sono calcolati dividendo gli spermatozoi congelati i valori di valutazione da valori freschi valutazione degli spermatozoi. Rapporti di protezione della motilità degli spermatozoi sono stati 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% per C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, rispettivamente. Rapporti di protezione per una rapida motilità progressiva sono stati 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas<html> Crl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, rispettivamente (Fig. 1). I tassi di fecondazione in vitro con gli spermatozoi congelati-scongelati sono stati il ​​55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% e 26,2% nel C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, rispettivamente (Fig. 2) . Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topo geneticamente modificato sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi. Queste linee sono stati successivamente recuperati con successo (come definito da cuccioli nati vivi) da FIV in 4 ceppi di sesso femminile (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 e 129Sv) (Fig. 3). <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> Figura 1. I rapporti Tutela della motilità spermatica e la motilità progressiva rapida nei topi <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> Figura 2. Fecondazione in vitro con lo sperma congelato, scongelato in topi 3713fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Fecondazione in vitro con spermatozoi congelati-scongelati in topi GM

<ol>
	<li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol.">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li><li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa.">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing.">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li><li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa:+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks,+mutagenesis+screens,+and+mouse+backcrosses.">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm.">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li><li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL/6+mice.">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization.">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li><li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates.">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li><li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing.">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li><li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity.">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li><li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserving,+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation.">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li></ol>

Gli autori sono dipendenti del Charles River, il creatore di questo kit.

Dal 1990, la base del protocollo di congelamento degli spermatozoi con il 18% raffinosio e il 3% di latte scremato è stato dimostrato affidabile in molti ceppi di topi e un gran numero di linee del mouse sono stati crioconservati 1,2,3,4,5,6,7. Le principali cause di danni alle cellule dello sperma durante il processo di congelamento e scongelamento sono stati associati con la formazione di ghiaccio 8,9 e le specie reattive dell&#39;ossigeno 10. La supplementazione con pulitori del radicale libero, come gli amminoacidi, e agenti riducenti, come monotioglicerolo, nel mezzo di congelamento è stato studiato e dimostrato di aumentare notevolmente tasso di fecondazione in vitro con lo sperma congelato, scongelato in ceppi inbred compreso il C57BL / 6 11,6. Nel presente protocollo, abbiamo sviluppato un nuovo I • Cryo kit per la crioconservazione degli spermatozoi del mouse attraverso l&#39;ottimizzazione di base disponibili in commercio CPA con antiossidanti e inibitori del ghiaccio e modificando il congelamento degli spermatozoi e la procedura di fecondazione in vitro. Rapporti di protezione della motilità degli spermatozoi(&gt; 60%) e la motilità progressiva rapida (&gt; 45%) sono state osservate per gli spermatozoi provenienti da cinque ceppi di topi inbred congelati con la Cryo • I kit. Il 2-cellula embrionale tasso fase di sviluppo con lo sperma congelato, scongelato in 5 ceppi di topi inbred è stato notevolmente migliorato rispetto a quello con base 11,6 CPA. Utilizzando il kit, l&#39;utente crea una sospensione concentrata di spermatozoi dello sperma di congelamento di 2 maschi per ogni linea. Solo da congelamento 15 cannucce il processo è veloce, facile e occupa meno spazio di memorizzazione per l&#39;archiviazione a breve oa lungo termine. La maggior parte delle volte, le linee del mouse può essere recuperato da scongelamento solo 1 o 2 cannucce.

<table><tbody><tr><td>CPA</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Provided with kit</td></tr><tr><td>STM</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Provided with kit</td></tr><tr><td>IVF medium</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Provided with kit</td></tr><tr><td>0.25 ml plastic straw</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Provided with kit</td></tr><tr><td>Sperm freezing canister</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Provided with kit</td></tr><tr><td>Cane and goblet</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Provided with kit</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Should be embryo tested</td></tr><tr><td>KSOM medium</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Heat sealer</td><td>ABTEC</td><td>TISH-200</td><td></td></tr><tr><td>4-well multidish</td><td>Nalge Nunc international</td><td>73521-424</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C + 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; storage system</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C water bath</td><td>VWR international</td><td>89032-196</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Intervet Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>EMD Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>1cc syringe w/ 26G 3/8 needle</td><td>BD Biosciences</td><td>BD309625</td><td></td></tr><tr><td>Micro dissecting scissors</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>30 gauge &amp;frac12; needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse sperm cryopreservation and recovery using the i&middot;cryo kit

Migliaia di nuovi geneticamente modificati (GM) ceppi di topi sono stati creati dopo l&#39;avvento di tecnologie di transgenesi e di eliminazione diretta. Molti di questi animali preziosi esistono solo come gli animali vivi, senza alcun piano di backup in caso di emergenza. Crioconservazione degli embrioni in grado di fornire il backup, ma è costoso, può essere una procedura lunga e richiede generalmente un gran numero di animali per il successo. Dopo la scoperta che gli spermatozoi del mouse può essere crioconservati con successo con un agente di base crioprotettivi (CPA), composto da 18% raffinosio e il 3% di latte scremato, la crioconservazione degli spermatozoi è diventata una procedura accettabile e conveniente per l&#39;archiviazione, la distribuzione e il recupero di questi ceppi di valore . Qui mostriamo un nuovo sviluppo • I kit per la crioconservazione degli spermatozoi Cryo mouse. Sperma di cinque ceppi di uso comune di topi inbred sono stati congelati con questo kit e poi recuperato. Rapporti di protezione più elevato della motilità degli spermatozoi (&gt;60%) e la motilità progressiva rapida (&gt; 45%) rispetto al controllo (di base CPA) sono stati osservati per lo sperma congelato con questo kit di 5 ceppi di topi inbred. Due stadi di sviluppo embrionale delle cellule dopo la fecondazione in vitro con lo sperma recuperato è stato migliorato costantemente in tutte e 5 ceppi di topi esaminati. Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topo geneticamente modificato sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi con la Cryo • I kit e successivamente recuperato da fecondazione in vitro.

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Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Qui mostriamo il nuovo • I kit per la crioconservazione degli spermatozoi Cryo mouse. Stadio di due cellule sviluppo dell&#39;embrione con decongelati sperma era migliorato costantemente in 5 ceppi di topi con l&#39;utilizzo di questo kit. Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topi geneticamente modificati sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi con la Cryo • I kit e poi recuperato con successo da fecondazione in vitro.

Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

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39.5K Views.  Charles River. Qui mostriamo il nuovo • I kit per la crioconservazione degli spermatozoi Cryo mouse. Stadio di due cellule sviluppo dell'embrione con decongelati sperma era migliorato costantemente in 5 ceppi di topi con l'utilizzo di questo kit. Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topi geneticamente modificati sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi con la Cryo • I kit e poi recuperato con successo da fecondazione in vitro.

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Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid cooling in an &#34;open&#34; system (i.e., direct LN2 contact) was a necessity to optimize vitrification success. The dogma surrounding the importance of cooling rates led to unsafe practices subject to technical variation and to the creation of vitrification devices that disregarded important quality-control factors (e.g., ease of use, repeatability, reliability, labeling security, and storage safety). Understanding the quality-control flaws of other devices allowed for the development of a safe, secure, repeatable, and reliable &#181;S-VTF method aimed to minimize intra- and inter-technician variation. Equally important, it combined the availability of two existing FDA-compliant devices: 1) a 0.3-mL ionomeric resin embryo straw with internalized, dual-colored, tamper-proof labeling with repeatable weld seal potential; and 2) shortened, commonly-used, 300-&#181;m ID sterile flexipettes to directly load the embryo(s) in order to create a highly-effective global vitrification device. Like other aseptic, closed vitrification systems (e.g., High Security Vitrification (HSV), Rapid-i, and VitriSafe) effectively used in reproductive medicine, microSecure Vitrification (&#181;S-VTF) has proven that it can achieve high post-warming survival and pregnancy outcomes with its attention to simplicity, and reduced technical variation. Although the 0.3-mL embryo straw containing an internal hydrophobic plug was commercially replaced with a standard semen straw possessing cotton-polyvinyl pyrrolidone (PVP) plugs, it maintained its ionomeric resin composition to ensure weld sealing. However, the cotton plugs can wick out the fluid-embryo contents of the flexipettes upon contact. A modified &#181;S-VTF method was adapted to include an additional internal weld seal before the plug on the device loading side. The added technical step to the &#181;S-VTF procedure has not affected its successful application, as high survival rates (&#62; 95%) and pregnancy rates continue today.

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

Modificato vetrificazione MicroSecure: Un altamente Procedura Crioconservazione sicuro ed efficace, semplice e per blastocisti umane

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

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Raccolta e Crioconservazione degli ovociti e di embrioni di topo criceto

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The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

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During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modello murino ICSI-ET per studiare gli impatti a lungo termine sul metabolismo del glucosio

Monitoring Blood Glucose in Mouse Offspring After Intracytoplasmic Sperm Injection

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life roughly equivalent to 40 human years. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a commonly used assisted reproductive technology in clinical practice. However, given its relatively recent emergence about 30 years ago, the long-term effects of this technique on human development remain unclear. In this study, we established the ICSI combined with embryo transfer (ET) method using a mouse model. The results demonstrated that normal mouse sperm, after undergoing in vitro culture and subsequent ICSI, exhibited a fertilization rate of 89.57% and a two-cell rate of 87.38%. Following ET, the birth rate of offspring was approximately 42.50%. Furthermore, as the mice aged, fluctuations in glucose metabolism levels were observed, which may be associated with the application of the ICSI technique. These findings signify that the mouse ICSI-ET technique provides a valuable platform for evaluating the impact of sperm abnormalities on embryo development and their long-term effects on offspring health, particularly concerning glucose metabolism. This study provides important insights for further research on the potential effects of the ICSI technique on human development, emphasizing the necessity for in-depth investigation into the long-term implications of this technology.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Esplorare gli impatti a lungo termine sulla salute dell'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi sulla prole

Here, we present a protocol to establish an intracytoplasmic sperm injection (ICSI)-embryo transfer (ET) mouse model, allowing us to observe age-related changes in glucose metabolism that may be attributed to ICSI, providing insights into its potential long-term impacts on human development.

Monitoraggio della glicemia nella prole di topo dopo l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Crioconservazione di embrioni di topo da glicole etilenico-Based Vetrificazione

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

Crioconservazione degli spermatogoni di Zebrafish dall'intero testicoli ago immerso di raffreddamento ultra-rapido

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

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A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

Monitoraggio della glicemia nella prole di topo dopo l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi

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