Ringraziamo il UMass nucleo citometria a flusso: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu e Tammy Krupoch. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) e NIH CA T32-130807 (JRS). Risorse di base sostenuto dalla Endocrinologia Diabetes Research Center concedere DK32520 sono stati utilizzati anche.

1. La raccolta dei tessuti <ol><li> Preparare provette contenenti 2-5 buffer di colorazione fredda ml (soluzione salina tampone fosfato (PBS) con aggiunta di 0,2% di BSA e glucosio 5mm). Sì che le tubature in ghiaccio prima del raccolto dei tessuti. </li><li> Cull topi in accordo con il protocollo approvato (CO es. 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale). </li><li> Prelievo di sangue da puntura cardiaca in EDTA o eparina tubi di raccolta del sangue per analisi successive, ad esempio, di ematocrito, conta dei reticolociti o analisi CBC. </li><li> Raccolta la milza e le ossa, ponendo tessuti da ogni mouse in un tubo separato, preparato al punto 1. Facile accesso a milza è dal lato sinistro. Per il midollo osseo, la raccolta di uno o entrambi i femori. Mantenere il tessuto raccolte sul ghiaccio. </li><li> Se lo si desidera, pesare la milza. I topi sottoposti a una risposta eritropoietica lo stress è probabile che presentino un significativo aumento del peso della milza. </li></ol> 2. Preparazione di cellule della milza <ol><li> Utilizzando un pre-umidificata 3 ml stantuffo della siringa, spingere delicatamente la milza, o una parte della milza (idealmente, 0,1 grammi o meno, pari a circa 10 8 cellule) attraverso un colino 40 micron cellula sterile (numero di catalogo Fisherbrand 22363547 o altro) collocato su un tubo da 50 ml. Tenere la provetta in ghiaccio durante questa procedura. Lavare le cellule attraverso il filtro con un totale di 2 ml di tampone colorazione. </li><li> Pipetta delicatamente la sospensione forzata delle cellule per rompere eventuali grumi di piccole dimensioni. Se necessario, ri-deformazione delle cellule. </li><li> Lavare le cellule due volte tramite centrifugazione e ri-sospendere in tampone a freddo. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Le rese sono 1-2 x 10 8 cellule / milza. Per le analisi di citometria a flusso, aliquote 1-2000000 cellule per campione, sia in tubi colorazione FACS (BD polistirolo Falcon fondo rotondo tubi, 352008) o U-bottom 96 pozzetti (BD Falcon 353910). Colorazione volume del campione è di 200 microlitri, ad una concentrazione cellulare finale ,5-1 x 10 7 cellule / ml o 1-2 x 10 6 cellule / 200 microlitri del campione. </li></ol> 3. Preparazione di cellule di midollo osseo <ol><li> Preparare 1 o 3 ml siringhe con un ago inserito 26G, pre-riempita con tampone colorazione fredda. </li><li> Rimuovere i muscoli collegati al femore in modo da visualizzare l&#39;osso in modo chiaro. </li><li> Utilizzando taglienti forbici chirurgiche, snip fuori entrambe le estremità del femore, il più vicino possibile alle estremità delle ossa. Questo dovrebbe rivelare un piccolo foro alle estremità tagliata, leader nella cavità del midollo osseo, che attraversa la lunghezza del femore. </li><li> Utilizzando il siringhe pre-riempite al punto 1, inserire l&#39;ago attraverso uno di questi fori, e delicatamente a filo il midollo attraverso il buco dall&#39;altra parte, in un tubo. </li><li> Dissociare le cellule lavata pipettando dolce, e filtrare con un colino 40 micron, come per la milza superiori (vedere paragrafo 2.1). </li><li> Lavare le cellule due volte tramite centrifugazione in tampone colorazione fredda </li><li> Contare le cellule e risospendere come nella sezione 2.4. Le rese sono circa 10 7 cellule per femore. </li></ol> 4. Preparazione delle cellule del fegato fetale <ol><li> Per preparare topi di sesso femminile a tempo-incinta, istituito topi per l&#39;accoppiamento, la sera, per esaminare le spine vaginale entro le ore 10 del giorno successivo, il giorno in cui viene rilevata la spina vaginale è considerato giorno 0,5. Il personale veterinario sia in grado di assistere i ricercatori che non hanno familiarità con questa tecnica per identificare le donne in gravidanza. Gravidanza può essere determinata anche in peso di monitoraggio del mouse. </li><li> Topi femmina incinte sono scadute abbattuti nei giorni 12,5-14,5 di gravidanza. Le corna uterine vengono rimossi in una Petri-piatto contenente ghiacciata terreno di coltura o di buffer colorazione. </li><li> Gli embrioni sono stati rimossi da ogni dell&#39;utero e del fegato fetale è sezionato. Un microscopio da dissezione è richiesto per il giorno embrionale 12,5 (E12.5) o più giovani. </li><li> Fegato può essere dissociato meccanicamente pipettando nel buffer, e sono trattati singolarmente in piastre a 96 pozzetti, o in pool insieme, a seconda delle esigenze sperimentali. </li><li> Un fegato fetale a E13.5 ha ~ 10 7 cellule. Le cellule vengono lavate due volte in colorazione buffer e risospese a 1-2 x 10 6 cellule / 200 microlitri del campione per l&#39;analisi di citometria di flusso. </li></ol> 5. Colorazione anticorpi per citometria a flusso <ol><li> Preparare un anticorpo primario colorazione pre-mix da utilizzare per tutti i campioni, ad eccezione di campioni di controllo, contenente quanto segue: <ul><li> ChromePure coniglio IgG (Jackson, 015-000-003), ad una concentrazione finale di 200μg/ml. Controllare la concentrazione magazzino sulla bottiglia (che può variare). Questo è usato per bloccare i recettori Fc in cellule di topo, specie alternative che possono essere utilizzati per questo sono IgG di topo o ratto IgG. Scelta delle specie è determinata dalla potenziale presenza nel protocollo di colorazione di anticorpi diretti contro secondaria primari di ratto / topo / coniglio anticorpi, nel qual caso tali specie non può essere utilizzatod come anticorpi bloccanti. In alternativa, siero di coniglio 5% può inoltre essere utilizzato al posto di IgG purificate. Un&#39;ulteriore alternativa è l&#39;uso di anticorpi monoclonali o frammenti Fab diretto a livello dei recettori Fc mouse. Il protocollo di base di seguito non include alcun anticorpi IgG secondario e quindi di una qualsiasi delle tre specie possono essere utilizzati. </li><li> CD71-FITC, diluito 1:200 (stock 0.5mg/ml, BD-Biosciences, 553266) </li><li> Ter119-PE, diluito 1:200 (stock 0.2mg/ml, BD-Biosciences, 553673) </li><li> Eventuali ulteriori anticorpi diretti a epitopi superficie di interesse, ad esempio, gli anticorpi diretti al Fas o FasL (vedi 1,2). Mescolare la soluzione di anticorpi delicatamente invertendo il tubo di 2-3 volte. </li></ul></li><li> Aggiungere 200 ml di pre-mix per ogni campione cellulare e risospendere delicatamente le cellule. </li><li> Preparare i campioni di cellule di controllo come segue: <ul><li> &#39;Non colorati&#39;: queste cellule vengono lasciate in colorazione tampone e di fornire l&#39;autofluorescenza di sfondo delle celle. </li><li> Controlli &#39;monocolore&#39;: un tale controllo è richiesto per ogni anticorpo / colore utilizzato nel protocollo. Le cellule di questi controlli sono macchiati o con un anticorpo coniugato direttamente primario, o sia con un anticorpo primario e un anticorpo secondario coniugato. Questi controlli vengono utilizzati per correggere sovrapposizione spettrale tra i canali. </li><li> &#39;Fluorescenza meno uno&#39; (FMO) controlli: un controllo tale è richiesto per ogni anticorpo / colore nel protocollo: le cellule sono colorate con tutti i colori / anticorpi nel protocollo, tranne per il colore / anticorpo per cui questo è il controllo FMO. Il controllo QOR per un particolare canale fornisce lo sfondo vero per quel canale. Può includere non specifici anticorpi dello stesso isotipo e coniugato con lo stesso marchio fluorescenza come l&#39;anticorpo test (controllo isotipico). </li></ul></li><li> Incubare i campioni ed i controlli rilevanti nel anticorpo primario macchia in ghiaccio per 45 &#39;a 1 ora al buio (messo foglio di copertura in alluminio su ghiaccio secchio). </li><li> Alla fine di incubazione, lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 3 ml di tampone colorazione ad ogni provetta e girare per 3 &#39;a 5&#39; a circa 400 xga 4 ° C. Se si utilizza piastre a 96 pozzetti, lavare le cellule tre volte in un volume di 200 l. </li><li> Se del caso, applicare anticorpo secondario macchia. Applicare e lavare come per il primo anticorpo macchia. </li><li> Se del caso, una macchia con annessina V è applicata alla fine di incubazione, utilizzando un buffer Hepes come nelle istruzioni del produttore. Questa macchia è applicata per 15 minuti a temperatura ambiente, o per 1 ora su ghiaccio. </li><li> Le cellule sono nuovamente sospesi per l&#39;analisi di citometria a flusso nella colorazione soluzione contenente una cella-impermeabile colorante del DNA, di escludere le cellule morte. Coloranti del DNA sono disponibili diversi, tra cui ioduro di propidio, 7-amino-actinomicina D (7AAD), o DAPI. La scelta di questi dipende, tra i canali disponibili, dato i canali ripreso per la colorazione degli anticorpi specifici e canali disponibili sul citometro a flusso. 7AAD è ottenuto da BD-Biosciences (559.925) e utilizzato secondo le istruzioni del produttore. Per la colorazione DAPI, fare uno stock di 1mg/ml in dimetilformammide (DMF) da polvere (Roche, Cat # 236276), tenere a -20 ° C e diluire 1:10.000 a 1:15.000 in colorazione buffer. </li></ol> 6. Citometria a flusso ordinamento <ol><li> Le cellule sono etichettati con anticorpi anti-CD71, Ter119, marcatori lignaggio, e un colorante vitalità come descritto per analisi di citometria di flusso (sezione 5). Concentrazione delle cellule durante l&#39;etichettatura può essere aumentata a 5 x 10 7 / ml. </li><li> Mescolare un uguale volume di ciascuno dei seguenti anticorpi per rendere il master mix lignaggio: <ul><li> FITC Rat anti-topo CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553848 </li><li> FITC Rat anti-topo CD45R/B220 RA3-6b2, BD Pharmingen 553087 </li><li> Hamster FITC anti-topo CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061 </li><li> FITC Rat anti-topo CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396 </li><li> FITC Rat anti-topo Ly-6G e Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126 </li><li> Utilizzare il master mix a 1:80 (Questo è equivalente a diluizione 1:400 di ciascun individuo titoli di anticorpi, che sono tutti 0,5 mg / ml). </li></ul></li><li> Usa bassa pressione condizioni di ordinamento e ugelli di larghezza. Per l&#39;Aria (BD Biosciences) che usiamo 100 ugelli μ, 20 psi di pressione. </li><li> Collezione buffer: PBS con aggiunta del 20% siero fetale bovino. </li><li> Per controllare la purezza delle popolazioni in ordine, ri-eseguire una piccola aliquota di ogni campione in un buffer che contiene un colorante vitalità (7AAD o simili). </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: CD71/Ter119 colorazione degli adulti di midollo osseo o milza identifica una sequenza evolutiva di quattro sottoinsiemi, etichettati ProE, EryA, EryB e Eryc (Figura 1) 1. Morfologicamente, questi corrispondono a eritroblasti sempre più maturo. La figura 1 illustra la sequenza di gating in fase di analisi dei dati, che scarta evento molto piccoli (tra cui nuclei, globuli rossi), le cellule aggregati e cellule morte. Espressione di proteine ​​di superficie cellulare possono essere misurate simultaneamente per ognuno di questi sottoinsiemi, aggiungendo gli anticorpi relativi al tempo stesso Ter119 e CD71 colorazione. La figura 1 mostra un esempio di espressione sulla superficie cellulare del recettore Fas morte 1. Questa misurazione è stata effettuata in topi trattati con Epo, o nei topi di controllo iniettati con soluzione salina. E &#39;evidente che Epo sopprime l&#39;espressione di Fas nella popolazione EryA in vivo 1. Espressione di proteine ​​intracellulari o ciclo cellulare lo stato può anche essere misurata per le cellule in ogni sottogruppo. La figura 2 illustra rappresentante analisi del ciclo cellulare delle cellule del midollo osseo appena raccolte. Queste misure richiedono, oltre alla colorazione della superficie delle cellule con CD71 e Ter119, la fissazione e la permeabilizzazione delle cellule per l&#39;etichettatura intracellulare (vedere la sezione di discussione). Nel fegato fetale, non eritroidi cellule vengono prima esclusi da gating su &#39;Lin-&#39; cellule che sono negative per CD41, Mac-1, Gr-1, B220 e CD3 (Figura 3). Le cellule rimanenti sono suddivisi in 6 sottogruppi, S0 a S5. Il modello preciso di cellule nel fegato fetale dipende dall&#39;età embrionale (vedere la sezione di discussione). Un rappresentante di analisi del ciclo cellulare del sottoinsieme S3 in E13.5 fegato fetale viene visualizzato (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 CD71/Ter119 sottoinsiemi eritroide nella milza del mouse strategia Gating A.:.. Le cellule della milza sono stati elaborati ed etichettato con anticorpi diretti a CD71, Ter119 e Fas. Questa figura mostra la strategia di analisi che segue la fase di acquisizione dati. Istogramma I mostra tutti gli eventi acquisiti. Il cancello diagonale rappresenta gli eventi che possono essere singole cellule, escluse le doppiette o più grandi aggregati. Le cellule in questa porta verranno analizzati nella istogramma II. Eventi qui molto piccoli, nuclei probabile o detriti, sono esclusi. Le cellule gated sono mostrati in istogramma III, in cui sono esclusi DAPI cellule positive, che sono probabilmente cellule apoptotiche membrana permeabile, da ulteriori analisi. Istogramma IV mostra la popolazione risultante di cellule della milza vitali. Il cancello ProE contiene CD71 alto Ter119 cellule intermedie. Ter119 cellule alte sono ulteriormente analizzati in istogramma V. Qui le cellule CD71 elevati sono suddivisi in meno maturi, grandi eritroblasti &#39;EryA&#39; (CD71 alto Ter119 alta FSC alto) e più piccoli, più maturi &#39;EryB&#39; eritroblasti (CD71 alto Ter119 alto FSC basso) . Il sottoinsieme eritroblasti più maturi sono Eryc (CD71 bassa Ter119 alta FSC basso). VI istogramma mostra espressione sulla superficie cellulare Fas, in particolare nel sottogruppo EryA, nei topi, nello stato basale (iniettati con soluzione fisiologica), e topi iniettati con una singola dose di Epo. Colorazione con anticorpi Fas è stata effettuata in contemporanea con la colorazione CD71/Ter119. B. Cytospin preparazioni di cellule ordinate da ciascuno dei sottoinsiemi indicati. Le cellule sono state colorate con Giemsa e con diaminobenzidina, quest&#39;ultimo genera una macchia marrone con l&#39;emoglobina. Dati Cytospin è stato originariamente pubblicato nel Liu et al. Sangue. 1 luglio 2006, 108 (1) :123-33. Epub Mar 2006 9. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Analisi del ciclo cellulare del CD71 alta Ter119 eritroblasti alto nel midollo osseo dei topi. I topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con BrdU, e della milza o del midollo osseo sono state raccolte 30 a 60 minuti dopo. Le cellule sono state fissate e permeabilizzate e oltre ad essere colorate per CD71 e Ter119, sono state colorate per incorporazione di BrdU nel loro DNA la replica con un anticorpo monoclonale diretto a BrdU (protocollo di fissazione, permeabilizzazione e BrdU-colorazione è stata secondo le istruzioni del produttore). BrdU-positive le cellule sono in fase S del ciclo. Cellule interfase sono BrdU-negativi e possono essere risolti in fasi G1 o G2 / M, usando il DNA colorante 7AAD. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3 CD71/Ter119 sottoinsiemi eritroide nel fegato fetale topo strategia Gating A.:.. Cellule del fegato fetale sono stati etichettati per CD71, Ter119, e un cocktail di anticorpi coniugati con fluoresceina direttamente i non eritroide marcatori lignaggio (&#39;Lin&#39;). Cellule vitali (7AAD-negativo) sono stati analizzati per l&#39;espressione Lin, e Lin-cellule sono ulteriormente suddivisi in S0 a S5 sottoinsiemi eritroidi. Giovane, E13 fegato fetale è composto da eritroblasti meno mature, dimostra l&#39;assenza di cellule mature in S4/S5 sottoinsiemi. B. Cytospin preparazioni di cellule ordinate da ciascuno dei sottoinsiemi indicati. Le cellule sono state colorate con Giemsa e con diaminobenzidina, quest&#39;ultimo genera una macchia marrone con l&#39;emoglobina. Dati Cytospin originariamente published in Pop et al, PLoS Biol 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Analisi del ciclo cellulare di sottoinsiemi fegato fetale eritroide. Femmine di topo gravide sono stati iniettati con BrdU e fegato fetale sono state raccolte 30 a 60 minuti dopo, fissa, permeabilizzate e colorate con anticorpi anti-CD71, Ter119 e BrdU. Ciclo cellulare delle cellule stato S3 è mostrato.

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	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dalla University of Massachusetts Medical School IACUC commissione.

Il flusso-citometria metodologia permette indagine simultanea di tutte le funzioni cellulari che possono essere rilevati con una fluorescenza coniugato anticorpo specifico o ligando, tra cui marcatori di superficie cellulare, espressione di proteine, la sopravvivenza cellulare, segnalazione cellulare utilizzando anticorpi fosfo-specifici 3 e lo stato del ciclo cellulare. Queste misurazioni possono essere effettuate in ciascuna di un certo numero di differenziazione fase sottoinsiemi specifici, nel contesto di...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Fas-biotina </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Streptavidina-APC </td><td> Molecular Probes </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 micron filtro cellule sterili </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> Polistirolo a fondo rotondo tubi per la colorazione FACS </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> U-bottom 96 pozzetti </td><td> BD Falcon </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure coniglio IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD-Biosciences </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI polvere </td><td> Roche </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-topo CD41 MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-topo CD45R/B220 RA3-6b2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-topo CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-topo Ly-6G e Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> Hamster FITC anti-topo CD3e 145-2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU flusso kit </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Annessina V-biotina </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

Lo studio dell&#39;eritropoiesi si propone di capire come globuli rossi sono formate da progenitori ematopoietici in precedenza e eritroide. In particolare, il tasso di formazione dei globuli rossi è regolata dalla ormone eritropoietina (Epo), la cui sintesi è innescata da ipossia tissutale. Una minaccia a risultati adeguati ossigenazione dei tessuti in un rapido aumento Epo, guidando un aumento della frequenza eritropoietica, un processo noto come la risposta allo stress eritropoietica. Il conseguente aumento del numero dei globuli rossi circolanti aumenta l&#39;ossigeno di consegna dei tessuti. Una risposta efficace dello stress eritropoietica è quindi fondamentale per la sopravvivenza e il recupero da condizioni fisiologiche e patologiche quali l&#39;altitudine elevata, anemia, emorragia, la chemioterapia o il trapianto di cellule staminali. Il mouse è un modello fondamentale per lo studio della eritropoiesi e la sua risposta allo stress. Eritropoiesi topo definitiva (di tipo adulto) avviene nel fegato fetale tra i giorni embrionale 12,5 e 15,5, nella milza neonatale, e nella milza e nel midollo osseo degli adulti. Metodi classici di identificazione progenitori eritroidi nel tessuto si basano sulla capacità di queste cellule per dare origine a colonie di globuli rossi quando placcato in Epo contenenti semi-solido dei media. Loro progenie precursore eritroidi sono identificate sulla base di criteri morfologici. Nessuno di questi metodi classici consentire l&#39;accesso a un gran numero di differenziazione-stadio-specifiche cellule eritroidi per lo studio molecolare. Qui vi presentiamo un flusso-citometria metodo di identificazione e differenziazione studio-stadio-specifici progenitori eritroidi e precursori, direttamente nel contesto del tessuto del mouse appena isolato. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e sul flusso-citometria a parametro &#39;avanti dispersione&#39;, che è una funzione della dimensione della cella. Il CD71/Ter119 test può essere utilizzato per studiare progenitori eritroidi durante la loro risposta allo stress eritropoietica in vivo, per esempio, nei topi anemici o nei topi tenuti in condizioni di scarsità di ossigeno. Può anche essere usata per studiare progenitori eritroidi direttamente nei tessuti di topi adulti geneticamente modificati o embrioni, al fine di valutare il ruolo specifico del pathway molecolare modificata in eritropoiesi.

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Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Un metodo di citometria a flusso per l&#39;identificazione e l&#39;analisi molecolare di cellule progenitrici murino differenziazione fase-specifici eritroide e precursori, direttamente nel midollo del mouse appena raccolte osseo, milza o del fegato fetale. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e le dimensioni delle cellule.

Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

identification-analysis-mouse-erythroid-progenitors-using-cd71ter119

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

32.1K Views.  University of Massachusetts Medical School. Un metodo di citometria a flusso per l'identificazione e l'analisi molecolare di cellule progenitrici murino differenziazione fase-specifici eritroide e precursori, direttamente nel midollo del mouse appena raccolte osseo, milza o del fegato fetale. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e le dimensioni delle cellule.

Video: Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Biologia

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

Un dosaggio quantitativo di insulina che esprimono formante colonia Progenitori

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

Identificazione dei fattori chiave di regolazione auto-rinnovamento e differenziazione in cellule ematopoietiche precursori EML da Analysis RNA-sequencing

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Saggio di screening basato su SA-Galactosidase per l'identificazione dei farmaci senoterapici

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, uncoupling of metabolism to generate heat, and secretion of adipokines to regulate whole-body homeostasis and immune responses. Emerging research is identifying important regional differences in the developmental, molecular, and functional profiles of adipocytes located in discrete depots throughout the body. Different properties of the depots are medically relevant since metabolic diseases often demonstrate depot-specific effects. This protocol will provide investigators with a detailed anatomic atlas and dissection guide for the reproducible and accurate identification and excision of diverse mouse adipose tissues. Standardized dissection of discrete adipose depots will allow detailed comparisons of their molecular and metabolic characteristics and contributions to local and systemic pathologic states under various nutritional and environmental conditions.

Adipocytes exist in discrete depots and have diverse roles within their unique microenvironments. As regional differences in adipocyte character and function are uncovered, standardized identification and isolation of depots is crucial for advancement of the field. Herein, we present a detailed protocol for the excision of various mouse adipose depots.

Identificazione e dissezione dei diversi depositi di adiposi del mouse

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l'analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

Un dosaggio quantitativo di insulina che esprimono formante colonia Progenitori

L'analisi fenotipica e l'isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Generazione di topi derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

L'analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l'interazione proteina-proteina

Identificazione dei fattori chiave di regolazione auto-rinnovamento e differenziazione in cellule ematopoietiche precursori EML da Analysis RNA-sequencing

Saggio di screening basato su SA-Galactosidase per l'identificazione dei farmaci senoterapici

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

Identificazione e dissezione dei diversi depositi di adiposi del mouse

Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay

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