Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Science Foundation, la McKnight Endowment Fund for Neuroscience, il Christopher e Dana Reeve Foundation e Fondazione Amerisure beneficenza.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ci sono diverse discussioni in buona laser microchirurgia con sistemi laser diversi 3,5-11. I laser a femtosecondi IR sono il &quot;gold standard&quot; per l&#39;ablazione laser subcellulare 12 e conveniente se associato ad un impianto di imaging, ma spesso sono troppo costosi per i singoli utenti. Se avete bisogno di un laser a femtosecondi per l&#39;imaging IR il campione a causa della profondità delle immagini allora si avrà probabilmente bisogno di un laser per assotomia. Tessuti trasparenti con assoni target entro 30-50 um della superficie sono probabilmente fattibile con impulsi laser blu e verde nel UJ / impulso 20 target range attraverso una lente ad alta immersione na. Ci saranno danni collaterali di più con il laser nano e pico secondi rispetto al laser a femtosecondi, tanto più che la profondità aumenta assone il bersaglio. C. elegans è trasparente e tutti gli assoni sono entro 20-30 um della superficie. Noi abitualmente taglio assoni motori che si trovano entro 5 um della superficie. Abbiamo anche facilmente tagliare asciaons all&#39;interno dell&#39;anello nervose che sono circa 20 um dalla superficie della cuticola. Abbiamo trovato il limite per il taglio di assoni di essere di circa 30-50 um attraverso il diametro di un verme adulto. E &#39;probabile che il sistema di ablazione laser qui descritto dovrebbe funzionare bene con molti preparazioni diverse che soddisfano i criteri di trasparenza e la profondità degli assoni di destinazione. Eppure, è un po &#39;sorprendente, dato il vantaggio teorico del laser a femtosecondi IR, che 355 nm nano e picosecondo e 532 nm laser svolgere così bene per laser assotomia in C. elegans 6,13. Non vediamo differenze nella rigenerazione degli assoni in risposta al laser assotomia con nanosecondo 440 nm, 532 nm nanosecondo, infrarossi e laser a femtosecondi. Stato solido 355 nm laser UV sono circa lo stesso costo della 532 nm diodo pompato passivamente Q-Switched laser a stato solido, ma richiedono potenze superiori o ottiche che passano in modo efficiente queste lunghezze d&#39;onda più corta. La maggior parte delle ottiche sono progettati per eseguire ben visibile con 400 -700 nm di luce. 355 nm laser offrirebbe alcuni vantaggi 6 come soglia plasmatiche ridotte, dimensione dello spot più piccoli, e un dicroico passaggio lungo in modo efficiente diretta del 100% del laser ablazione al target e permettere l&#39;imaging simultaneo di GFP senza perdita di segnale campione. I laser blu 440 nm avrebbe mantenuto i vantaggi di lavorare con un laser a luce visibile (buone prestazioni con ottica standard e di sicurezza). Purtroppo, il costo di un DPP Q-switched a stato solido 440 nm laser è 3 volte il costo di un laser 355nm o 532 nm di potenza simile in questo momento. Se dovessimo progettare un nuovo sistema per la C. elegans, dove la profondità obiettivo è minimo, dovremmo optare per una lente trasparente UV (costo circa $ 3.000 per una lente 40X olio 1.3na con 50-70% di trasmittanza a 355nm) e un laser a 355 nm, la produzione di 5-10 UJ / impulso a 1 -20 kHz. Ablazione assone è pensato per essere causa di formazione di plasma. Impulsi più brevi produrrà soglie di plasma a bassa potenza e il volume del plasma w<html> malati più piccolo 6. L&#39;obiettivo è quello di produrre il plasma più piccolo e più breve durata, regolando l&#39;energia dell&#39;impulso al minimo potere. Grandi longevi plasma genera bolle di cavitazione che danneggiano le cellule circostanti. Abbiamo trovato generalmente che l&#39;ablazione con circa 50-100 impulsi a frequenza più alta (cioè 2,5 kHz) dà i migliori risultati. Ciò suggerisce che il danno può essere gradualmente integrati su una serie di impulsi per controllare meglio l&#39;entità del danno. Il sistema di ablazione laser qui descritto è molto indulgente se il fascio è allineato ed espanso con precisione. Partiamo taglio assoni in vermi adulti in potenza del laser del 10% (media di 0,3 mW misurata a 2500 Hz e circa 1 UJ / impulsi) e può tagliare con danni limitati localizzato a 14% di potenza. È possibile osservare grandi aree di danno 15-39% della potenza laser, ma solo al di sopra del 40% di potenza (circa 1 mW media misurata a 2500 Hz) fare i vermi esplodere a causa di bolle di cavitazione e grandi danni al cuticola del worm. e_content &quot;&gt; I et al. 2010 2 carta è una risorsa eccellente per la costruzione di un sistema di ablazione laser. Steinmeyer Leon Avery ha anche una bella descrizione pratica di un sistema di ablazione laser basato su un laser a gas poco costoso nm N2 337 e si fornisce alcuni pratici grande consulenza (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Nel progettare il vostro sistema si deve prima parlare con il rappresentante microscopio per determinare come obiettivo l&#39;ablazione laser per l&#39;obiettivo microscopio. Il microscopio deve essere montato su un tavolo isolamento delle vibrazioni (Newport, TMI, Thor). Una parte superiore basetta è ottimale, ma un piano in acciaio solido può ancora essere utilizzato con posizionatori magnetico. Un modulo dedicato intermedio in un ambito in piedi è bello perché tutti gli elementi ottici possono essere lasciati sul posto. Tuttavia, può essere meno costoso e più conveniente per utilizzare una porta macchina fotografica (invertito) o un &quot;combinatore&quot; allegato a un epi-fluorescenza porta. È necessario conoscere la dimensione della apertura posteriore e la trasmissione (a uno<html> blation laser a lunghezza d&#39;onda) della lente obiettivo che si intende utilizzare. Una volta che si decide su un laser (per esempio, Crylas, TEEM, Crystal, o CRC) è necessario contattare Thor o Newport per aiutare con la selezione degli elementi giusta ottica, le attrezzature hardware e sicurezza. Abbiamo deciso su un expander doppio trave Galileo per risparmiare spazio, ma una semplice espansione kepleriana è un&#39;opzione (f2/f1 = fattore di espansione). Un expander fascio personalizzato sarà il meno costoso, ma Newport, Thor, e molti dei produttori di laser offrono ottime qualità commerciale del fascio espansori. Alcuni produttori offrono anche attenuatori laser manuale e controllata elettronicamente, che può essere conveniente e risparmiare spazio, ma non è versatile come il polarizzatore Glan-Thompson e onda piastra metà. Sarà inoltre necessario decidere come controllare il laser. È possibile progettare un controller basato LabView, utilizzare un generatore commerciale TTL, o software forniti dalla società laser. Discutere le opzioni con il produttore laser specifici. tenda &quot;&gt; Abbiamo fornito un elenco dell&#39;hardware che abbiamo utilizzato solo come guida generale. Il sistema descritto qui costano circa $ 15.000 quando aggiunto al nostro sistema di imaging esistente. Il dipartimento di Fisica locali hanno spesso qualcuno disposto a fornire un&#39;introduzione pratica alla tranquillamente lavorare con i laser a fascio libero. Metodi alternativi per l&#39;immobilizzazione e il tempo lapse imaging di C. elegans sono state recentemente descritte 14. Risoluzione dei problemi Il passo più difficile e critica è l&#39;allineamento del fascio centrato ampliato rispetto all&#39;asse ottico del microscopio. Una volta che hai centrato il raggio e ampliato attraverso le lenti Galileo si deve lavorare sodo per farlo allineati entro 5 um di asse ottico del microscopio PRIMA di usare gli specchi guida per l&#39;allineamento finale al centro. L&#39;uso eccessivo degli specchi dello sterzo per allineare il fascio al microscopio lo spostamento fuori asse attraverso il fascioespansione. UTILIZZARE ESTREMA CAUTELA è possibile attenuare il fascio laser con il filtro ND appropriato e visualizzare direttamente il profilo del fascio laser su un bersaglio riflettente (specchio superficie frontale). Si può spingere delicatamente il microscopio per centrare il proprio raggio nel campo dell&#39;obiettivo 60X di vista (se non può essere centrato in alto / basso gamma è necessario regolare l&#39;altezza della ferrovia). Il profilo del fascio può essere usato per allineare con precisione l&#39;asse ottico microscopio per dare un raggio centrata che è circolare e di &quot;razzi&quot; simmetricamente. Un bagliore asimmetrico è un&#39;indicazione che l&#39;asse microscopio non è perfettamente allineato (o la ferrovia non è in piano). Infine, è necessario regolare L3 e constatare uno sviluppo uniforme e simmetrica e la contrazione del raggio. Messa a fuoco il microscopio proprio sulla superficie di destinazione e quindi regolare L3 mettere a fuoco il raggio laser per la più piccola macchia. Si dovrebbe ora trovare il raggio laser che si trova a 5 um del centro quando immaginato attraverso LSCM o CCD sistema e il punto è all&#39;interno di ablazione1um di messa a fuoco Z. Se si trova si sta &quot;esplodere&quot; vermi o costantemente generando bolle di cavitazione grande per tagliare assoni il tuo problema è molto probabilmente l&#39;allineamento di precisione del laser ablazione. Assicurarsi che il minimo (&lt;500 nm) posto ablazione è localizzata al centro Z (regolare la convergenza con lente L3) e al posto XY fiduciario (regolare con l&#39;ultimo specchio cinematicamente montato). Targeting assoni più vicino alla superficie richiedono meno potenza del laser. Allo stesso modo, piccoli animali (L1 e L2) richiedono potenza del laser in meno per assotomia rispetto al targeting degli assoni stessi negli adulti. Se il vostro assoni wild-type non si rigenerano o la candeggina assoni si dovrebbe provare a ridurre la potenza del laser di imaging o diminuendo la frequenza di campionamento. Se il worm morire o diventare stucchevole provare a ridurre la percentuale di agarosio con incrementi dell&#39;1%. Assicurati di non spostare il coprioggetti dopo vermi di montaggio come questo spesso li inducono a morire quando si utilizzano elevate perpercentuale di agarosio e microsfere. Se il worm scoppio o morire durante un time-lapse sessione è dovuto a: 1. Percentuale di agarosio è troppo alta. 2. Danni alla cuticola di ablazione laser. 3. Movimento dei coprioggetto dopo il montaggio. Se il danno per la cuticola è la colpa sarà solo sui vermi montati che sono stati colpiti con l&#39;ablazione laser. Se il verme si muove troppo durante un time-lapse sessione di provare ad aumentare la percentuale di agarosio 0,5% in passi. Assoni sani in vermi sani sono sempre &quot;attivo&quot; e visualizzare un livello coerente di fluorescenza. Se si vede una diminuzione improvvisa della fluorescenza o attività del worm sta morendo o morto. Multiple assoni perline o frammentate sono un segno sicuro di un worm morente o morta. Se avete difficoltà a mantenere il tuo assoni a fuoco durante l&#39;intera sessione lasso di tempo ci possono essere diversi problemi. Prima controlla la tua deriva palco da un campione di imaging inerte su un vetrino da oltre 10 orers. Una deriva pochi micron può essere dovuto alla instabilità termica, ma superiore a 5 um è probabilmente a causa di problemi meccanici con il microscopio. Problemi con il montaggio sono più comuni. Lasciate che il vostro worm montato equilibrare con quello scelto microscopio per 30 minuti prima di iniziare il lasso di tempo. Verificare che il sigillo vaselina non hanno sviluppato le perdite nel corso della sessione lasso di tempo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> 535 nm laser </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (TEEM, Crystal, e CRC offrono anche laser comparabili) </td></tr><tr><td> Tutte le ottiche e l&#39;hardware </td><td></td><td></td><td> (Thor offre ottiche comparabili e hardware) </td></tr><tr><td> SUPREMA ottica Monte, 1.0-di diametro </td><td> Newport </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1 &quot;messaggio di diametro, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;di diametro della forcella postale </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromatico Zero-Order Wavel Plate, Onda ½ Ritardo, 400-700nm </td><td> Newport </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rotazione Stage 1 &quot;Aperature </td><td> Newport </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;messaggio di diametro, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;di diametro della forcella postale </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-Laser Calcite polarizzatore, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polarizzatore rotazione Monte </td><td> Newport </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;distanziatore per 1&quot; post diametro </td><td> Newport </td><td> PS-0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;altezza, 1&quot; post diametro </td><td> Newport </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Forcella, 1 &quot;post diametro </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fascio di scarico </td><td> Newport </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Microscopio Obiettivo Attacco obiettivo </td><td> Newport </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;messaggio di diametro, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;di diametro della forcella postale </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ad alta energia Nd: YAG laser Specchio, Diametro 25,4 mm, 45 °, 532 nm </td><td> Newport </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SUPREMA ottica Monte, diametro 1,0 pollici, foro passante di montaggio </td><td> Newport </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Alta precisione di regolazione a vite manopola, viaggi da 12,7 mm, 100TPI </td><td> Newport </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Adattatore filettato, ¼ di sesso maschile -20, 8-32 femminile </td><td> Newport </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod Morsetto asta per 1,5 pollici di diametro </td><td> Newport </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 pollici (35,5 cm) di altezza </td><td> Newport </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Vettore ferroviario, per X26, lunghezza 40 millimetri quadrati </td><td> Newport </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Acciaio Rail, 384 millimetri (15 &quot;) di lunghezza </td><td> Newport </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Piattaforma asta asta per 1,5 pollici di diametro </td><td> Newport </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 pollici (35,5 cm) di altezza </td><td> Newport </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-Concave Lens, diametro 12,7 mm,-25mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Lente piano-convessa, diametro 25,4 mm, 50,2 millimetri EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Lente piano-convessa, diametro 25,4 mm, 62,9 millimetri EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Attacco obiettivo fisso, 0,5 &quot;di diametro, 1.0&quot; Asse altezza </td><td> Newport </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Attacco obiettivo fisso, 1,0 &quot;di diametro, 1.0&quot; altezza Axis </td><td> Newport </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Microsfere 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> EEO questioni </td></tr><tr><td> Muscimolo </td><td> Sigma </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

Laser assotomia seguito da time-lapse microscopia è un test sensibile per fenotipi la rigenerazione degli assoni in C. elegans 1. La difficoltà principale di questo saggio è il costo percepito ($ 25-100K) e tecniche necessarie per implementare un sistema di ablazione laser 2,3. Tuttavia, laser a stato solido a impulsi dei costi modesti (&lt;$ 10K) in grado di fornire prestazioni elevate per l&#39;ablazione laser in preparati trasparenti in cui gli assoni di destinazione sono &quot;vicini&quot; alla superficie del tessuto. Costruzione e l&#39;allineamento di un sistema può essere compiuto in un giorno. Il percorso ottico fornito dalla luce del condensatore focalizzato alla ablazione laser fornisce una comoda guida di allineamento. Un modulo intermedio con tutte le ottiche rimossa può essere dedicata alla ablazione laser e assicura che non gli elementi ottici devono essere spostati durante una sessione di ablazione laser. Un dicroico nel modulo intermedio permette l&#39;imaging simultaneo e ablazione laser. Centrando il raggio laser to il raggio uscente dalla lente focalizzata condensatore microscopio guida l&#39;allineamento iniziale del sistema. Una varietà di lenti utilizzata per il condizionamento ed espandere il raggio laser a riempire l&#39;apertura posteriore della lente dell&#39;obiettivo scelto. Allineamento finale e la prova viene eseguita con un fronte bersaglio superficie del vetrino di vetro specchiato. Potenza del laser è adeguato per dare un minimo posto ablazione dimensioni (&lt;1um). Lo spot è centrato ablazione con regolazioni di precisione dello specchio ultimi cinematicamente montato di una croce fissa nella finestra di imaging. Laser di potenza per assotomia sarà di circa 10 volte superiore a quello necessario per il primo posto ablazione minima sulla diapositiva di destinazione (questo può variare con l&#39;obiettivo di utilizzare). I worm possono essere immobilizzato per laser assotomia e time-lapse imaging montaggio su cuscinetti agarosio (o in camere di microfluidica 4). Pastiglie di agarosio sono fatti facilmente con il 10% di agarosio in soluzione salina bilanciata fuso in un forno a microonde. Una goccia di agarosio fuso viene posto su un vetrino e appiattito con un altrovetrino in un trampolino di circa 200 um di spessore (un singolo strato di nastro tempo scorre adiacente viene utilizzato come distanziatore). Un berretto &quot;Sharpie&quot; è usato per tagliare un pad circolare uniforme diametro di 13mm. Anestetico (1UL muscimolo 20mm) e microsfere (Chris Fang-yen comunicazione personale) (1UL 2,65% polistirolo 0,1 um in acqua) vengono aggiunti al centro del pad seguita da 3-5 vermi orientata in modo che siano coricati su un fianco sinistro. Un coprioggetto di vetro è applicata e poi vaselina viene utilizzato per sigillare il coprioggetto ed evitare l&#39;evaporazione del campione.

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Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser assotomia seguito da time-lapse imaging è un modo sensibile al test gli effetti delle mutazioni in<em&gt; C. elegans</em&gt; Sulla rigenerazione degli assoni. Una qualità elevata, ma economico, sistema di ablazione laser possono essere facilmente aggiunti alla maggior parte dei microscopi. Passa il tempo di imaging più di 15 ore richiede un&#39;attenta immobilizzazione del worm.

Costruzione di un laser a basso costo del sistema assotomia per studiare la rigenerazione assonale nel C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

constructing-low-budget-laser-axotomy-system-to-study-axon

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

15.4K Views.  University of Utah. Laser assotomia seguito da time-lapse imaging è un modo sensibile al test gli effetti delle mutazioni in C. elegans Sulla rigenerazione degli assoni. Una qualità elevata, ma economico, sistema di ablazione laser possono essere facilmente aggiunti alla maggior parte dei microscopi. Passa il tempo di imaging più di 15 ore richiede un'attenta immobilizzazione del worm.

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

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Bioingegneria

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

Un sistema sperimentale per studiare meccanotrasduzione in cellule polmonari fetali

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Semplici dispositivi microfluidici per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

Studio Locomotion quantitativa di Liberamente Nuoto microorganismi Uso diffrazione laser

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is subject to chemical and mechanical signals, and the mechanisms by which it senses and responds to mechanical signals are poorly understood. Elucidating the role of forces in cell maturation will enable the design of scaffolds that can promote cell adhesion and cytoskeletal coupling to the substrate, and therefore improve the capacity of different neuronal types to regenerate after injury.
Here, we describe a method to apply simultaneous force spectroscopy measurements during laser induced cell lesion. We measure tension release in the partially lesioned axon by simultaneous interferometric tracking of an optically trapped probe adhered to the membrane of the axon. Our experimental protocol detects the tension release with piconewton sensitivity, and the dynamic of the tension release at millisecond time resolution. Therefore, it offers a high-resolution method to study how the mechanical coupling between cells and substrates can be modulated by pharmacological treatment and/or by distinct mechanical properties of the substrate.

We measured the tension release in an axon that was partially lesioned with a laser dissector by simultaneous force spectroscopy measurement performed on an optically-trapped probe adhered to the membrane of the axon. The developed experimental protocol evaluates the axon adhesion to the culture substrate.

Misura della tensione di uscita durante Laser Induced Axon Lesione di valutare Adesione assonale al substrato a piconewton e Millisecond Risoluzione

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Produzione di nanoparticelle metalliche mediante ablazione laser pulsata nei liquidi: uno strumento per studiare le proprietà antibatteriche delle nanoparticelle

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Costruzione di un laser a basso costo del sistema assotomia per studiare la rigenerazione assonale nel C. elegans

Riepilogo

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