Siamo grati al professor Richard Borgens, Centro per la Ricerca Paralisi, Purdue University, per un aiuto per il montaggio della sonda sistema vibrante. Questo studio è stato sostenuto da NIH 1R01EY019101 NEI concedere a MZ e BR, e in parte da finanziamenti del California Institute of Regenerative Medicine RB1-01417, NSF MCB-0951199, e da una sovvenzione illimitata di ricerca per prevenire la cecità, UC Davis Oftalmologia.

1. Sonda Produzione Sonde vuote sono acquistati da Strumenti di precisione (World Elgiloy / acciaio rivestita parylene microelettrodi) (vedi &#39;Tabella di reagenti e attrezzature specifiche&#39; di seguito). La sonda viene tagliata 25-30 mm dietro la punta e di circa 5 mm di isolamento parylene alla fine taglio raschiato via con un bisturi (# 11 della lama) per garantire una buona connessione. La sonda è montata in un oro R30 connettore utilizzando elettricamente conduttivo d&#39;argento caricato epossidica (ad esempio Rite-Lok SL65) [* vedi nota sotto]. La sonda viene memorizzata durante la notte a temperatura ambiente per permettere la resina epossidica ad indurirsi. Successivamente, la punta della sonda è placcato in oro e platino, con un nano-amp alimentazione. La punta della sonda è risciacquato in acetone e collegato all&#39;uscita negativo di un nano-amp fonte di alimentazione. La punta della sonda è visto sotto un microscopio da dissezione (x40) e al primo posto in soluzione doratura (dicyanoaurate di potassio (0,2% w / v UAE (CN) 2 in acqua distillata (dH 2 O)). Un filo di riferimento collegato al terminale positivo uscita e immersa in soluzione completa il circuito. Una corrente di 5 nA è applicato per 5 minuti, poi aumentati a 20 nA fino a quando la punta è circa la metà della dimensione finale desiderata (circa 10-15 micron). La punta della sonda è risciacquato in dH 2 O e poi messo in soluzione platinizing (idrato cloroplatinico acido, 1% w / v H2PtCl6 * 6H 2 O) e piombo (II) acetato triidrato (0,1% w / v Pb (CH3CO 2) 2 * 3H 2 O in DH 2 O). Una corrente di 250 nA è applicato per 5 minuti, poi aumentato a 500 nA fino a quando la punta è di circa l&#39;80% della dimensione finale desiderata. La corrente è aumentato a 1 μA e applicato in 1 sec raffiche fino a quando il diametro della punta finale si ottiene (circa 30-35 micron). Infine, la punta è risciacquati in DH 2 O. Le sonde possono essere conservare a temperatura ambiente a tempo indeterminato. sonde sono danneggiati, l&#39;oro R30 connettori possono essere riutilizzati. [* Nota: alcuni sistemi della sonda hanno la sonda di montaggio collegato direttamente all&#39;amplificatore per trasportare il segnale. Altri sistemi hanno un punto di montaggio separato e connettore di segnale. In quest&#39;ultimo caso, una breve (2-3 cm) a filo con un connettore R30 ad una estremità è saldato al primo R30 connettore prima di montare la sonda (vedi Figura 2A).] 2. Sonda di sistema La sonda è collegata ad un piezo-elettrico bender montato su un 3-dimensionale di micro-posizionatore (Figura 1). Vibrazione della sonda è controllata dalla sonda di alimentazione vibrante potenza che permette anche la regolazione di ampiezza di vibrazione e frequenza. L&#39;alimentazione della sonda invia un segnale di riferimento al amplificatore lock-in, che visualizza anche la frequenza di vibrazione e l&#39;angolo di fase. E &#39;anche utile per collegare un oscilloscopio così si ha un rapido riferimento visivo di vibrazione della sonda. Il segnale dalla sonda va al amplificatore lock-in. La sonda e il campione da misurare possono essere visualizzati con un microscopio da dissezione (ingrandimento x6 a x40) con illuminazione a fibre ottiche. Durante le misure di calibrazione e il campione, un riferimento e un terreno (terra) del filo deve essere la soluzione (vedi Figura 2B). L&#39;amplificatore è collegato a un computer tramite un convertitore analogico-digitale (I / O) interfaccia. I dati vengono registrati con l&#39;intero programma cella Strathclyde Elettrofisiologia Software (WinWCP). Lock-in impostazioni amplificatore: Sensibilità [200 uV], Dynamic risoluzione [normale], Offset [su], Expand [x1], costante di tempo: pre [10 s], post [0,1 s]. Se una risposta più rapida è necessaria, il tempo pre costante può essere ridotto a 3 s. Il controllo offset viene utilizzato per portare la traccia sonda vicino al centro dello schermo. Se le risposte di grandi dimensioni sono attesi, la traccia può essere spostato in alto o in basso. WCP impostazioni del software: Durata registrazione [204,8 s], campionamenti per canale [1024], intervallo di campionamento [0,2 s], Gamma di tensione [+ / - 0,2 V]. Se si prevedono grandi correnti, l&#39;intervallo di tensione può essere aumentata a 1 V o 5 V. 3. Sonda Impostazioni Nuove sonde dovranno essere testati e la loro frequenza unica e angolo di fase determinata. La nuova sonda si trova nella camera di calibrazione contenente soluzione fisiologica (Figura 2B). L&#39;alimentazione è acceso e la frequenza alzato fino a quando la vibrazione massima si osserva. Questa è la frequenza di risonanza della sonda. Utilizzando la sonda a questa frequenza può causare instabilità e produrre rumore nella registrazione, così la sonda è &#39;de-tuned&#39; sottraendo da 10 Hz a dare frequenza di lavoro della sonda (tipicamente 150-200 Hz). L&#39;ampiezza della vibrazione è regolato in modo che la distanza vibrazione sonda è lo stesso del diametro della punta, in modo che quando la sonda è vibrato una &#39;doppia immagine&#39; della punta della sonda è visto (vedi Figura 2B). Per determinare l&#39;angolo di fase, la sonda si trova in soluzione salina nella camera di calibrazione e una corrente di 1,5 ìA / cm 2 applicato ripetutamente. L&#39;angolo di fase sulla amplificatore lock-in viene regolata fino a quando non c&#39;è risposta. Aggiungendo o sottraendo 90 ° a questoAngolo dà la massima risposta, e questo angolo è l&#39;angolo di fase di lavoro della sonda. L&#39;angolo di frequenza e di fase per ciascuna sonda si distinguono per un uso futuro. Durante un esperimento, è importante che queste impostazioni di angolo di frequenza, ampiezza e fase non vengono modificate, in modo da alterare la risposta della sonda. Per comodità, quando la corrente scorre &#39;Sud-Nord&#39;, questo dovrebbe produrre una deflessione verso l&#39;alto (qui chiamato &#39;picco&#39;) nella traccia di registrazione, e la corrente che scorre &#39;Nord-Sud&#39; dovrebbe mostrare una flessione verso il basso ( vedi figura 3A). Se questo è il modo sbagliato, aggiungendo poi 180 ° per l&#39;angolo di fase lo correggere invertendo il giro delle risposte. Vedi Reid et al. 1 per informazioni dettagliate sulla teoria che sta dietro funzione della sonda, taratura, ecc Calibrazione: La risposta della sonda ad una &#39;standard&#39; in corso di esattamente 1,5 ìA / cm 2, applicata alla sonda in una camera di calibrazione, viene utilizzato per calcolare la corrente nel campione (vedi figura 2B, 3A). Prima della misura del campione, la sonda è calibrata in soluzione del caso, ad esempio BSS + Soluzione lacrime artificiali per cornea. Corrente viene applicata in due direzioni: Sud-Nord e Nord-Sud, producendo una deflessione verso l&#39;alto e una verso il basso, rispettivamente, pari a correnti verso l&#39;esterno e verso l&#39;interno, a seconda dell&#39;orientamento del campione. La traccia sonda dovrebbe avere una base stabile e basso rumore (cfr. fig. 3A e 3B). La sonda è calibrata alla fine dell&#39;esperimento in soluzione utilizzata per compensare il cambiamento osmolalità a causa dell&#39;evaporazione. Quando si analizzano i dati, le misure della prima metà di questo esperimento può essere calcolato utilizzando i valori di taratura di partenza, e le misure dalla seconda metà calcolato utilizzando la calibrazione fine. Misura Esempio: Uno camera può essere progettato per contenere e immobilizzare il campione. Per esempio, la Figura 3C mostra Petri con anse a filo per tenere gli occhi per le misure di cornea. Il piatto contenente soluzione fisiologica è posto sotto il microscopio da dissezione e l&#39;area di interesse sul campione messo a fuoco nel campo visivo. La sonda viene quindi posto in soluzione e orientati parallelamente alla superficie del campione e anche a fuoco quindi è allo stesso livello come il punto sul campione da misurare. La sonda si sposta per quanto è conveniente (ad esempio 1-2 cm) di distanza dal campione, la vibrazione acceso (e il software per registrare) per stabilire una stabile (orizzontale) al basale (vedi Figura 4A). La sonda viene poi spostato nella posizione di misura, circa 50 micron dalla superficie. Quando la (&#39;picco&#39;) nuovo valore è stabile, la sonda si sposta in posizione di riferimento e la traccia ritorna allo stato iniziale. Questo può essere ripetuta a intervalli di tempo regolari per produrre dati timelapse, o il campione spostato / leggermente ruotato e ripetuto in diverse posizioni per produrre dati spaziali mappatura corrente (vedi Figura 4B, 5B). Analisi dei dati: i dati vengono analizzati utilizzando WinWCP (vedi Figura 5A). Linea di &#39;zero&#39; orizzontale rosso è spostato verso l&#39;alto o verso il basso in modo che sia parallela alla linea di base traccia prima del picco di misura. La linea verticale verde misura è spostata oltre alla linea di base traccia. L&#39;uscita di lettura nel verde nella parte inferiore della linea verde dovrebbe essere prossima allo zero (ad esempio 0,00012). Questo numero indica il differnce tra il punto in cui le linee rosse e verdi croce, e la traccia blu. La linea rossa è poi salito fino a quando non è parallelo con la parte superiore del picco. La lettura di uscita verde è la dimensione del picco in mV. I dati per tutti i picchi di misura, ei dati di taratura, vengono messi in un modello di foglio di calcolo Microsoft Excel (vedi tabella 1). Informazioni pertinenti, quali la data, il numero della sonda, range di tensione (VR), soluzione utilizzata, misurando la posizione, il tempo-point, ecc può anche essere messo nel foglio di calcolo. La direzione attuale (dentro o fuori del campione: &#39;I / O&#39;) è nota, e le correnti verso l&#39;interno è dato anche un valore negativo nella colonna &#39;picco&#39;. La corrente nella colonna di destra è calcolato utilizzando la formula: = corrente di picco * (1.5/calibration), dove 1.5 è la corrente in ìA / cm 2 applicato a calibrazione. Così: &#39;unw1&#39; = 12,45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 ìA / cm 2. 4. I segreti del successo Come in tutti i elettrofisiologia, messa a terra (messa a terra) di apparecchiature vitali aiuta ad eliminare il rumore. Quindi, almeno il micro-posizionatore e il telaio del microscopio deve essere messa a terra, e forse anche la sorgente di luce (vedi Figura 1). L&#39;utente può anche essere una fonte di elettricità statica, in modo di messa a terra attraverso un polso-band può prevenire l&#39;instabilità della sonda, in alcuni casi, ma non è sempre necessario. Una gabbia di Faraday non è necessario, come il blocco dei filtri amplificatore fuori tutte le frequenze (ad esempio 60Hz da rete elettrica) a parte la frequenza della sonda vibra in. Una tabella di isolamento dalle vibrazioni è utile ma non essenziale. Un solido, stabile da banco o un tavolo funziona altrettanto bene. Oltre alla baseinformazioni contenute nel foglio di calcolo Excel (vedi sopra) è utile per registrare nel proprio laboratorio-book ulteriori informazioni utili come i cambiamenti di temperatura, le aggiunte di droga, ecc Se le fotografie sono tolto il microscopio, nota l&#39;ingrandimento. Se del caso, è anche utile per disegnare uno schizzo del campione (s) che mostra la posizione e / o orientamento di misure sonda (vedi Figura 6). Passi impegnativi <ol class="lalpha"><li> Sonda fare: ci deve essere un buon collegamento elettrico tra la sonda e il connettore R30. Se non accade nulla in fase di galvanica, allora questa è probabilmente la causa. </li><li> Calibrazione: uso appropriato salina o terreno di coltura per il campione sarà di misura. Non sovra o sotto-riempire la camera di calibrazione come questo può alterare la risposta. La superficie del liquido deve essere piatta nella parte superiore della camera. </li><li> Misure campione: Piano in anticipo, ad esempio, avete bisogno di fare una camera speciale per tenere / montare il campione (vedi figura 3C)? Quando si misura da un campione, la sonda dovrebbe essere orientato con l&#39;asse parallelo lungo la superficie del campione, in modo che la direzione della sonda di vibrazione (e quindi la direzione della corrente da misurare) è perpendicolare alla superficie del campione (per esempio, vedere la Figura 4B ). Il campione può essere spostato e / o rotazione per le misurazioni in diverse posizioni. E &#39;importante mantenere una distanza costante tra la sonda e la superficie del campione durante la misurazione. La corrente misurata è proporzionale alla distanza dalla superficie del campione, come la sonda si allontana dalla superficie del campione, la corrente scende dalla legge dell&#39;inverso del quadrato. Cioè, quando si misura una corrente generata sulla superficie del campione, la corrente rilevata è inversamente proporzionale al quadrato della distanza dalla superficie. Un reticolo oculare può essere usato per valutare la distanza tra la sonda e la superficie del campione. </li></ol> Risoluzione dei problemi <ul><li> Problema: nessuna risposta alla calibrazione. Soluzione: soluzione salina di controllo è contattando entrambi gli elettrodi. Controllo della batteria in corrente costante calibratore. </li><li> Problema: la risposta di piccole dimensioni. Soluzione: pulire la sonda in dH 2 O e / o acetone. Controllare angolo di fase. </li><li> Problema: rumore o al basale instabile (vedi Figura 3B). Soluzione: Controllare i cavi di messa a terra. </li><li> Problema: traccia salta fuori dallo schermo. Soluzione: non consentono punta della sonda al tocco del campione. </li></ul> 5. Rappresentante Risultati Figura 3A mostra un buon esempio di una traccia di calibrazione. Si noti la stabile (orizzontale) al basale, a basso rumore e la risposta di grandi dimensioni. A titolo di confronto, 3B figura mostra una traccia rumoroso con base instabile. Misure di corrente in posizioni diverse in una ferita cornea del mouse sono mostrate nella figura 4B. Il pannello superiore mostra la posizione della sonda, il pannello centrale mostra le tracce della sonda come registrato sul computer e il pannello inferiore è un grafico delle correnti presso le diverse posizioni, mostrando un profilo di ferita in corso. 5B figura mostra misurazioni a una ferita della pelle del mouse effettuati a intervalli di tempo regolari per produrre i dati sul tempo attuale ferita portate. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Vibrante sistema sonda. Vedi testo per descrizione dettagliata. Testo blu descrive la funzione dei cavi di collegamento. Simboli verdi mostrano i punti di messa a terra. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A. Sonda di montaggio. La sonda viene incollato in un oro R30 connettore d&#39;argento caricato epossidica, prima di electroporating. In alcuni sistemi, un secondo connettore con un filo corto per trasportare il segnale è saldato su. Scala grafica 3 mm. La palla di platino non è in scala. B. sonda di calibrazione. Il calibratore di corrente costante (a sinistra) si applica una corrente di 1,5 ìA / cm 2 per la sonda nella camera di calibrazione (a destra). In basso a sinistra: primo piano di una sonda. Quando la sonda è vibrato (in basso a destra), l&#39;ampiezza è regolata in modo una doppia immagine della punta è visto. Scala bar 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. A. Calibrazione sonda traccia. Esempio di una traccia buona calibrazione della sonda, con la linea di base stabile, a basso rumore e la risposta di grandi dimensioni. Corrente che scorre Sud-Nord dà una deflessione verso l&#39;alto, e la corrente che scorre da nord a sud produce una deflessione verso il basso. B. Un instabile, traccia rumorosi sonda. C. Chambers fatta per il montaggio del mouse (sinistra) o di ratto (a destra) gli occhi per le misure di cornea. Scala grafica 5mm. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Dimostrare esempi di misura. A. Una linea di base stabile è stabilito con la sonda in posizione di riferimento 1-2 dal campione. Quando la sonda viene spostata in posizione di misura in prossimità del campione, si rileva unattuale e la traccia devia verso l&#39;alto (verso l&#39;esterno di corrente). B. Misure in diverse posizioni attraverso una cornea topo. Sonda è parallelo orientato alla superficie, in modo da vibrazione è perpendicolare. Picchi verso l&#39;alto mostrano le correnti verso l&#39;esterno. Corrente massima è visto ai bordi della ferita (posizioni B &amp; F). Lo schema della sonda viene visualizzato nella misura F posizione (fronte ferita a destra). Scala bar 300 micron. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. A. Analizzando le tracce della sonda. Pannello superiore: la linea rossa zero è spostato verso l&#39;alto o verso il basso in modo che sia parallela alla linea di base traccia, allora la linea di misurazione verde è spostata oltre alla linea di base così la lettura di uscita in verde è vicino a zero (0,00012). Pannello inferiore: la linea rossa è poi salito fino a quando non è parallelo con la parte superiore del picco traccia, e la lettura di uscita fornisce la dimensione del picco in mV (12.45). Correnti è calcolata da questo utilizzando i dati di calibrazione (vedi tabella 1). B. pelle mouse ferita dati Timelapse. Corrente prima ferimento è riportato al tempo zero (simbolo rosso). Misurazioni sono state effettuate nella stessa posizione in una ferita del mouse pelle timepoints regolari dopo ferimento. Dopo l&#39;iniziale correnti transitorie verso l&#39;interno (sotto zero), la corrente invertita e le correnti verso l&#39;esterno (positivo) è cresciuto lentamente e plateau. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Lab-libro di schizzi che mostrano sonda di misura posizioni. Cervello di ratto A.; puntini rossi indicano le posizioni di misura e simboli della sonda mostrano l&#39;orientamento della sonda. Ferita Rat B. cornea; puntini rossi mostrano le posizioni di misura e frecce indicano la direzione della corrente misurata. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358tab1.jpg" alt="Tabella 1" /> Tabella 1. Esempio di foglio di calcolo Excel per la memorizzazione e la quantificazione dei dati della sonda. pN2_cal1 = calibrazione di partenza; cal + e cal-= valori di calibrazione in mV; VR = range di tensione, di picco = misure campione in mV, i / o = flusso di corrente (dentro o fuori del campione).

<ol>
	<li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe.">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).</li><li>Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+in+rat+cornea:+the+role+of+electric+currents.">Wound healing in rat cornea: the role of electric currents.</a> FASEB J. 19, 379-386 (2005).</li><li>Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+currents+and+lens+regeneration+in+the+rat.">Electric currents and lens regeneration in the rat.</a> Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).</li><li>Wang, E., Reid, B., Lois, N., Forrester, J. V., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+inhibition+of+lens+epithelial+cell+proliferation:+an+additional+factor+in+secondary+cataract.">Electrical inhibition of lens epithelial cell proliferation: an additional factor in secondary cataract.</a> FASEB J. 19, 842-844 (2005).</li><li>Guo, A., Song, B., Reid, B., Gu, Y., Forrester, J. V., Jahoda, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+physiological+electric+fields+on+migration+of+human+dermal+fibroblasts.">Effects of physiological electric fields on migration of human dermal fibroblasts.</a> J. Invest. Derm. , (2010).</li><li>Reid, B., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+currents+in+Xenopus+tadpole+tail+regeneration.">Electric currents in Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Dev. Biol. 335, 198-207 (2009).</li><li>Zhao, M., Song, B., Pu, J., Wada, T., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-&#947;.">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-&#947;.</a> 442, 457-460 (2006).</li><li>Reid, B., EO, G. r. a. u. e. -. H. e. r. n. a. n. d. e. z., Mannis, M. J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+endogenous+electric+currents+in+human+corneal+wounds+-+a+novel+approach+of+bioelectric+stimulation+without+electrodes.">Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds - a novel approach of bioelectric stimulation without electrodes.</a> Cornea. , (2010).</li><li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+vibrating+probe+for+measuring+steady+extracellular+currents.">An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents.</a> J. Cell Biol. 63, 614-628 (1974).</li><li>Hotary, K. B., Nuccitelli, R., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computerized+2-dimensional+vibrating+probe+for+mapping+extracellular+current+patterns.">A computerized 2-dimensional vibrating probe for mapping extracellular current patterns.</a> J. Neurosci. Meth. 43, 55-67 (1992).</li><li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+ion+currents+and+DC+electric+fields+in+multicellular+animal+tissues.">Endogenous ion currents and DC electric fields in multicellular animal tissues.</a> Bioelectromagnetics Supplement. 1, 147-157 (1992).</li><li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+mechanisms+in+regeneration:+Unique+aspects+and+future+perspectives.">Bioelectric mechanisms in regeneration: Unique aspects and future perspectives.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 543-556 (2009).</li><li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+fields+in+wound+healing+-+An+overriding+signal+that+directs+cell+migration.">Electric fields in wound healing - An overriding signal that directs cell migration.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 674-682 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Descriviamo un basso costo, di base, ma molto sensibile sistema sonda vibrante per la misurazione non invasiva corrente elettrica in una varietà di sistemi biologici. Le modifiche possibili <ol><li> Se platino / iridio elettrodi (Strumenti di precisione mondiale; cat # PTM23B20) sono utilizzati al posto di acciaio inox, poi la fase di placcatura in oro può essere eliminato. </li></ol> Applicazioni Abbiamo usato la sonda vibrante per misura...

<table><tbody><tr><td>Eligoy-Stainless Electrode</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SSM33A70</td><td>76 mm, 7 M&amp;#937;, 1-2&amp;#x03BC;m tip</td></tr><tr><td>Gold R30 connector</td><td>www.vectorelect.com</td><td>R30</td><td>Re-usable</td></tr><tr><td>Silver-loaded epoxy</td><td>3M</td><td>SL65</td><td>Mix 1-part Resin with 1-part Hardener</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ40</td><td>Magnification x6 to x40</td></tr><tr><td>Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379867</td><td>CAUTION: Toxic</td></tr><tr><td>Chloroplatinic acid hydrate (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PtCl&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt; x 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520896</td><td>CAUTION: Toxic</td></tr><tr><td>Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; x 3H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>185191</td><td>CAUTION: Toxic</td></tr><tr><td>Nano-Amp power source</td><td>Home made</td><td>-</td><td>Powered by six 1.5 V (AAA) batteries</td></tr><tr><td>3-dimensional micro-positioner</td><td>Line Tool Co.</td><td>Model H</td><td></td></tr><tr><td>Lock-in amplifier</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR530</td><td></td></tr><tr><td>Digital I/O interface</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6220</td><td></td></tr><tr><td>Shielded Connector Block with BNC connections</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>Strathclyde Electrophysiology Software</td><td>University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK</td><td>WinWCP V4.1.5</td><td>Free download from: &lt;a href=&quot;http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm&quot;&gt;http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Calibration Chamber</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Constant Current Calibrator</td><td>Vibrating Probe Company</td><td></td><td>Powered by one 9 V (PP3) battery</td></tr></tbody></table>

measurement of bioelectric current with a vibrating probe

Campi elettrici, generati dal trasporto attivo di ioni, sono presenti in molti sistemi biologici e spesso svolgono funzioni importanti in tessuti e organi. Ad esempio, essi svolgono un ruolo importante nel dirigere la migrazione delle cellule durante la guarigione delle ferite. Qui si descrive la fabbricazione e l&#39;uso di sonde a vibrazione ultrasensibile per la misura extracellulare correnti elettriche. Il sensore è un isolato, filo metallico affilato con una piccola punta di platino-nero (30-35 micron), in grado di rilevare le correnti ioniche nei ìA / cm 2 gamma di soluzione fisiologica. La sonda viene fatta vibrare a circa 200 Hz da un piezoelettrico bender. In presenza di una corrente ionica, la sonda rileva una differenza di tensione tra gli estremi del suo movimento. Un lock-in filtri amplificatore i rumori estranei, bloccando alla frequenza della sonda di vibrazione. I dati vengono registrati su computer. La sonda è calibrata all&#39;inizio e alla fine degli esperimenti in soluzione fisiologica del caso, con una camera che si applica una corrente di esattamente 1,5 ìA / cm 2. Noi descriviamo come fare le sonde, impostare il sistema e calibrare. Abbiamo anche dimostrare la tecnica di misurazione della cornea, e mostrano alcuni risultati rappresentante di diversi esemplari (cornea, cute, cervello).

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Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

L&#39;, taratura fabbricazione e l&#39;uso di sonde a vibrazione non invasivo per misurare la corrente bioelettrica in vari sistemi biologici è descritto.

Misura della corrente bioelettrica con una sonda vibrante

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

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14.1K Views.  University of California, Davis. L', taratura fabbricazione e l'uso di sonde a vibrazione non invasivo per misurare la corrente bioelettrica in vari sistemi biologici è descritto.

Video: Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under physiologically relevant conditions.1 These measurements are performed on living biofilms in aqueous medium using source and drain electrodes patterned on a glass surface in a specialized configuration referred to as an interdigitated electrode (IDA) array. A biofilm is grown that extends across the gap connecting the source and drain. Potentials are applied to the electrodes (ES and ED) generating a source-drain current (ISD) through the biofilm between the electrodes. The dependency of electrical conductivity on gate potential (the average of the source and drain potentials, EG = [ED + ES]/2) is determined by systematically changing the gate potential and measuring the resulting source-drain current. The dependency of conductivity on gate potential provides mechanistic information about the extracellular electron transport process underlying the electrical conductivity of the specific biofilm under investigation. The electrochemical gating measurement method described here is based directly on that used by M. S. Wrighton2,3 and colleagues and R. W. Murray4,5,6 and colleagues in the 1980&#39;s to investigate thin film conductive polymers.

A protocol for measuring electrical conductivity of living microbial biofilms under physiologically relevant conditions is presented.

Caratterizzazione di trasporto dell'elettrone attraverso biofilm vivente

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

Ricerca

Chimica

Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, &amp; Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces

Electrical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV) measure properties of the electrode-tissue interface without additional invasive procedures, and can be used to monitor electrode performance over the long term. EIS measures electrical impedance at multiple frequencies, and increases in impedance indicate increased glial scar formation around the device, while cyclic voltammetry measures the charge carrying capacity of the electrode, and indicates how charge is transferred at different voltage levels. As implanted electrodes age, EIS and CV data change, and electrode sites that previously recorded spiking neurons often exhibit significantly lower efficacy for neural recording. The application of a brief voltage pulse to implanted electrode arrays, known as rejuvenation, can bring back spiking activity on otherwise silent electrode sites for a period of time. Rejuvenation alters EIS and CV, and can be monitored by these complementary methods. Typically, EIS is measured daily as an indication of the tissue response at the electrode site. If spikes are absent in a channel that previously had spikes, then CV is used to determine the charge carrying capacity of the electrode site, and rejuvenation can be applied to improve the interface efficacy. CV and EIS are then repeated to check the changes at the electrode-tissue interface, and neural recordings are collected. The overall goal of rejuvenation is to extend the functional lifetime of implanted arrays.

Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces

The electrode-tissue interface of neural recording electrodes can be characterized with electrical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV). Application of voltage biasing changes the electrochemical properties of the electrode-tissue interface and can improve recording capability. Voltage biasing, EIS, CV, and neural recordings are complementary.

Tensione di polarizzazione, voltammetria ciclica, e spettroscopia di impedenza elettrica per interfacce neurali

Electrical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV) measure properties of the electrode-tissue interface without additional invasive ...

Neuroscienze

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing per la quantificazione dei Endothelial proliferazione, Barriera funzione e motilità

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Bioingegneria

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

Misurare la tensione indotta a membrana con Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Biologia

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

Eccitazione esterna dei neuroni Usando campi elettrici e magnetici in mono e culture bidimensionali

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Misurazione della extracellulare Ion Flussi Utilizzando il ionoselettivo autoreferenziale microelettrodo Tecnica

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Evaluation of Fluid Overload by Bioelectrical Impedance Vectorial Analysis

Early detection and management of fluid overload are critically important in acute illness, as the impact of therapeutic intervention can result in decreased or increased mortality rates. Accurate fluid status assessment entails appropriate therapy. Unfortunately, as the gold standard method of radioisotopic fluid measurement is costly, time-consuming, and lacks sensitivity in the acute care clinical setting, other less-accurate methods are typically used, such as clinical examination or 24 h output. Bioelectrical impedance vectorial analysis (BIVA) is an alternative impedance-based approach, where the raw parameter resistance and reactance of a subject are plotted to produce a vector, the position of which can be evaluated relative to tolerance intervals in an R-Xc graph. The fluid status is then interpreted as normal or abnormal, based on the distance from the mean vector derived from a healthy reference population. The objective of the present study is to demonstrate how to evaluate the presence of fluid overload through bioelectrical impedance vectorial analysis and the impedance ratio measured with tetrapolar multi-frequency equipment in patients admitted to the emergency department.

In this study, we demonstrate how to evaluate the presence of fluid overload through bioelectrical impedance vectorial analysis (BIVA) and the impedance ratio measured using tetrapolar multi-frequency equipment in patients admitted to the emergency department. BIVA and impedance ratio are reliable and useful tools to predict poor outcomes.

Valutazione del sovraccarico di fluido mediante analisi vettoriale dell'impedenza bioelettrica

Early detection and management of fluid overload are critically important in acute illness, as the impact of therapeutic intervention can result in ...

Medicina

<meta charset="utf8"></head><body> Fabbricazione di elettrodi EMG epimisiaci per modelli preclinici di roditori

Development of a Low-cost Epimysial Electromyography Electrode: A Simplified Workflow for Fabrication and Testing

Electromyography (EMG) is a valuable diagnostic tool for detecting neuromuscular abnormalities. Implantable epimysial electrodes are commonly used to measure EMG signals in preclinical models. Although classical resources exist describing the principles of epimysial electrode fabrication, there is a sparsity of illustrative information translating electrode theory to practice. To remedy this, we provide an updated, easy-to-follow guide on fabricating and testing a low-cost epimysial electrode. 
Electrodes were made by folding and inserting two platinum-iridium foils into a precut silicone base to form the contact surfaces. Next, coated stainless steel wires were welded to each contact surface to form the electrode leads. Lastly, a silicone mixture was used to seal the electrode. Ex vivo testing was conducted to compare our custom-fabricated electrode to an industry standard electrode in a saline bath, where high levels of signal agreement (sine [intraclass correlation - ICC= 0.993], square [ICC = 0.995], triangle [ICC = 0.958]), and temporal-synchrony (sine [r = 0.987], square [r = 0.990], triangle [r= 0.931]) were found across all waveforms. Low levels of electrode impedance were also quantified via electrochemical impedance spectroscopy. 
An in vivo performance assessment was also conducted where the vastus lateralis muscle of a rat was surgically instrumented with the custom-fabricated electrode and signaling was acquired during uphill and downhill walking. As expected, peak EMG activity was significantly lower during downhill walking (0.008 &plusmn; 0.005 mV) than uphill (0.031 &plusmn; 0.180 mV, p = 0.005), supporting the validity of the device. The reliability and biocompatibility of the device were also supported by consistent signaling during level walking at 14 days and 56 days post implantation (0.01 &plusmn; 0.007 mV, 0.012 &plusmn; 0.007 mV respectively; p &gt; 0.05) and the absence of histological inflammation. Collectively, we provide an updated workflow for the fabrication and testing of low-cost epimysial electrodes.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Fabbricazione e test di elettrodi epimisiali negli studi sulle lesioni del LCA

Our purpose was to provide an updated, easy-to-follow guide on the fabrication and testing of epimysial electromyography electrodes. To that end, we provide instructions for material sourcing and a detailed walkthrough of the fabrication and testing process.

Sviluppo di un elettrodo per elettromiografia epimisiale a basso costo: un flusso di lavoro semplificato per la fabbricazione e il collaudo

Electromyography (EMG) is a valuable diagnostic tool for detecting neuromuscular abnormalities. Implantable epimysial electrodes are commonly used to ...

Misura della corrente bioelettrica con una sonda vibrante

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Caratterizzazione di trasporto dell'elettrone attraverso biofilm vivente

Tensione di polarizzazione, voltammetria ciclica, e spettroscopia di impedenza elettrica per interfacce neurali

Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing per la quantificazione dei Endothelial proliferazione, Barriera funzione e motilità

Misurare la tensione indotta a membrana con Di-8-ANEPPS

Eccitazione esterna dei neuroni Usando campi elettrici e magnetici in mono e culture bidimensionali

Misurazione della extracellulare Ion Flussi Utilizzando il ionoselettivo autoreferenziale microelettrodo Tecnica

Valutazione del sovraccarico di fluido mediante analisi vettoriale dell'impedenza bioelettrica

Sviluppo di un elettrodo per elettromiografia epimisiale a basso costo: un flusso di lavoro semplificato per la fabbricazione e il collaudo

Sviluppo di un elettrodo per elettromiografia epimisiale a basso costo: un flusso di lavoro semplificato per la fabbricazione e il collaudo

Sviluppo di un elettrodo per elettromiografia epimisiale a basso costo: un flusso di lavoro semplificato per la fabbricazione e il collaudo