Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of numero Salute concedere R21-HL094828-01 assegnato al Dr. Poelzing.

1. Preparare funzione del rumore e del segnale di ingresso <ol><li> Creare una funzione rumore contenente le componenti di frequenza desiderata. Questo può essere fatto descrivendo i componenti frequenza desiderata nel dominio della frequenza e quindi il calcolo della inversa trasformata rapida di Fourier. In questo studio, 1 - 15 kHz è stato utilizzato. Tutte le trasformate di Fourier e trasformate di Fourier inversa descritto in questo studio sono stati calcolati utilizzando Matlab FFT e funzioni IFFT. </li><li> Scala l&#39;ampiezza della funzione di rumore in modo appropriato. In questo studio la funzione di rumore è stato scalato in modo tale che lo zero a picco di ampiezza della funzione di rumore era 50 o 100 mV. </li><li> Creare un file stimolo con metodi adeguati per il software di acquisizione in uso. Per CLAMPEX 8, prima creare un file di testo con l&#39;intestazione appropriata. Sotto l&#39;intestazione, inserire gli incrementi di tempo per una sola passata nella prima colonna. Gli incrementi di tempo deve avere la stessa spaziatura temporale come l&#39;intervallo di campionamento utilizzato nelle misure. Per ogni spazzare nel protocollo fase di tensione inserire la tensione esatta desiderato ad ogni passo. Questo dovrebbe includere la funzione del rumore. </li></ol> 2. Effettuare misurazioni con la pinza di tensione <ol><li> Creare un protocollo di misura all&#39;interno del software di acquisizione che è compatibile con il file stimolo generato in precedenza. In CLAMPEX, c&#39;è un menu che consente all&#39;utente di associare un file di stimolo con il protocollo corrente. </li><li> Allegare un modello (o biologico) delle cellule alle apparecchiature di misura. </li><li> Eseguire l&#39;esperimento come programmato. A fini di controllo, assicurarsi di includere le misurazioni periodiche che non prevedono alcuna funzione del rumore. </li></ol> 3. Messaggio Esperimento Analisi <ol><li> Calcolare la curva IV per una registrazione individuale. Se la registrazione è a stato stazionario quando la funzione di rumore viene applicata, la curva IV possono essere creati utilizzando una parte allo stato stazionario della registrazione temporalmente al di fuori della gamma della funzione del rumore. Se la registrazione non era in stato stazionario, la funzione di rumore può interferire con il calcolo della curva IV, per cui una seconda registrazione deve essere fatta senza la funzione di rumore presente. </li><li> Per ogni fase di tensione in una registrazione calcolare la trasformata rapida di Fourier della porzione della registrazione in cui è stata inserita la funzione di rumore. Combina la trasformata di Fourier per ogni step di tensione in amxn matrice, dove m è il numero di frequenze in FFT, e n è il numero di passi di tensione. In questa configurazione, ogni riga della matrice rappresenta l&#39;ampiezza di una singola frequenza a tutte le fasi di tensione durante l&#39;esperimento. </li><li> Per ogni frequenza (cioè ogni riga della matrice sopra) correlare la riga con la curva IV generata in 3.1 e registrare il coefficiente di correlazione. </li><li> Tracciare il coefficiente di correlazione vs frequenza per visualizzare frequenze che altamente correlati con la curva IV. Poiché la componente DC è contenuta all&#39;interno la prima frequenza della FFT, il coefficiente di correlazione per questa frequenza dovrebbe sempre essere&gt; 0,99. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Le misurazioni rappresentative morsetto di tensione sono mostrate per una cella modello senza (Figura 1A) e con (Figura 1B) una funzione di disturbo inseriti nel protocollo fase di tensione. La curva IV è stato calcolato per il modello di cellulare (Figura 1C). Per ogni sweep, nelle registrazioni dalla Figura 1, la FFT è stato calcolato nel periodo di tempo in cui è stata inserita la funzione di rumore (vedi riquadro rosso nelle Figure 1A, 1B). Figure 2A e 2B mostrano la FFT calcolato per le registrazioni Figura 1A e 1B, rispettivamente. Su ispezione visiva, la componente DC (evidenziati in rosso) sembra imitare la forma della curva IV. Senza la funzione di rumore, tutte le frequenze sopra DC sembrano avere ampiezze vicino allo zero (Figura 2A). Quando la funzione rumore viene inserito, frequenze comprese tra 1 e 15 kHz hanno ampiezze visivamente evidente (Figura 2B). La figura 3 mostra il risultato di correlare ampiezze di frequenza individuale su tutta la gamma di gradini di tensione contro la curva IV. Figura 3A-C mostra i coefficienti di correlazione, quando l&#39;esperimento è stato fatto in condizioni di controllo (nessuna funzione rumore) e con ampiezze di rumore di 50 e 100 mV, rispettivamente. Si noti in tutti i casi, la componente DC sembra essere correlata quasi perfettamente con la curva IV. Infatti, per tutte le registrazioni, il coefficiente di correlazione per questa frequenza è stata superiore a 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, media ± deviazione standard). Quando guardiamo figura 3A (condizioni di controllo), non ci sono frequenze oltre alla componente continua la cui ampiezza è correlata in modo significativo con la curva IV. In particolare, nessuna di queste frequenze hanno coefficienti di correlazione superiore a 0,5. Al momento l&#39;inserimento della funzione di ampiezza minore rumorosità (50 mV), queste stesse frequenze ancora coefficienti di correlazione inferiore a 0,5. I coefficienti di correlazione per l&#39;frequenze anche se non sono diventati superiori a 0,5 quando l&#39;ampiezza del rumore è stato aumentato a 100 mV. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="Figura 1" /> . Figura 1 Modello di Registrazioni Cell: registrazioni morsetto di tensione sono indicati per una cella modello senza (1A) e con (1B) una funzione di rumore compresi nel protocollo fase di tensione. Per i primi e ultimi 20 ms di ogni scansione, il potenziale è stato mantenuto al potenziale tenendo (0 mV). Ogni passo tensione era lungo 80 ms, e la funzione di rumore è stato inserito 40 ms dopo l&#39;inizio del passo. La funzione del disturbo ha una durata di 30 ms e contenuti frequenze comprese tra 1 e 15 kHz. Tensione è stato un passo indietro, -150 a +50 mV con incrementi di 5 mV. Una curva IV per la cella modello è inoltre mostrato (1C). Per rendere le registrazioni più facili da leggere, solo ogni spazzare quinto è stato incluso nella 1A e 1B, ma tutto spazza sono stati inclusi nella 1C. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 FFT delle registrazioni:. La FFT è stato calcolato per la quota di 30 ms di ciascuna scansione in cui la funzione di rumore è da inserire (l&#39;area delimitata dal riquadro rosso nelle Figure 1A, 1B). Figure 2A e 2B mostrano la FFT calcolata senza e con la funzione di rumore, rispettivamente. Ancora una volta, per chiarezza, solo la FFT da ogni scansione quinto è incluso nella figura, ma tutto spazza sono stati utilizzati nei calcoli futuri. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="Figura 3" /> . Figura 3 Correlazioni Frequenza IV: I risultati delle correlazioni tra la curva IV di una registrazione e l&#39;ampiezza delle singole frequenze sopra la gamma di gradini di tensione è mostrato. Figure 1A - 1C mostrano il coefficiente di correlazione per frequenze da 0 a 20 kHz in condizioni di controllo, e in presenza di 50 o 100 funzioni di disturbo mV, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4 Ri-Creazione della Curva IV:. La curva IV della cella modello (lo stesso di Figura 1C) e la grandezza di due frequenze sono stati sovrapposti. La prima frequenza è stata la componente DC (R = 0,995), e il secondo è stato una frequenza scelta a caso con una bassa correlazione (R = 0,3212). Le ampiezze di frequenza sono stati scalati a circa la stessa ampiezza della curva IV.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ci sono ostacoli tecnici che attualmente impediscono ai ricercatori di misurare più tipi di canali ionici in contemporanea con l&#39;intento poi di determinare la quantità di corrente deve essere attribuito a ciascun tipo di canale. A causa di questa limitazione, i canali ionici sono solitamente studiati singolarmente utilizzando tecniche come la tensione, corrente, e l&#39;azione morsetto potenziale. 1 Per studiare i singoli tipi di canali, sistemi di espressione eterologa sono spesso utilizzati. 2 Quando si lavora con le cellule isolate dal tessuto, come cardiomiociti , altri mezzi devono essere utilizzati per bloccare i canali ionici diversi. Per esempio, i canali del sodio può essere inattivato da una rampa lenta di tensione depolarizzanti, 3 canali di potassio verso l&#39;interno rettificazione può essere bloccato con extracellulare BaCl2, 4 e canali del calcio possono essere bloccati con verapamil 5. Un metodo usato che supera in parte questa limitazione è quella di misurare il flusso di corrente attraverso due tipi di canali contemporaneamente, quindi ripetere la misurazione dopo bloccando selettivamente un tipo di canale con un agente adeguato. Sottrazione delle due misurazioni possono quindi essere utilizzate per stimare la quantità di corrente riconducibile al tipo di canale che è stato bloccato. 6 Tuttavia, ci sono due limitazioni principali di questa tecnica. In primo luogo, gli agenti chimici non sono stati identificati in grado di bloccare selettivamente ogni canale ionico, e alcuni farmaci ampiamente utilizzati sono non-specifici interazioni con altri tipi di canale. 5,7 secondo luogo, non può essere determinato da questa tecnica se un canale è modulata da un altro canale. Per esempio, l&#39;espressione eterogenea di Nav 1.5 e Kir 2.1 è stato mostrato in India ventricoli di maiale, ed è stato suggerito che un rapporto sinergico esistente tra i due canali, in modo che più Kir 2,1 espressione nel ventricolo destro deprime velocità di conduzione. Attualmente 8 , questo non può essere verificata. In questo studio, si consiglia di spettroscopia di impedenza può essere un utile strumento per lo studio di più tipi di canali ionici misurate simultaneamente. Anche se il metodo presentato non è mai stato utilizzato per distinguere le correnti da due tipi di canali di misura contemporaneamente, spettroscopia di impedenza è stata utilizzata per studiare una serie di altri aspetti della funzione di canale ionico. Goodman e Art ha dimostrato utilizzando tartaruga cellule ciliate uditive che i protocolli di pinza di corrente può essere modificato per sintonizzare una cella a diverse frequenze, e le oscillazioni del potenziale transmembrana è dovuto ad un interazione tra un interno rettificare K + canale e un canale di Ca 2 +. 9 Han e Frazier ha dimostrato che l&#39;impedenza può essere misurata in una singola cella in un ampio range di frequenze (100 Hz a 5 MHz), e l&#39;aumento di impedenza osservata quando K + o Ca 2 + canali sono stati bloccati potrebbe essere un mezzo semplice per rilevare blocco dei canali in schermi ad alta velocità di droga 10. Hayashi e Fishman hanno usato conduttanza complessi per studiare le proprietà cinetiche di un interno rettificare K + canale. 11 Altri gruppi hanno inserito una singola frequenza nel protocollo morsetto tensione di diversi tipi di canale e ha mostrato che il risposta in frequenza osservata d&#39;accordo con la risposta attesa per alcune frequenze, ma non altri. 12,13 Millonas e Hanck suggerito la ragione per alcune frequenze non ha prodotto la risposta attesa è la presenza di costanti di velocità più nel modello di Markov. 12 Studi come questi, così come altri, hanno dimostrato che vi sono casi in cui le correnti ioniche misurate dai canali ionici, mentre utilizzando la spettroscopia di impedenza non sono d&#39;accordo con la risposta in frequenza teorica. Questo non è un problema in questo studio perché lo scopo del metodo in questo studio è quello di identificare le frequenze che correlano con l&#39;ampiezza indipendente corrente degli assunti alla base del circuito elettrico della membrana. Furtheremore, l&#39;ampiezza della corrente viene calcolata dalle parti di registrazioni che non hanno funzioni di disturbo inseriti al loro interno. Un certo numero di altri studi, anche attuali modelli di canali ionici numerosi espositori numerosi stati condurre e non di conduzione, tutte con le loro costanti ritmo. 14,15,16 Thompson et al ha mostrato che il filtro di selettività del canale KcsA ha diversi siti di legame per il Na +, Li + e K +, ed i costi energetici di spostarsi da un sito di legame a un altro come si muove ioni attraverso il filtro di selettività è ciò che rende il canale preferenziale condotta K + ioni attraverso i suoi pori. 17 In questo lavoro abbiamo inserito una gamma di frequenze (funzione rumore) in un protocollo fase di tensione e cercato le frequenze la cui ampiezza altamente correlato con l&#39;ampiezza di corrente globale. Dal forte evidenza è stato presentato suggerendo costanti di velocità più svolgere un ruolo nella conduzione degli ioni attraverso different canali, l&#39;introduzione delle frequenze associate a questi costanti di velocità può causare certe frequenze di risonanza o altamente correlato con l&#39;ampiezza della corrente, che non sarebbe altrimenti. La tecnica ha dimostrato in questo studio viene eseguita su un modello di cellulare, che è un circuito parallelo RC che di solito è utilizzato per testare i circuiti di tensione morsetto e apparecchiature di acquisizione. Non è previsto che tutte le frequenze oltre DC sarebbe correlato con l&#39;entità attuale, e questo è dimostrato nei nostri dati. Mostriamo anche che l&#39;aggiunta della funzione di rumore non ha causato alcuna frequenza di correlare fortemente con l&#39;ampiezza della corrente. Questi due risultati sono fondamentali perché dimostrano che le apparecchiature di misura e la funzione del rumore per sé, non causa alcun frequenze di correlare con l&#39;ampiezza della corrente. Quando gli studi futuri effettuare la misurazione in membrane contenenti i canali ionici, si prevede che, a seconda del canale utilizzato, le frequenze che corrispondono alle costanti di velocità nel filtro di selettività o, eventualmente, il poro influenzano la risposta in frequenza del canale e influenzano le frequenze che hanno un elevato o bassa correlazione con l&#39;ampiezza della corrente. Poiché questo metodo è una nuova tecnica per lo studio dei canali ionici, ci sono una serie di direzioni studi futuri potrebbero seguire. In primo luogo, la tecnica deve essere utilizzata per caratterizzare la risposta in frequenza di specifici canali isolati. Lavoro in più ha anche bisogno di essere fatto per calibrare le ampiezze di frequenza per le ampiezze di corrente. Una volta di più canali sono caratterizzati individualmente, tipi di canali multipli devono essere misurate simultaneamente. La tecnica potrebbe anche essere adattati per l&#39;uso in morsa del potenziale d&#39;azione, pinza elettrica, e studi di stimolazione del campo. Mentre questa è una nuova tecnica, mostra quello che potrebbe essere un potente strumento per effettuare misurazioni elettrofisiologiche che non erano precedentemente possibili e fornire preziose intuizioni nuove informazioni sul ruolo fisiologico dei canali ionici.

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		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>n/a</td>
<td>Natick, MA</td>
</tr>
<tr>
<td>Clampex 8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Clampex 8</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Integrating Patch Clamp Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axopatch 200</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>CV202</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>16-Bit Data Acquisition System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Model Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Patch 1 Model Cell</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components

INTRODUZIONE: Attualmente, non esistono metodi consolidati per misurare più tipi di canali ionici contemporaneamente e decomporre la corrente misurata in porzioni attribuibile a ciascun tipo di canale. Questo studio dimostra come spettroscopia di impedenza può essere utilizzato per identificare frequenze specifiche che altamente correlato con l&#39;ampiezza stato stazionario corrente misurata durante gli esperimenti clamp di tensione. Il metodo prevede l&#39;inserimento di una funzione di rumore contenenti frequenze specifiche nel protocollo fase di tensione. Nel lavoro presentato, una cellula modello è usato per dimostrare che non elevate correlazioni sono introdotti dal circuito di clamp di tensione, e anche che la funzione di disturbo per sé non introduce alcuna correlazione elevata in assenza di canali ionici sono presenti. La convalida è necessario prima che la tecnica può essere applicata a preparati contenenti canali ionici. Lo scopo del protocollo presentato è quello di dimostrare come caratterizzare la risposta in frequenza di un unico tipo di canale ionico a una funzione di rumore. Una volta frequenze specifiche sono state identificate in un tipo di canale individuale, possono essere utilizzati per riprodurre il costante stato di tensione (IV) della curva. Frequenze che altamente correlati con un tipo di canale e minimamente correlato con altri tipi di canali possono poi essere utilizzate per stimare il contributo attuale di tipi di canali più misurati simultaneamente. METODI: misurazioni con la pinza di tensione sono stati eseguiti su una cella modello utilizzando un protocollo standard passo tensione (-150 a +50 mV, 5mV gradini). Funzioni di disturbo contenenti grandezze uguali di 1-15 kHz frequenze (da zero a ampiezze di picco: 50 o 100 mV) sono stati inseriti in ogni fase di tensione. La componente reale della trasformata rapida di Fourier (FFT) del segnale di uscita è stato calcolato con e senza rumore per ciascun potenziale passo. La grandezza di ogni frequenza in funzione della fase di tensione è stata correlata con l&#39;ampiezza della corrente a tensioni corrispondenti. RISULTATI E CONCLUSIONI: In assenza di rumore (controllo), grandezze di tutte le frequenze eccetto la componente DC scarsamente correlati (| R | &lt;0.5) con la curva IV, mentre la componente DC aveva un coefficiente di correlazione superiore a 0,999 in tutte le misure. La qualità della correlazione tra singole frequenze e la curva IV non cambia quando una funzione di disturbo è stato aggiunto al protocollo fase di tensione. Allo stesso modo, aumentando l&#39;ampiezza della funzione di rumore, inoltre, non ha aumentato la correlazione. Misure di controllo dimostrino che i circuiti morsetto tensione di per sé non causa alcun frequenze superiori a 0 Hz a correlare fortemente con la steady-state della curva IV. Allo stesso modo, le misure in presenza della funzione di rumore dimostrare che la funzione di rumore non provoca alcun frequenze superiori a 0 Hz a correlare con la steady-state curva IV in assenza di canali ionici sono presenti. Sulla base di questa verifica, il metodo può ora essere applicato ai preparati contenenti un singolo tipo di canale ionico con l&#39;intento di identificare le cui frequenze ampiezze correlare specifically con quel tipo di canale.

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Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

Ci sono ostacoli tecnici per la misurazione del flusso di corrente attraverso i canali ionici contemporaneamente, e poi discernere quale porzione della corrente transmembrana è dovuto a ogni tipo di canale. Per rispondere a questa esigenza, questo metodo presenta un modo per generare la curva IV di tipo singolo canale utilizzando componenti di frequenza specifica.

Ricapitolazione di una curva Ion Canale IV Uso dei componenti di frequenza

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K Views.  University of Utah. Ci sono ostacoli tecnici per la misurazione del flusso di corrente attraverso i canali ionici contemporaneamente, e poi discernere quale porzione della corrente transmembrana è dovuto a ogni tipo di canale. Per rispondere a questa esigenza, questo metodo presenta un modo per generare la curva IV di tipo singolo canale utilizzando componenti di frequenza specifica.

Video: Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

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Biologia

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

I componenti principali del microscopio ottico

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenesi sito fatto in casa Regia di Plasmidi Whole

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Quantificare la frequenza di tumori di moltiplicazione celle usando Limitare trapianto di cellule Diluizione in Singenico Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Esplorare arteriosa Muscolo liscio KV7 Funzione canale del potassio con morsetto Elettrofisiologia Patch e Myography pressione

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Caratterizzazione funzionale di Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Scambiatori di intracellulare compartimenti, utilizzando Proton-uccidere selezione di esprimerle livello della membrana plasmatica

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Misurazione della extracellulare Ion Flussi Utilizzando il ionoselettivo autoreferenziale microelettrodo Tecnica

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...