Desideriamo ringraziare Monte Westerfield, Makoto Kobayashi e Jacek Topczewski per i doni di plasmidi per l&#39;ibridazione in situ e microiniezioni di mRNA. Siamo grati a Steph Erhard per apparire nel video. Desideriamo inoltre riconoscere l&#39;aiuto di William Goossens con la microscopia confocale mostrato nel video. Tyler Schwend fornito le immagini utilizzate nel video, e il Rodney Dale assistito con la preparazione per il video. Abbiamo anche riconoscere il personale CMRC la cura degli animali per il loro lavoro con l&#39;allevamento zebrafish. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione del NIH R21 AA13596 di SCA.

1. Trattamento etanolo di embrioni <ol><li> Embrioni di zebrafish derivati ​​da wild-type accoppiamenti sono state sollevate a 28 ° C in 5 ml di acqua dell&#39;embrione. (Milli-Q acqua con 60 mg / L istantaneo Ocean). Diversi ceppi wild-type embrioni hanno tolleranze leggermente diverse con etanolo esposizione 9. </li><li> L&#39;esposizione di etanolo è stata avviata nella fase cupola (~ 4,3 ore dopo la fecondazione, HPF) per il tempo desiderato, fino ad un impulso di 24 ore. Questa fase di partenza è più o meno equivalente alla fase di impianto di embrioni di mammifero, appena prima della gastrulazione. Concentrazioni di etanolo utilizzato da 0,2% -2,5%, volume / volume. I test hanno dimostrato che tra il 25-50% della soluzione nell&#39;acqua finisce negli embrioni 10, 11. Gli embrioni vengono mantenuti a 28 ° C per la durata desiderata. Dopo la lunghezza desiderata di etanolo esposizione, l&#39;etanolo-acqua soluzione viene rimosso e sostituito con tre lavaggi di acqua zebrafish regolare e mantenuto FOr la durata desiderata. La specificità del difetto dipende dal tempo di insorgenza, la dose, e la lunghezza dell&#39;impulso di etanolo. </li></ol> 2. Raccolta di embrioni per la RNA, ibridazione in situ, Anticorpi, e la colorazione cartilagine <ol><li> Per raccogliere mRNA per qPCR, età embrioni trovati sono raccolti in provette Eppendorf. Dopo la rimozione dell&#39;acqua zebrafish, tampone di lisi con TCEP viene aggiunto. Un polverizzatore motorizzato viene utilizzato per dissociare fisicamente gli embrioni nella soluzione di lisi. Questo viene poi fatto passare attraverso una colonna preclear, che elimina eventuali pezzi di grandi dimensioni dissociato. La soluzione risultante contiene tutte le macromolecole rilasciati dal processo di lisi. RNA viene poi estratta eseguendo questa soluzione su una colonna, seguita da lavaggio e trattamento DNAsi. L&#39;eluizione viene quindi effettuata utilizzando acqua o una soluzione di eluizione fornito dal produttore (5&#39;-Prime). L&#39;RNA può essere convertito in cDNA usando tecniche standard per qPCR o utilizzati in micromatrice analisi. </li><li> Per ibridazione in situ e la colorazione anticorpale, embrioni da 6 a 24 hpf sono stati fissati in paraformaldeide al 4% notte a 4 ° C. Questo è seguito da 3 lavaggi in PBS + 0,1% Tween (PBT), per mantenere gli embrioni aderiscano l&#39;uno all&#39;altro. Gli embrioni vengono poi trasferite attraverso una serie di metanolo 3: PBT lava in metanolo 100%, al punto che essi possono essere conservati a -20 ° C. Questi embrioni possono essere utilizzati per ibridazione in situ o colorazione anticorpale. Alcuni anticorpi non funzionano dopo il trattamento metanolo, quindi questo avvertimento deve essere presa in considerazione e la anticorpi specifici test per determinare se funzionerà dopo il trattamento metanolo. </li><li> Per la colorazione della cartilagine, gli embrioni devono essere innalzati a 5 o 6 giorni dopo la fecondazione (DPF). Essi vengono poi fissati in paraformaldeide al 4% notte a 4 ° C, seguito da 3 lavaggi in PBT. </li></ol> 3. Valutare etanolo-indotti cambiamenti di espressione genica e conseguenze dello sviluppo <ol><li&gt; Per determinare quali siano i livelli di espressione genica sono cambiati, i geni mirati vengono esaminati sia qPCR e ibridazione in situ. qPCR si ottiene utilizzando primer disegnati con Integrated DNA Technologies (IDT) del software, poi convalidato mediante 3 distinti campioni biologici. Una volta primer sono stati convalidati, qPCR viene eseguita su cDNA creata dal raccolto campioni di RNA. Ogni campione viene eseguito in triplice copia. Le reazioni di PCR sono gestiti Platinum SYBR Green qPCR Super mix (Invitrogen) su un Chroma-4 macchina PCR (BioRad) o similare macchina PCR con un sistema di rilevamento multicolor. Oltre ai geni essere interrogato, è fondamentale che un insieme di controllo di primer viene usata per equilibrare piccole differenze nella preparazione di cDNA o RNA. Per i nostri embrioni di zebrafish, usiamo GAPDH: 5&#39;GAAGGTGGGAAACTGGTCAT3 &#39;e 5&#39;TTGCACCACCCTTAATGTGA3&#39;. Geni essere analizzati vengono poi normalizzati a livelli GAPDH uno la quantificazione relativa dell&#39;espressione genica è calcolato utilizzando la variazione Pfaffl metodo 2 <sup&gt; - Ct, la visualizzazione dei dati come differenza volte in sperimentali relative al tipo di selvatico 12. Il calcolo normale presuppone che tutti i geni sono duplicando il DNA due volte per ogni ciclo, e quindi i dati esprime come rapporto tra la variazione nel gene sperimentale sulla variazione del gene di riferimento, espressa come calcoli di potenza sulla intero &quot;2&quot;, che è l&#39;efficienza di raddoppio di DNA per ciclo visto in una reazione PCR perfetta. Il metodo Pfaffl sostituisce il generico &quot;2&quot; con lo sperimentatore generato vera efficienza per il primer PCR scelto. Essa riflette una riflessione più accurata della differenza nelle reazioni PCR. La formula è completo: <table border="0"><tbody><tr><td> (Efficienza del gene sperimentale) (Ct del controllo Ct campione del campione trattato) </td></tr><tr><td> -------------------------------------------------- ----------------------------------- </td></tr><tr><td> (Efficienza del gene di riferimento) (Ct delcampione di controllo - Ct del campione trattato) </td></tr></tbody></table></li><li> Per ibridazione in situ, digossigenina (DIG)-marcati ribosonde sono costruiti plasmidi contenenti porzioni del gene di interesse. Pari età embrioni sono esposti a ribosonde utilizzando condizioni standard 13 e rilevato usando anti-DIG anticorpi accoppiati a fosfatasi alcalina che consente la localizzazione delle ribosonde marcato utilizzando una reazione di colorazione (NBT / BCIP). Gli embrioni vengono poi visualizzati con un microscopio Leica dissezione (Figura 1B-G). </li><li> Per valutare lo sviluppo morfogenetico, gli embrioni vengono raccolti al momento desiderato ed esaminate al microscopio da dissezione. Per la forma somite, embrioni vivi vengono esposte 14. Per la distanza tra l&#39;oculare e lunghezza del corpo, gli embrioni sono fissati in PFA. In tutti i casi, le immagini della regione desiderata vengono catturate su un microscopio da dissezione a un ingrandimento fisso e misurazioni effettuate con Adobe Photoshop software 10,14. </li><li> Per esaminare gli effetti del trattamento sulle strutture cartilagine in via di sviluppo larvale del pesce zebra, usiamo Alcian colorazione blu. Larve di zebrafish fisso vengono trattate con soluzione blu Alcian sciolto in etanolo all&#39;80%: 20% di acido acetico glaciale (alcool acido) per diverse ore o durante la notte. Le larve sono decolorato in alcuni lavaggi di alcol acido prima di essere trasferito ad un 1% KOH: 3% di soluzione di perossido di idrogeno per la compensazione ulteriore cellule pigmentate. Zebrafish devono essere almeno 4 giorni vecchie mostrano strutture cartilaginee, e questi sono meglio definite nei pesci che sono 5 o 6 giorni. </li><li> La morte cellulare in embrioni di vita è valutata sulla base arancio di acridina (AO). AO non è la cellula permeabile alle cellule viventi, e si lega al DNA in cellule con membrane compromessi, compresi quelli in fase di apoptosi e necrosi. Embrioni viventi sono incubati con 5 mg / ml AO in PBS per 1 ora, seguito da 3 lavaggi in PBS. Gli embrioni vengono poi ripresi utilizzando il microscopio confocale. Digital Z-serimmagini IE sono combinati per creare compositi. </li></ol> 4. Manipolare l&#39;embrione Zebrafish <ol><li> Dopo l&#39;identificazione di geni che sono diminuiti esposizione etanolo, è possibile tentare di sostituirli con iniezione di mRNA progettato per sostituire il gene mancante. MRNA Capped è trascritto da plasmidi di DNA linearizzato utilizzando RNA polimerasi in kit di trascrizione in vitro, secondo le istruzioni del produttore (mMessage Macchina, Applied Biosystems). Tra 25-200 pg / nl di RNA viene iniettata 1-2 uova fase cellule zebrafish, in una soluzione di 0,1 M KCl. Gli embrioni vengono poi consentito di recuperare prima di essere trattata con etanolo come descritto in precedenza (Figura 5). </li><li> Per qualsiasi trascritti genici vengono aumentate di etanolo esposizione, possono essere ridotti, o &quot;knock-down&quot; utilizzando una tecnologia antisenso morfolino. Antisenso Morpholinos (Amos), sono stati progettati da Gene Tools societari, e bloccare la traduzione di RNA in proteine, o block la maturazione e splicing di RNA, a seconda della necessità sperimentale. Questa azione di Morpholinos limitare la quantità di proteina attiva per il gene obiettivo, un deficit che può essere misurata usando anitibodies se sono disponibili. L&#39;efficienza di Morpholinos splicing dell&#39;RNA può essere misurata usando RT-PCR per rilevare le quantità relative di trascritti giuntate e unspliced. Titolazione dei morfolino può provocare dose-dipendente l&#39;attività 15. AMOS vengono diluiti a concentrazioni di lavoro (titolato pg a concentrazione ng) Danieau in soluzione (58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO 4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5 mM di HEPES, pH 7,6). L&#39;iniezione avviene in 1-2-cella fase, quindi gli embrioni sono permesso di sviluppare prima di essere sottoposto a trattamento di etanolo come sopra. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi L&#39;esposizione dell&#39;embrione Zebrafish ai risultati di etanolo in un certo numero di difetti di sviluppo e genetici che sono legati ai fenotipi trovato in altri vertebrati. Abbiamo documentato sviluppo anormale di tessuti assiali, compresa la notocorda (dati non mostrati 14). Il ritardo dello sviluppo prodotto da etanolo porta apparentemente per rottura di un adeguato allungamento notocorda, portando ad una abbreviata e di tanto in tanto interrotto notocorda (dati non riportati 14). Questo ritardo iniziale e difetti notocorda conduce con ogni probabilità in parte alle successive anomalie nei somiti (Figura 2), che hanno perso la loro forma forte chevron come si vede nei controlli non trattati, e sono più vicini ai somiti caratteristiche dei fenotipi a forma di U visto quando sonic segnalazione è ridotta 14. L&#39;angolo dei somiti può essere misurata usando software standard, e l&#39;angolo aumenta da 92,1 ± 4,6 ° nei controlli non trattati a 122,6 ± 6,6 ° negli embrioni di etanolo trattati (p &lt;0,001). Un&#39;altra conseguenza di etanolo esposizione che potrebbe essere downstream del primo ritardo di sviluppo e successive difetti notocorda è una lunghezza ridotta di un embrione (Figura 3). Anche misurazione embrioni per tener conto della curvatura prodotta da esposizione etanolo, etanolo esposizione porta ad un tronco accorciata che dipende dalla dose di etanolo è stato esposto per l&#39;embrione (Figura 3E 14). Questo risultato è simile alla persistenza di statura prepubertà short trovato in bambini esposti all&#39;etanolo durante lo sviluppo del 16, 17, suggerendo che il modello di zebrafish è rilevante per la comprensione del difetto nascita umana. Una delle caratteristiche classiche della FAS è una facies classici, tra cui una mandibola ridotta, apertura piccolo occhio, e un philtrum liscia. Gran parte di queste caratteristiche sono correlata ad una riduzione nei tessuti della linea mediana. È stato dimostrato in modelli animali che etanolo esposizione grave porta a fenotipi ancor più pronunciati, compresi synopthalmia e ciclopia. Quando expocantare embrioni di zebrafish a dosi maggiori di etanolo, la distanza intraoculare (IOD) riduce in modo dose-dipendente (Figura 4) coerente con la natura del difetto nascita umana. Cyclopia si trova solo con dosi molto elevate, ma dosi inferiori producono una significativa riduzione del IOD (figura 4), ​​suggerendo che questo modello animale ha un difetto simile in linea mediana dello sviluppo facciale 10. Al fine di comprendere il meccanismo alla base dei difetti sia nel corpo e del viso prodotto da etanolo esposizione, abbiamo cercato di determinare le variazioni di espressione genica che si verificano all&#39;inizio di sviluppo e che possono essere ragionevolmente dovrebbe contribuire a difetti dello sviluppo successivo. Facciamo questo in due modi, l&#39;estrazione di mRNA da embrioni permette una valutazione quantitativa dei livelli di espressione genica in embrioni di etanolo trattati rispetto ai controlli (Figura 1A). Inoltre, si può eseguire in situibridazione di guardare il modello di geni, indipendentemente dal fatto che il segnale viene diminuita (Figura 1B G-18). In questo esempio, due geni la cui espressione è diminuita dopo l&#39;esposizione a etanolo sono mostrati, e gli1 six3b. Quando abbiamo esaminato il modello in situ per six3b, abbiamo trovato una riduzione della estensione spaziale del espressione di questo gene (Figura 1 EG) in embrioni esposti a etanolo. Una riduzione simile è stato trovato nel gene GSC (Figura BD). Sia six3b e gsc sono espressi in tessuti destinati a contribuire alla cranio-facciali tessuti della linea mediana. Quindi, la riduzione di questi geni a 8 hpf è coerente con la riduzione IOD trovato seguito come mostrato nella Figura 4. Una volta che i geni che sono affetti da etanolo sono identificati, vi sono meccanismi mediante i quali l&#39;espressione di essi può essere aumentato o diminuito. In questo particolare EXAesempio, nell&#39;ambito abbiamo dimostrato 2 geni che sono diminuiti (gli1 e six3b) da qPCR. Abbiamo scelto di iniettare mRNA per determinare se l&#39;inversione di tali cambiamenti genetici possono migliorare i risultati. Per questo esperimento, invece di iniettare gli1, abbiamo scelto di iniettare shh, un ligando che aumenta gli1 livelli. Per six3b, siamo stati in grado di iniettare six3b stesso. Non abbiamo trovato cambia quando abbiamo iniettato six3b (dati non riportati), ma sono stati in grado di salvare fondamentalmente i difetti lordi in embrioni di zebrafish con iniezioni supplementari shh (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig1.jpg" /> Figura 1. Esposizione etanolo cambia il modello precoce e livelli di espressione genica di geni dello sviluppo selezionati. A) i risultati qPCR per gli embrioni a 8hpf. I risultati di due geni vengono visualizzati: six3b e gli1. I risultati mostrati come media di tre esperimenti separati,e la dose di etanolo mostrato è del 2,5%. Entrambi i geni sono ridotti in maniera significativa dal controllo (t-test, p &lt;0,05). BG) L&#39;ibridazione in situ di 8 embrioni di zebrafish HPF. Sia la GSC e modelli six3b sono alterati a questo punto tempo rispetto ai controlli. (Modificata con il permesso di Loucks et al. 2007). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig2.jpg" /> Figura 2. Sviluppo somite è alterata in embrioni trattati. Somite struttura e gli angoli vengono esaminati a 48 HPF. In embrioni di controllo (A), hanno una forma somiti chevron e un angolo acuto. Zebrafish Etanolo esposti hanno più angoli di I o U somiti, e meno tagliente. (Modificata con il permesso di Loucks e Ahlgren 2009). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig3.jpg" /> Figura 3. Trattamento etanolo diminuisce significativamente lunghezza del corpo in zebrafish.La lunghezza di embrioni non trattati e etanolo-esposti sono stati misurati a 5 postfertilization giorni. Una riduzione significativa lunghezza è stata osservata in tutti gli embrioni trattati (ANOVA, p &lt;0,001). BD. C&#39;è stata una leggera riduzione ma significativa nella lunghezza totale di embrioni trattati con 1,0% e 1,5% etanolo, mentre una maggiore riduzione è stata osservata in embrioni dosate con 2,0% e 2,5% di etanolo. E. Per controllare le differenze di dimensioni in ogni frizione, gli embrioni di controllo per ciascun esperimento sono stati normalizzati a 100, e gli embrioni di pari livello trattati espressa come percentuale di 100. (Modificata con il permesso di Loucks e Ahlgren 2009). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig4.jpg" /> Figura 4. Risultati etanolo esposizione in una riduzione della distanza intraoculare (IOD) in embrioni di zebrafish. A) viste frontali di embrioni dimostrano fenotipi occhi normali e fusa. B) Distinguere le dosi di etanolo somministrata per 3 ore durante res gastrulazioneULT è diminuito in iod quando i pesci sono esaminati dopo 24 ore. Occhi fusi e ciclopia si vedono solo alla massima dose testata (2,4%). * Denota una significativa riduzione iod rispetto ai controlli. (Modificato con il permesso di Ahlgren, 2004). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig5.jpg" /> Figura 5. Shh-N iniezione di mRNA salva i difetti lordi prodotti da esposizione etanolo di zebrafish. Uno-due embrioni di cellule sono state iniettate con 100 pg / nl shh-N mRNA e la metà degli embrioni iniettati sono stati esposti a dosi standard di etanolo 4,3-24 HPF. Gli embrioni sono stati analizzati a 5 dpf. Gli embrioni trattati con 2,0% di etanolo esibiscono sul dorso curvo code più corte, I-forma somiti, e difetti agli occhi, compresa ciclopia. Salvataggio di questi fenotipi è visto in 71/76 di embrioni iniettati (93%). In questi embrioni, il corpo è dritto, i somiti sono chevron forma, e gli occhi sono completamente separati.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

I metodi qui descritti e mostrati i risultati dimostrano che la punta di zebrafish come può essere utilizzato per interrogare difetti di sviluppo. A causa della accessibilità dell&#39;embrione, elevato numero di uova deposte per ogni frizione e alta riproducibilità dei risultati, questi vertebrati sono ideali per gli studi teratogeni. Pesci possono essere manipolati per contenere molecole fluorescenti da utilizzare come reporter visivo per un gene particolare o percorso di interesse 19. Negli studi di etanolo, le dosi utilizzate appaiono piuttosto elevato rispetto ai livelli di alcool nel sangue dei mammiferi. Tuttavia, questi livelli riflettono ciò che è presente nell&#39;acqua, e non tutto l&#39;etanolo è consegnato l&#39;embrione. Nel loro insieme, i metodi descritti e riportati sopra suggeriscono che embrioni di zebrafish sono molto utili a modellare difetti di nascita umani derivanti da un&#39;esposizione etanolo. Inoltre, i cambiamenti di espressione genica si trovano nel pesce zebra sono stati confermati da altrinei sistemi modello mammiferi 20, suggerendo che gli effetti sviluppo di etanolo sono mantenuti in vertebrati. Molte delle tecniche dimostrate sopra può essere utilizzato con altri insulti ambientali o farmaceutica per rilevare rapidamente e facilmente potenziali teratogeni e determinare i meccanismi che contribuiscono alla teratogenesi di una particolare sostanza.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Tissue RNA kit: 5-Prime PerfectPure </td><td> Fisher Scientific </td><td> FP2302410 </td></tr><tr><td> Platinum SYBR green qPCR Supermix-UDG </td><td> Invitrogen </td><td> 11733038 </td></tr><tr><td> mMessage mmachine alto rendimento limitato kit di trascrizione RNA </td><td> Applied Biosystems </td><td> Dipende dalla RNA polimerasi nel plasmide </td></tr></tbody></table>

assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure

Sindrome alcolica fetale (FAS) è una manifestazione grave di esposizione embrionale in etanolo. Si presenta con difetti caratteristici al viso e gli organi, tra cui ritardo mentale dovuto allo sviluppo del cervello disordinato e danneggiati. Disturbo dello spettro fetale alcolico (FASD) è un termine usato per coprire un continuum di difetti di nascita che si verificano a causa di consumo di alcol materno, e si verifica in circa il 4% dei bambini nati negli Stati Uniti. Con il 50% delle donne in età fertile età segnalazione consumo di alcol, e la metà di tutte le gravidanze non pianificate essere, l&#39;esposizione non intenzionale è un problema costante 2. Al fine di comprendere al meglio il danno prodotto da etanolo, oltre a produrre un modello con cui testare possibili interventi, abbiamo sviluppato un modello di esposizione etanolo di sviluppo utilizzando l&#39;embrione zebrafish. Zebrafish sono ideali per questo tipo di studio teratogeno 3-8. Ogni coppia dispone di centinaia di uova, che possono poi essere raccolti senza danneggiare l&#39;adultopesce. L&#39;embrione zebrafish è trasparente e può essere facilmente ripreso con qualsiasi numero di macchie. L&#39;analisi di questi embrioni dopo esposizione a etanolo a dosi differenti e tempi di durata e mostra l&#39;applicazione che i difetti gravi sviluppo prodotte da etanolo sono coerenti con il difetto nascita umana. Qui descritte sono le tecniche di base utilizzate per studiare e manipolare il modello zebrafish FAS.

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Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Al fine di comprendere i meccanismi molecolari del danno indotto da etanolo di sviluppo, abbiamo sviluppato un modello di esposizione zebrafish etanolo e stanno esplorando le caratteristiche fisiche, alterazioni cellulari e genetiche che si verificano dopo l&#39;esposizione etanolo<sup&gt; 1</sup&gt;. Abbiamo poi cercare di trovare possibili interventi e consentirne una rapida prova in questo modello animale.

Valutare i cambiamenti teratogeni in un modello di Zebrafish di esposizione alcolica fetale

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

26.2K Views.  Children's Memorial Research Center. Al fine di comprendere i meccanismi molecolari del danno indotto da etanolo di sviluppo, abbiamo sviluppato un modello di esposizione zebrafish etanolo e stanno esplorando le caratteristiche fisiche, alterazioni cellulari e genetiche che si verificano dopo l'esposizione etanolo 1. Abbiamo poi cercare di trovare possibili interventi e consentirne una rapida prova in questo modello animale.

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Moderate Prenatal Alcohol Exposure and Quantification of Social Behavior in Adult Rats

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several independent laboratories have demonstrated robust alterations in the social behavior of rodents exposed to alcohol during brain development across a wide range of exposure durations, timing, doses, and ages at the time of behavioral quantification. Prior work from this laboratory has identified reliable alterations in specific forms of social interaction following moderate prenatal alcohol exposure (PAE) in the rat that persist well into adulthood, including increased wrestling and decreased investigation. These behavioral alterations have been useful in identifying neural circuits altered by moderate PAE1, and may hold importance for progressing toward a more complete understanding of the neural bases of PAE-related alterations in social behavior. This paper describes procedures for performing moderate PAE in which rat dams voluntarily consume ethanol or saccharin (control) throughout gestation, and measurement of social behaviors in adult offspring.

The goal of the protocol presented here is to describe procedures to expose rats to moderate levels of alcohol during prenatal brain development and to quantify resulting alterations in social behavior during adulthood.

Moderata esposizione prenatale di alcool e quantificazione di comportamento sociale in ratti adulti

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several ...

Ricerca

Comportamento

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

Analisi istologiche di lesioni al fegato acuto alcolico in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Biologia dello sviluppo

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizzati high-throughput analisi comportamentali nelle larve Zebrafish

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Neuroscienze

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features of a unique and convenient model system. As highly proliferative cells are more susceptible to radiation-induced DNA damage, zebrafish embryos are a front-line in vivo model in radiation research. In addition, this model projects the effect of radiation and different drugs within a short time, along with major biological events and associated responses. Several cancer studies have used zebrafish, and this protocol is based on the use of radiation modifiers in the context of radiotherapy and cancer. This method can be readily used to validate the effects of different drugs on irradiated and control (non-irradiated) embryos, thus identifying drugs as radio sensitizing or protective drugs. Although this methodology is used in most drug screening experiments, the details of the experiment and the toxicity assessment with the background of X-ray radiation exposure are limited or only briefly addressed, making it difficult to perform. This protocol addresses this issue and discusses the procedure and toxicity evaluation with a detailed illustration. The procedure describes a simple approach for using zebrafish embryos for radiation studies and radiation-based drug screening with much reliability and reproducibility.

The zebrafish has recently been exploited as a model to validate potential radiation modifiers. The present protocol describes the detailed steps to use zebrafish embryos for radiation-based screening experiments and some observational approaches to evaluate the effect of different treatments and radiation.

Larve di pesce zebra come modello per valutare potenziali radiosensibilizzanti o protettori

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Ricerca sul cancro

Construction of Vapor Chambers Used to Expose Mice to Alcohol During the Equivalent of all Three Trimesters of Human Development

Exposure to alcohol during development can result in a constellation of morphological and behavioral abnormalities that are collectively known as Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). At the most severe end of the spectrum is Fetal Alcohol Syndrome (FAS), characterized by growth retardation, craniofacial dysmorphology, and neurobehavioral deficits. Studies with animal models, including rodents, have elucidated many molecular and cellular mechanisms involved in the pathophysiology of FASDs. Ethanol administration to pregnant rodents has been used to model human exposure during the first and second trimesters of pregnancy. Third trimester ethanol consumption in humans has been modeled using neonatal rodents. However, few rodent studies have characterized the effect of ethanol exposure during the equivalent to all three trimesters of human pregnancy, a pattern of exposure that is common in pregnant women. Here, we show how to build vapor chambers from readily obtainable materials that can each accommodate up to six standard mouse cages. We describe a vapor chamber paradigm that can be used to model exposure to ethanol, with minimal handling, during all three trimesters. Our studies demonstrate that pregnant dams developed significant metabolic tolerance to ethanol. However, neonatal mice did not develop metabolic tolerance and the number of fetuses, fetus weight, placenta weight, number of pups/litter, number of dead pups/litter, and pup weight were not significantly affected by ethanol exposure. An important advantage of this paradigm is its applicability to studies with genetically-modified mice. Additionally, this paradigm minimizes handling of animals, a major confound in fetal alcohol research.

We demonstrate the construction of alcohol vapor chambers using readily available materials that simultaneously house 6 mouse cages. We further describe their use in a mouse model of fetal alcohol exposure equivalent to all 3&#160;trimesters of human pregnancy. This paradigm exposes animals during gestation and postnatal days 1-12.

Costruzione di vapore Chambers utilizzato per esporre topi da alcol Durante l&#39;equivalente di tutti i tre trimestri di Sviluppo Umano

Exposure to alcohol during development can result in a constellation of morphological and behavioral abnormalities that are collectively known as Fetal ...

Medicina

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies and neurological impairments. With a complex pathology, FASD affects approximately 1 in 100 children born in the United States each year. Due to the highly variable nature of FASD, animal models have proven critical in our current mechanistic understanding of ethanol-induced development defects. An increasing number of laboratories has focused on using zebrafish to examine ethanol-induced developmental defects. Zebrafish produce large numbers of externally fertilized, genetically tractable, translucent embryos. This allows researchers to precisely control timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts and quantify the impact of embryonic ethanol exposure through live imaging techniques. This, combined with the high degree of conservation of both genetics and development with humans, has proven zebrafish to be a powerful model in which to study the mechanistic basis of ethanol teratogenicity. However, ethanol exposure regimens have varied between different zebrafish studies, which has confounded the interpretation of zebrafish data across these studies. Here is a protocol to quantify ethanol concentrations in zebrafish embryos using head space gas chromatography.

This work describes a protocol to quantify ethanol levels in a zebrafish embryo using head space gas chromatography from proper exposure methods to embryo processing and ethanol analysis.

Quantificazione dei livelli di etanolo negli embrioni di pesce zebra utilizzando la cromatografia dello spazio della testa

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of nitrate to nitrite by gut and salivary bacteria. However, in other mammalian studies, high nitrite levels do not cause birth defects, although they can lead to poor reproductive outcomes. Thus, the teratogenic potential of nitrite is not clear. It would be useful to have a vertebrate model system to easily assess teratogenic effects of nitrite or any other chemical of interest. Here, we demonstrate the utility of zebrafish (Danio rerio) to screen compounds for toxicity and embryonic defects. Zebrafish embryos are fertilized externally and have rapid development, making them a good model for teratogenic studies. We show that increasing the time of exposure to nitrite negatively affects survival. Increasing the concentration of nitrite also adversely affects survival, whereas nitrate does not. For embryos that survive nitrite exposure, various defects can occur, including pericardial and yolk sac&#160;edema, swim bladder noninflation, and craniofacial malformation. Our results indicate that the zebrafish is a convenient system for studying the teratogenic potential of nitrite. This approach can easily be adapted to test other chemicals for their effects on early vertebrate development.

Exposure to teratogens may cause birth defects. Zebrafish are useful for determining the teratogenic potential of chemicals. We demonstrate the utility of zebrafish by exposing embryos to various levels of nitrite and also at different times of exposure. We show that nitrite can be toxic and cause severe developmental defects.

Zebrafish come modello per valutare il potenziale teratogeno di nitriti

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Immunologia e infezioni

Modeling Fetal Alcohol Spectrum Disorders in Zebrafish to Characterize the Impact of an Adverse Embryonic Environment on Adult Social Behavior

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, and cognitive abnormalities are associated with FASD. Social difficulties are common behavioral abnormalities associated with FASD and often result in serious health issues. Animal models are critical to understanding the mechanisms responsible for ethanol-induced social defects. Zebrafish are social vertebrates that produce externally fertilized transparent eggs; these characteristics provide researchers with a precise yet simple procedure for creating the FASD phenotype and an innate behavior that can be leveraged to model the social deficits associated with FASD. Thus, zebrafish are ideal for characterizing the social deficits of FASD. The goal of the current protocol is to provide the user with a simple behavioral assay that can be used to characterize the consequences of a negative environment early during development and the effects it can have on social behavior in adulthood. The protocol can be used to characterize the effect mutations or teratogens have on adult social behavior. The protocol outlined here demonstrates how to characterize the social behavior of individual fish during a 20-min social assay. Furthermore, the data obtained using the current protocol provides evidence that the protocol can be used to characterize the effects of embryonic ethanol-induced social defects in adult zebrafish.

The goal of the current protocol is to outline the steps necessary to establish and use a social preference assay for adult zebrafish and demonstrate that it can be used to characterize ethanol-induced social defects.

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, ...

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

Il sistema Zebrafish Tol2: un approccio di transgenesi modulare e flessibile basato su gateway

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Small Molecule Screening and Toxicity Testing in Early-stage Zebrafish Larvae

Zebrafish have become a prominent model organism for human translational research, toxicity testing of small molecules and environmental pollutants, therapeutic drug discovery, and other biomedical research applications. The presented protocol aims to provide a clear guide for drug screening and toxicity testing in early-stage zebrafish larvae (aged 3-7 days post fertilization, dpf). Several methodologies describing toxicity testing in zebrafish larvae have been published, albeit lacking a standardized protocol for exposure durations, rate of media changes, and morphology scoring, amongst others. We experimentally determined the ideal larvae ages for conducting the experiments, the plate sizes that work best for those ages, the rate of media changes that provide reliable results while limiting wastage&#160;of test compound, and a morphology scoring system that is easily quantifiable in a statistical manner. The manuscript describes in detail a protocol for toxicity testing in zebrafish larvae aged between&#160;3 to 7 dpf, aiming to target the gap in drug toxicity testing and taking the first step towards a standardized method similar to the Fish Embryo Acute Toxicity test.

This protocol describes a drug screening procedure in zebrafish larvae 3-7 days post fertilization followed by morphological assessment.

Screening di piccole molecole e test di tossicità nelle larve di zebrafish in fase iniziale

Zebrafish have become a prominent model organism for human translational research, toxicity testing of small molecules and environmental pollutants, ...