Impianto di dispositivi per elettroencefalogramma ed elettrocardiogramma in kit di coniglio neonatale

I meccanismi della morte improvvisa e inaspettata nell'epilessia (SUDEP) sono poco compresi e difficili da tradurre dai modelli attuali. I conigli transgenici possono offrire informazioni su questi meccanismi. Descriviamo un metodo per registrazioni elettroencefalografiche ed elettrocardiografiche continue a lungo termine in kit di coniglio transgenico per valutare eventi gravi che possono portare alla morte.

Le varianti patogene nei geni dei canali ionici sono associate a un alto tasso di morte improvvisa inaspettata nell'epilessia (SUDEP). I meccanismi della SUDEP sono poco conosciuti, ma possono coinvolgere disfunzione autonomica e aritmie cardiache oltre alle convulsioni. Alcuni geni dei canali ionici sono espressi sia nel cervello che nel cuore, aumentando potenzialmente il rischio di SUDEP nei pazienti con canalopatie ioniche associate a epilessia e aritmie cardiache. I conigli transgenici che esprimono varianti dell'epilessia forniscono un intero organismo per studiare la complessa fisiologia della SUDEP. È importante sottolineare che i conigli replicano più da vicino la fisiologia cardiaca umana rispetto ai modelli murini. Tuttavia, i modelli di coniglio devono tenere conto di ulteriori considerazioni sulla salute e sull'anestesia quando vengono sottoposti a procedure di monitoraggio invasive. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per impiantare chirurgicamente un dispositivo di telemetria per il monitoraggio simultaneo a lungo termine dell'elettroencefalogramma (EEG) e dell'elettrocardiogramma (ECG) nei kit di conigli neonatali. Qui, dimostriamo i metodi chirurgici per impiantare un dispositivo di telemetria in kit P14 (intervallo di peso 175-250 g) con un'attenzione dettagliata all'approccio chirurgico, all'anestesia e al monitoraggio appropriati e alle cure postoperatorie, con conseguente basso tasso di complicanze. Questo metodo consente il monitoraggio continuo dell'elettrofisiologia neurale e cardiaca durante i punti critici dello sviluppo di aritmie cardiache, convulsioni e potenziali SUDEP in modelli di coniglio di epilessie genetiche o acquisite.

La morte improvvisa e inaspettata nell'epilessia (SUDEP) è una delle principali cause di morte nei pazienti con epilessia. I meccanismi della SUDEP sono poco conosciuti, ma potenzialmente coinvolgono disfunzione autonomica, apnea e aritmie cardiache oltre alle convulsioni 1,2,3,4,5,6,7. I pazienti con epilessie genetiche legate alla canalopatia hanno tra i più alti tassi di SUDEP. Ad esempio, la SUDEP si verifica fino al 20% dei pazienti con varianti nel gene del canale del sodio voltaggio-dipendente SCN1A⁸, il gene responsabile della sindrome di Dravet, un'epilessia genetica con esordio nel primo anno di vita. Molti geni dei canali ionici legati all'epilessia sono espressi sia nel cervello che nel cuore, con dati di laboratorio e clinici che suggeriscono che le aritmie cardiache possono essere presenti nei pazienti con epilessie genetiche legate alla canalopatia^{7, 9,10,11,12}, aumentando potenzialmente il loro rischio di SUDEP a causa di un'aritmia cardiaca fatale indotta da convulsioni o dell'insorgenza simultanea di convulsioni e aritmie. La valutazione della SUDEP in laboratorio pone numerose sfide. Da un punto di vista cardiaco, i potenziali d'azione cardiaci nei topi sono molto diversi da quelli nell'uomo¹³ e i modelli di iPSC-miociti cardiaci umani¹⁴ non possono replicare le complessità dell'intero organismo. I modelli transgenici di epilessie genetiche di coniglio forniscono un sistema ideale per studiare la SUDEP, poiché la fisiologia cardiaca del coniglio replica più da vicino quella dell'uomo^13,15, fornendo al contempo un intero organismo per studiare la fisiopatologia complessa. Poiché la SUDEP può verificarsi già dalla prima crisi, la valutazione di questi modelli animali da un punto temporale precoce è essenziale per comprendere l'insorgenza sia delle convulsioni che delle aritmie cardiache. La registrazione video durante il periodo neonatale è impegnativa, poiché i cuccioli di coniglio sono spesso ancora nel nido. La registrazione continua dell'elettroencefalogramma (EEG) o dell'elettrocardiogramma (ECG) con un sistema cablato tradizionale non è possibile mentre i kit sono con la diga. È improbabile che la registrazione intermittente catturi eventi rari e terminali associati a SUDEP. Ci siamo quindi rivolti al monitoraggio della telemetria impiantabile wireless per fornire registrazioni EEG ed ECG a lungo termine, continue e simultanee nei kit di conigli.

Le chiavi del successo di questo protocollo sono l'anestesia appropriata e il supporto postoperatorio per questi animali vulnerabili. I conigli sono a un rischio molto più elevato di morte per anestesia (1,39%-4,8%) rispetto a cani e gatti (0,17%-0,24%) a causa di caratteristiche anatomiche e fisiologiche uniche^16,17. I principali fattori che contribuiscono a questo aumento del rischio anestetico includono una gestione non ottimale delle vie aeree e complicanze postoperatorie acute. Molteplici fattori contribuiscono alla difficoltà dell'intubazione nei conigli, tra cui una bocca lunga e stretta con una lingua larga, un angolo acuto tra la bocca e la laringe, lo spostamento dorsale dell'epiglottide, l'aumento della suscettibilità al trauma laringeo e l'aumento della propensione al laringospasmo 18,19,20. Dopo l'episodio di anestesia immediata, i conigli sono a rischio di sviluppare una sindrome da stasi gastrointestinale pericolosa per la vita. Si tratta di un problema complesso e multifattoriale e si ipotizza che l'anestesia contribuisca attraverso effetti diretti del farmaco che inibiscono la motilità gastrica e/o l'anoressia secondaria post-procedurale per qualsiasi motivo (dolore non alleviato, nausea, ecc.)²¹.

La fisiologia unica dei neonati e dei neonati di coniglio aggrava le sfide associate all'anestesia e alla chirurgia. I conigli hanno giovani nati altriciali con meccanismi sottosviluppati per l'omeostasi fisiologica e speciali considerazioni anatomiche. L'accesso e il monitoraggio endovenoso sono difficili poiché la maggior parte dei prodotti commerciali non è ottimizzata per le piccole dimensioni vascolari, l'elevata frequenza cardiaca a riposo e la pelle pigmentata dei kit di conigli incrociati con cintura olandese e neozelandese. Poiché la gittata cardiaca è essenzialmente dipendente dalla frequenza cardiaca nei neonati²² e, in generale, la clearance del farmaco per via renale o epatica è ridotta rispetto agli adulti²³, le considerazioni per la selezione e il dosaggio appropriati dei farmaci sono fondamentali. Si ritiene che la causa principale della morte per anestesia nei conigli sia secondaria alla depressione respiratoria e all'apnea. Oltre ai problemi di gestione delle vie aeree già discussi per tutti i conigli, i neonati hanno una spinta respiratoria depressa di fronte all'ipossiemia e all'ipercapnia, rendendo più rischioso questo aspetto già impegnativo dell'anestesia²⁴.

In questo protocollo, descriviamo un metodo di successo per l'impianto di telemetria EEG ed ECG (Figura 1) in un modello di epilessia neonatale di coniglio con un alto tasso di sopravvivenza chirurgica e anestesiologica. Queste informazioni consentiranno ad altri ricercatori di affrontare modelli di coniglio neonatale impegnativi per far progredire la ricerca sull'epilessia, l'aritmia cardiaca e i disturbi dello sviluppo neurologico correlati.

Tutto il lavoro descritto è stato esaminato e approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Michigan come parte di un protocollo di utilizzo degli animali approvato ed è in linea con le leggi e le linee guida federali pertinenti, tra cui l'USDA Animal Welfare Act e la politica del servizio sanitario pubblico NIH. L'Università del Michigan è un'istituzione accreditata AAALACi.

1. Preparazione degli animali

1. Kit per la rasatura grossolana (età P14-P19, peso >175 g) 1-2 giorni prima della procedura per ridurre al minimo il tempo di anestesia il giorno dell'intervento utilizzando le tosatrici.
2. Sterilizzare in autoclave o a gas tutti gli strumenti e i materiali chirurgici (per quanto possibile) in preparazione alla procedura.
3. Indurre l'anestesia con ketamina (10 mg/kg IM), buprenorfina HCl (0,01 mg/kg IM) 0,3 mg/mL diluito a 0,03 mg/mL e sevoflurano e ossigeno tramite maschera anestesia utilizzando un circuito non respiratorio.
4. Posizionare un catetere endovenoso (IV) da 26 G 3/4" nella vena auricolare (preferibile) o nella vena cefalica e sciacquare con soluzione fisiologica eparinizzata 10 unità/mL.
5. Radere l'addome, il petto, la schiena, il collo e la testa il più vicino possibile alla pelle utilizzando una lama #40 o #50.
6. Applicare un unguento oftalmico lubrificante non medicato per prevenire l'ulcerazione corneale.
7. Somministrare analgesici (carprofene 4 mg/kg SQ - diluito a 25 mg/mL) e antibiotici perioperatori (cefazolina 20 mg/kg EV diluita a 50 mg/mL). Risomministrare gli antibiotici ogni 90-180 minuti di tempo chirurgico.

2. Preparazione chirurgica (Figura 2)

1. Trasferire il kit anestetizzato sul tavolo operatorio e posizionarlo supino su un termoforo a infrarossi comandato tramite un termometro rettale.
2. Posizionare il naso e la bocca in una maschera facciale stampata in 3D personalizzata collegata con un connettore girevole a un circuito Jackson-Rees non respiratorio (sacca da 0,5 L) e mantenere l'anestesia con sevoflurano (1,5%-7% per effetto) con flusso di ossigeno a 2 L/min.
3. Mantenere l'anestesia con sevoflurano e monitorare la profondità dell'anestesia con un pulsossimetro sull'orecchio o sulla zampa e/o un Doppler sull'arteria femorale o direttamente sul cuore.
4. Regolare l'anestesia durante la procedura per mantenere la frequenza cardiaca (FC) tra 180 e 260, la saturazione di ossigeno >85% e la frequenza respiratoria tra 10 e 50 respiri al minuto (visualizzazione diretta delle escursioni o del movimento della sacca di respirazione).
   NOTA: Avere a disposizione farmaci di emergenza (glicopirrolato, epinefrina, doxapram).
5. Fissare il kit alla maschera facciale fissando delicatamente gli arti anteriori alla maschera.
6. Posizionare il kit in una posizione leggermente laterale destra fissando senza stringere la zampa posteriore sinistra al tavolo operatorio.
7. Preparare tutto l'addome con uno scrub chirurgico riscaldato alternando betadina e soluzione fisiologica sterile.
   NOTA: Se lo si desidera, è possibile utilizzare una soluzione chirurgica aggiuntiva per completare lo scrub. Il chirurgo, che indossa camici dedicati, cuffie per capelli e copriscarpe, strofina asetticamente e indossa camice e guanti sterili per eseguire la procedura in condizioni sterili.
8. Posiziona gli asciugamani chirurgici adesivi su entrambi i lati del kit e coprilo con un grande telo chirurgico. Praticare un foro di dimensioni adeguate per esporre l'addome e il torace.
9. Aprire l'impianto sul campo chirurgico e posizionare le suture di ancoraggio non assorbibili in ciascuno dei fori di ancoraggio dell'impianto. Lasciare la sutura attaccata con una coda di 5-6 cm (Figura 3A). Posizionare l'impianto in una ciotola di soluzione fisiologica sterile riscaldata.

3. Posizionamento dell'impianto nell'addome

1. Dopo aver assicurato un'adeguata anestesia, praticare un'incisione di 3 cm attraverso la pelle lungo la linea alba con un bisturi.
2. Praticare un'attenta incisione attraverso il muscolo per aprire la cavità peritoneale.
3. Posizionare l'impianto nella porzione cranica della cavità addominale e posizionarlo a sinistra dell'incisione.
4. Utilizzare un trocar per incanalare il filo ECG negativo fuori dalla cavità peritoneale e dalla pelle a circa 2 cm a destra dell'incisione. Scavare i restanti 3 fili a 3-4 cm a sinistra dell'incisione per consentire all'impianto di sedersi comodamente all'interno della cavità peritoneale.
5. Fissare l'impianto con le suture di ancoraggio alla parete ventrale della cavità peritoneale, assicurandosi che non vi sia intrappolamento intestinale (Figura 3B).
6. Chiudere la parete addominale con una sutura riassorbibile in modo continuo.
7. Chiudere l'incisione cutanea con una sutura non assorbibile secondo uno schema interrotto.

4. Posizionamento delle derivazioni ECG

1. Tunnellare l'elettrocatetere ECG negativo per via sottocutanea fino alla parte superiore destra del torace a livello della prima costola.
2. Sezionare senza mezzi termini una tasca sottocutanea per avvolgere liberamente circa 10 cm di filo.
   NOTA: Le bobine strette sotto la pelle possono causare l'erosione della pelle e l'esposizione del filo.
3. Tagliare il filo in eccesso e creare un cappio con il filo esposto legando l'estremità al filo isolato con una sutura non assorbibile.
4. Fissare l'anello al muscolo con 2 punti di sutura non assorbibili.
5. Chiudere il muscolo peritoneale a destra attorno al filo con 1-2 suture riassorbibili in uno schema interrotto.
6. Chiudere la pelle nella parte superiore destra del torace e nell'addome destro con 2-3 punti di sutura non assorbibili in uno schema interrotto.
7. Scavare il tunnel dell'elettrocatetere ECG positivo fino alla costola inferiore sinistra e ripetere i passaggi precedenti per fissarlo al muscolo e chiudere l'incisione.
8. Tunnel: l'EEG conduce per via sottocutanea al lato sinistro il più lontano possibile in campo chirurgico.
9. Aggiungere 1 sutura assorbibile al muscolo peritoneale a sinistra attorno ai fili emergenti. Chiudere la pelle con una sutura non assorbibile in uno schema interrotto.
10. Avvolgere i fili EEG esposti con un foglio di alluminio sterile.

5. Preparazione della superficie dorsale

1. Un assistente non sterile rimuoverà quindi il telo sterile e la cravatta per le gambe.
2. Ruotare il kit in posizione prona (Figura 2B) assicurandosi che la maschera facciale rimanga saldamente in posizione ruotandola utilizzando il connettore girevole tra la maschera facciale e il circuito. Regolare i monitor pulse-ox e/o doppler secondo necessità per garantire un monitoraggio continuo dell'anestesia.
3. Preparare il campo chirurgico con uno scrub betadine per includere la testa, il collo e l'intera schiena con cura per strofinare intorno alla regione dei fili in uscita sul lato sinistro.
4. Il chirurgo posizionerà quindi un asciugamano adesivo sterile sotto il lato sinistro mentre il pacchetto di fili di alluminio è tenuto da un assistente non sterile.
5. Rimuovere sterilemente e delicatamente i fili dalla confezione di alluminio e posizionarli sul campo sterile. Termina il drappeggio con asciugamani sterili.
6. Coprire con un telo sterile e tagliare una finestra abbastanza grande da esporre l'intero campo sterile.

6. Posizionamento delle derivazioni EEG

1. Fai un'incisione di 3 cm attraverso il cuoio capelluto sulla linea mediana per esporre il cranio.
2. Utilizzare un trocar per incanalare sottocutaneamente le derivazioni EEG dal lato sinistro al cranio.
3. Pulire e raschiare il periostio dalle ossa parietali esposte utilizzando un bisturi.
4. Inserire un trapano portatile in una copertura sterile per ultrasuoni. Inserire una fresa da 1,0 mm nel trapano.
5. Praticare dei fori bilaterali nelle ossa parietali a circa 0,5 cm anteriormente alla lambda e 0,5 cm lateralmente alla sutura sagittale.
   NOTA: Prestare attenzione alla quantità di pressione esercitata sul cranio dorsale in quanto ciò può occludere le vie aeree ventrali, quindi il monitoraggio respiratorio è fondamentale a questo punto della procedura. Un calo costante o significativo della frequenza cardiaca può indicare un'occlusione respiratoria (bradicardia secondaria all'apnea) e dovrebbe richiedere una valutazione e un'azione immediate.
6. Usa una pinza fine per posizionare una vite nel foro della fresa. Utilizzare il cacciavite per inserirlo approssimativamente a metà (Figura 3C).
7. Sezionare senza mezzi termini una tasca sottocutanea lungo la parte posteriore del collo per avvolgere liberamente circa 10 cm di filo.
8. Tagliare il filo in eccesso. Spellare l'isolamento dalla punta e allungare il filo.
9. Crea un anello all'estremità del filo esposto facendo un nodo, mantenendo un piccolo anello. Posizionare l'anello sopra la vite e serrare la vite al cranio, assicurandosi che il filo tocchi la vite. Posizionare il cavo di terra a sinistra e il cavo di registrazione a destra.
10. Valuta la fedeltà dei segnali di telemetria sul software di analisi una volta che tutti i cavi sono in posizione. Il segnale EEG apparirà a bassa ampiezza mentre il kit è sedato.
11. Fissare le viti e i fili al cranio con acrilico dentale e lasciarlo indurire completamente.
12. Chiudere la pelle con una sutura non assorbibile sulla testa e sul fianco sinistro.
13. Iniettare bupivacaina (dose massima di 2 mg/kg di 5 mg/mL diluita a 2,5 mg/mL) per via sottocutanea ad ogni incisione. Coprire ogni incisione con una piccola quantità di colla per la pelle somministrata utilizzando una siringa di tubercolina.

7. Recupero dell'anestesia

1. Spegnere l'anestesia con sevoflurano e fornire solo ossigeno per almeno 5 minuti rimuovendo il nastro rimanente, il drappeggio e il monitoraggio dell'anestesia.
2. Controllare i livelli di glucosio nel sangue utilizzando un glucometro e somministrare liquidi sottocutanei riscaldati al 10% del peso corporeo (kg).
3. Una volta che l'animale è reattivo a uno stimolo doloroso (pizzicamento delle dita), spostarlo in un'incubatrice di recupero impostata a 37-38 °C.
   NOTA: Spesso, la temperatura del kit scende significativamente durante questo trasferimento. Potrebbe essere utile riportare il kit nel termoforo a infrarossi con biofeedback o fornire ulteriore calore supplementare.
4. Monitora visivamente in modo continuo e registra la temperatura rettale, le letture del pulsossimetro, la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria ogni 10-15 minuti.
5. Una volta che l'animale è costantemente deambulante e vigile, rimuovere il catetere endovenoso e applicare pressione sul sito fino a quando l'emorragia non si ferma.

8. Assistenza e monitoraggio postoperatorio

1. Restituisci il kit alla diga e ai compagni di cucciolata. Assicurarsi che il materiale di nidificazione e la nutrizione supplementare (Tabella dei materiali) siano disponibili nella gabbia per facilitare la termoregolazione e il recupero.
2. Controlla il kit ogni giorno per 7-10 giorni dopo l'intervento, pesandolo quotidianamente e fornendo una nutrizione supplementare nella gabbia.
3. Per i primi 2 giorni dopo il recupero (D1 e D2), somministrare ulteriori analgesici ogni 24 ore (carprofene 4 mg/kg SQ - diluito a 5 mg/mL) e liquidi sottocutanei (5-7 mL).
4. Per i primi 3 giorni dopo il recupero (D1, D2 e D3), controllare il kit due volte al giorno, valutando l'evidenza di dolore, deambulazione, aspetto incisionale e idratazione. Una volta al giorno durante questo periodo di tempo, misurare la temperatura del kit per garantire l'assenza di segni di infezione e un'adeguata termoregolazione.
5. Rimuovere i punti di sutura se le incisioni guariscono in modo appropriato a 7-10 giorni.

Il successo di questo progetto ha richiesto lo sviluppo di molteplici parametri nella procedura di impianto e nel protocollo di registrazione. La chirurgia implantare è stata tentata o eseguita su 16 kit di conigli, di cui 14 sono sopravvissuti con successo alla procedura. Di questi, 12 sono sopravvissuti fino al punto finale sperimentale. Le ragioni della morte intraoperatoria o postoperatoria sono evidenziate nella Tabella 1, insieme alle modifiche della procedura che...

Il protocollo descritto per l'induzione, il monitoraggio e il supporto dell'anestesia bilancia le esigenze di ricerca per l'approccio chirurgico e la facilità con gli standard di riferimento delle cure veterinarie. Prima che il laboratorio adottasse il protocollo descritto come procedura standard, sono stati sperimentati diversi altri potenziali perfezionamenti, tra cui il posizionamento di un impianto sottocutaneo dorsale, l'uso di un tubo endotracheale o di una maschera laringea per l...

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli autori sono grati per il finanziamento da parte del NIH R61NS130070 a LLI.