Impianto di innesto vascolare di ingegneria tissutale nell'arteria carotide di topo tramite tecnica della cuffia

Qui, viene presentato un protocollo per l'impianto di un innesto vascolare di ingegneria tissutale nell'arteria carotide di topo utilizzando la tecnica della cuffia, fornendo un modello animale adatto per studiare i meccanismi di rigenerazione del tessuto vascolare.

Lo sviluppo di innesti vascolari di piccolo diametro è stato uno sforzo globale, con numerosi gruppi di ricerca che hanno contribuito a questo campo. La sperimentazione animale svolge un ruolo fondamentale nella valutazione dell'efficacia e della sicurezza degli innesti vascolari, in particolare in assenza di applicazioni cliniche. Rispetto ai modelli animali alternativi, il modello di impianto del topo offre diversi vantaggi, tra cui un background genetico ben definito, un metodo maturo per la costruzione del modello di malattia e una procedura chirurgica semplice. Sulla base di questi vantaggi, il presente studio ha ideato una semplice tecnica di cuffia per l'impianto di innesti vascolari di ingegneria tissutale nell'arteria carotide di topo. Questa tecnica è iniziata con la fabbricazione di innesti vascolari di piccolo diametro in policaprolattone (PCL) mediante filatura elettrostatica, seguita dalla semina di macrofagi sugli innesti attraverso l'adsorbimento per perfusione. Successivamente, gli innesti vascolari di ingegneria tissutale cellularizzata sono stati trapiantati nell'arteria carotide di topo utilizzando la tecnica della cuffia per valutare la pervietà e la capacità rigenerativa. Dopo 30 giorni di impianto in vivo , la pervietà vascolare è risultata soddisfacente, con evidenza di rigenerazione neo-tissutale e la formazione di uno strato endoteliale all'interno del lume degli innesti. Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando software statistici e grafici. Questo studio ha stabilito con successo un modello di impianto dell'arteria carotide di topo che può essere utilizzato per esplorare le fonti cellulari di rigenerazione vascolare e i meccanismi d'azione delle sostanze attive. Inoltre, fornisce supporto teorico per lo sviluppo di nuovi innesti vascolari di piccolo diametro.

La prevalenza e la mortalità delle malattie cardiovascolari sono in aumento a livello globale, rappresentando un notevole problema per la salute pubblica¹. L'innesto di bypass vascolare è un intervento efficace per la malattia coronarica grave e la malattia vascolare periferica². L'uso di innesti vascolari artificiali con diametri superiori a 6 mm è stato ben documentato in ambito clinico. Al contrario, quelli con un diametro inferiore a 6 mm sono inclini alla trombosi e all'iperplasia intimale, che possono portare a un notevole rischio di restenosi³. Nonostante i significativi progressi nella ricerca e nello sviluppo di innesti vascolari di piccolo diametro negli ultimi anni, con diversi prodotti che si avvicinano all'applicazione clinica, rimangono molteplici sfide ^4,5. Questi includono un tasso di pervietà a lungo termine relativamente basso, una rigenerazione vascolare limitata e una comprensione insufficiente del meccanismo di rigenerazione.

La valutazione preclinica di nuovi innesti vascolari di piccolo diametro si basa sull'impianto in vivo in vari modelli animali. I modelli più comunemente usati includono l'arteria carotide di pecora, l'arteria femorale di cane, l'arteria carotide di coniglio e i modelli di impianto dell'arteria addominale di ratto 6,7,8,9. La pervietà degli innesti vascolari può essere valutata in animali di taglia medio-grande, come pecore, suini e cani. Tuttavia, questi studi comportano costi considerevoli a causa delle competenze e delle attrezzature necessarie. Inoltre, la loro complessità tecnica rappresenta una sfida per l'implementazione. Al contrario, i modelli di piccoli animali come conigli e ratti mancano di specie transgeniche ben consolidate con background genetici chiaramente definiti, il che rappresenta un ostacolo significativo nello studio dei meccanismi di rigenerazione vascolare.

Rispetto ai modelli animali sopra citati, il modello murino offre una procedura chirurgica relativamente semplice, una metodologia ben consolidata per la generazione di topi geneticamente modificati e un background genetico chiaramente definito. Tuttavia, il diametro ridotto dei vasi sanguigni di topo rende tecnicamente complessa l'anastomosi end-to-end nell'innesto vascolare, che richiede una notevole esperienza e produce un tasso di successo relativamente basso. Per ridurre la complessità della procedura e migliorare il tasso di successo dell'impianto di innesto vascolare, il presente studio ha impiegato la tecnica della cuffia in un modello di impianto dell'arteria carotide di topo.

Dopo l'impianto in vivo , gli innesti vascolari possono reclutare cellule endogene che contribuiscono alla rigenerazione del tessuto vascolare. La presenza di queste cellule facilita l'endotelizzazione e la rigenerazione dello strato muscolare liscio degli innesti. ¹⁰. Tuttavia, l'origine e il tipo di cellule coinvolte nella rigenerazione del tessuto vascolare rimangono poco chiari e sono in fase di studio diverse teorie concorrenti¹¹. Tra queste, la ricerca si è concentrata sui ruoli delle cellule infiammatorie e delle cellule staminali. Breuer et al. hanno seminato monociti derivati dal midollo osseo umano (hBMC) su innesti vascolari e hanno scoperto che le cellule seminate reclutavano cellule ospiti nella parete dell'innesto attraverso il rilascio della proteina chemioattrattiva dei monociti-1 (MCP-1), promuovendo così la rigenerazione del tessuto vascolare¹². In questo studio, è stato proposto un efficiente metodo di semina cellulare con adsorbimento di perfusione, utilizzato con successo per seminare macrofagi su innesti vascolari di piccolo diametro di policaprolattone (PCL). Dopo l'impianto, queste cellule hanno mostrato una vitalità sostenuta.

Questo articolo descrive in dettaglio la metodologia per la preparazione di innesti vascolari di ingegneria tissutale e la procedura di impianto dell'arteria carotidea nei topi utilizzando la tecnica della cuffia. Il processo inizia con la fabbricazione di innesti vascolari di piccolo diametro PCL con parametri definiti tramite filatura elettrostatica. Successivamente, gli innesti ritenuti idonei all'impianto vengono sottoposti a test meccanici. I macrofagi vengono quindi seminati sugli innesti vascolari utilizzando il metodo dell'adsorbimento di perfusione. Infine, gli innesti vascolari con seme di macrofagi vengono impiantati nell'arteria carotide di topo utilizzando la tecnica della cuffia e la pervietà e le proprietà rigenerative vengono analizzate dopo un mese dall'impianto in vivo .

Questa tecnica ha il potenziale per migliorare l'efficacia e le percentuali di successo dell'innesto vascolare in modelli murini. Inoltre, il modello può essere utilizzato per studiare i meccanismi alla base delle fonti cellulari, dei geni cardine e dei fattori attivi nella rigenerazione vascolare, fornendo supporto teorico e metodologico per la modifica funzionale e lo sviluppo di nuovi innesti vascolari di piccolo diametro.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico per gli Esperimenti sugli Animali dell'Istituto di Medicina delle Radiazioni, Accademia Cinese delle Scienze Mediche, e sono state conformi alle Linee Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6, di 6-8 settimane, con un peso corporeo di 25-30 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Fabbricazione di innesti vascolari di piccolo diametro

NOTA: Fabbricare innesti vascolari PCL di piccolo diametro utilizzando la tecnica dell'elettrofilatura¹³.

1. Preparare soluzioni PCL al 10%, 15% e 20% (p/v) in esafluoroisopropanolo (HFIP) a temperatura ambiente (RT) per 12 ore.
2. Caricare le soluzioni PCL in una siringa da 10 ml e posizionare la siringa con un ago in acciaio inossidabile da 21 G.
3. Posizionare un mandrino in acciaio al tungsteno (0,7 mm di diametro, 20 cm di lunghezza) sullo strumento di raccolta.
4. Fabbricare nove gruppi di innesti vascolari PCL utilizzando la tecnica dell'elettrofilatura. Collegare un alimentatore ad alta tensione all'ago. Posizionare un'asta di acciaio al tungsteno con un diametro interno di 0,7 mm a una distanza fissa davanti all'ago come dispositivo ricevente.
   NOTA: La descrizione dei gruppi di innesti vascolari è fornita nella Tabella 1 e i parametri degli innesti vascolari sono dettagliati nella Tabella 2.
5. Sottoporre gli innesti vascolari fabbricati a un processo di evacuazione. Porre gli innesti vascolari in un forno di essiccazione sottovuoto per 72 ore per rimuovere i solventi residui.
6. Sterilizzare gli innesti immergendoli in alcool medico per 30 minuti ed esponendoli ai raggi UV durante la notte.
7. Osservare la morfologia microscopica degli innesti vascolari utilizzando un microscopio elettronico a scansione (SEM). Fissare gli innesti vascolari allo stadio del campione SEM con adesivo conduttivo e posizionarli nel dispositivo di spruzzatura dell'oro per il rivestimento.
   1. Osservare la struttura e la morfologia delle fibre degli innesti vascolari utilizzando il SEM a una tensione di accelerazione di 15 kV. Misura il diametro delle fibre e la dimensione dei pori dalle immagini SEM (n = 5) utilizzando il software ImageJ.
8. Valutare le proprietà meccaniche (proprietà di trazione ed elasticità) degli innesti vascolari utilizzando una macchina per prove di trazione. Bloccare le estremità superiore e inferiore dell'innesto vascolare con pinze fisse distanziate di 1 cm l'una dall'altra.
   1. Allungare l'innesto vascolare a una velocità di 10 mm/min fino alla rottura. Raccogli la curva sforzo-deformazione dalla macchina per prove di trazione.
   2. Calcola i parametri meccanici, tra cui il carico massimo (2-15 N), la sollecitazione a rottura (5-30 MPa), la deformazione a rottura (200%-1500%) e il modulo elastico (1-20 MPa)¹⁴.
9. Esegui analisi statistiche utilizzando software statistici e grafici. Esprimere i dati come media ± deviazione standard. Analizza e confronta le differenze univariate tra più gruppi utilizzando il test post hoc di Tukey in ANOVA unidirezionale. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

2. Semina di macrofagi su innesti vascolari

NOTA: Assicurarsi che tutte le soluzioni e i materiali siano sterili. Condurre tutte le operazioni all'interno della sala di coltura cellulare.

1. Coltura RAW264.7 (macrofago monocitario di topo) in fiasche in condizioni aderenti (Figura 1A). Preparare il terreno di coltura cellulare utilizzando il terreno di Eagle's modificato (DMEM) completo di Dulbecco, integrato con l'1% di penicillina-streptomicina e il 10% di siero fetale bovino. Porre i matracci in un'incubatrice a 37 °C contenente il 5% di anidride carbonica.
2. Raccogli i macrofagi usando un raschietto cellulare. Eliminare il terreno utilizzando una pipetta da 1 ml e lavare le cellule con PBS.
   1. Aggiungere 2 ml di terreno fresco al pallone di coltura e raschiare delicatamente la superficie con un raschietto cellulare. Trasferire le cellule raccolte in una provetta e centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere 5 × 10⁶ cellule in 100 μl di terreno completo.
3. Posizionare un innesto vascolare di LCP (1 cm di lunghezza) in una provetta da 15 ml riempita con DMEM e centrifugare a 4.000 x g per 5 minuti. Ripetere questo processo più volte fino a quando l'innesto non affonda sul fondo del tubo, garantendo la completa infiltrazione del materiale con DMEM.
4. Preparare una capsula Petri di 10 cm foderata con uno strato di carta da filtro. Posizionare l'innesto vascolare PCL inumidito sulla carta da filtro e arrotolarlo per rimuovere il terreno in eccesso.
5. Prelevare 10 μl della sospensione cellulare utilizzando una pipetta da 10 μl e iniettarla in un'estremità dell'innesto vascolare. Ruotare l'innesto vascolare sulla carta da filtro per facilitare la distribuzione uniforme della sospensione. Iniettare ciascuna estremità cinque volte per un totale di dieci iniezioni (Figura 1B, C).
6. Posizionare l'innesto vascolare caricato con macrofagi in una piastra a 24 pozzetti contenente 1 mL di terreno completo e incubare per 2 ore in un incubatore per colture cellulari prima dell'impianto.
7. Determinare la distribuzione delle cellule all'interno della parete dell'innesto. Incorporare l'innesto vascolare caricato con macrofagi nel composto per tomografia a coerenza ottica (OCT) per la criosezione. Colorare i nuclei cellulari con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e osservare al microscopio a fluorescenza.

3. Modello di impianto dell'arteria carotide di topo

NOTA: Mantenere un'area chirurgica sterile per le procedure sugli animali. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e i prodotti monouso prima dell'intervento chirurgico.

1. Seleziona tre topi maschi sani C57BL/6, ciascuno del peso di 25-30 g. Digiunare i topi il giorno prima dell'intervento. Impiantare un innesto vascolare in ogni animale, per un totale di tre innesti.
2. Costruire le braccia da un tubo di nylon (Figura 2A) e presentare il diagramma schematico della tecnica della cuffia vascolare nella Figura 2B.
3. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico a una concentrazione di 50 mg/kg (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Confermare l'efficacia dell'anestesia garantendo il rilassamento muscolare e una respirazione uniforme. Applicare un unguento oftalmico di vaselina sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
4. Posizionare il mouse in posizione supina sul tavolo operatorio e rimuovere i peli del collo. Sterilizzare l'area chirurgica con iodoforo. Coprire l'area non chirurgica con una garza sterile per mantenere un ambiente sterile (Figura 3A).
5. Usa le forbici oftalmiche per praticare un'incisione sulla linea mediana (1,5-2 cm di lunghezza) dalla mandibola allo sterno. Sollevare le ghiandole salivari sinistre e asportare il muscolo cleidomastoideo sinistro per aumentare il campo visivo chirurgico. Esporre l'arteria carotide comune sinistra utilizzando una micro pinzetta (Figura 3B).
6. Isolare l'arteria carotide sinistra utilizzando una micropinza (Figura 3C).
7. Legare l'arteria carotide in due punti nella porzione centrale utilizzando una sutura 9-0. Sezionare l'arteria tra le due legature usando le microforbici. Far passare il bracciale attraverso le arterie a ciascuna estremità e fissare l'arteria e il bracciale insieme utilizzando clip arteriose (Figura 3D).
8. Ruotare l'arteria verso l'esterno per coprire il corpo della cuffia e fissarla alla cuffia utilizzando una sutura 9-0 con micropinze (Figura 3E).
9. Impiantare un innesto vascolare tra le due estremità dell'arteria carotide facendo scorrere le estremità dell'innesto sulla cuffia dell'arteria e fissandole con suture 9-0 (Figura 3F).
   NOTA: I dati dimensionali della cuffia, dell'arteria carotide e dell'innesto vascolare sono presentati nella Tabella 3. Sebbene i diametri dell'innesto e della cuffia corrispondano strettamente a quelli delle arterie carotidi di topo, esiste una discrepanza tra il diametro del lume anastomotico e il diametro dell'innesto. Il diametro del lume anastomotico viene calcolato sottraendo il doppio dello spessore della parete dell'arteria carotide (0,1 mm) dal diametro interno della cuffia (0,5 mm), ottenendo un diametro del lume di 0,3 mm. L'innesto vascolare ha un diametro interno di 0,7 mm, che porta a una discrepanza di circa 2,3 volte (0,7 mm / 0,3 mm = 2,3).
10. Rimuovere le clip arteriose su entrambe le estremità e irrigare il sito di impianto con soluzione fisiologica. Valutare la pervietà dell'innesto vascolare osservando la pulsazione arteriosa distale (Figura 3G).
11. Riposizionare la ghiandola salivare sinistra e chiudere il sito chirurgico utilizzando suture 6-0 (Figura 3H).

4. Cura e analisi post-procedurale

1. Trasferire il topo in un'incubatrice a 37 °C e monitorare continuamente i suoi segni vitali fino a quando non riprende conoscenza.
2. Iniettare 5 mg/kg di carbinolo per alleviare il dolore postoperatorio.
3. Monitorare il mouse durante il periodo di recupero e non rimetterlo nella stabulazione del gruppo fino a quando non si è completamente ripreso.
4. Anestetizzare i topi un mese dopo l'impianto e raccogliere i campioni di innesto vascolare per l'analisi istologica⁹.
5. Eseguire l'eutanasia tramite asfissia da CO₂ seguita da lussazione cervicale seguendo le linee guida etiche.

Gli innesti vascolari di piccolo diametro con parametri diversi sono stati preparati con successo mediante elettrofilatura. Le immagini SEM hanno rivelato che le fibre erano distribuite uniformemente e mostravano una disposizione irregolare all'interno della parete dell'innesto, con la presenza di strutture porose (Figura 4). All'aumentare della concentrazione di PCL, sono aumentati sia il diametro della fibra che la dimensione dei pori. I valori sp...

L'uso della tecnica della cuffia per l'impianto di innesti vascolari di ingegneria tissutale nell'arteria carotide di topo rappresenta un progresso significativo nella ricerca cardiovascolare¹⁵. Le fasi critiche di questa tecnica includono la semina cellulare e l'impianto dell'innesto. Questo studio ha impiegato un approccio di adsorbimento per perfusione per migliorare la densità di semina dei macrofagi per affrontare i problemi relativi alla semina cellulare no...

Gli autori non hanno interessi finanziari in conflitto.

Il finanziamento per questo studio è stato fornito dai progetti della National Natural Science Foundation of China (n. 32101098, 32071356 e 82272158) e dal CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (n. 2022-I2M-1-023).