Generazione di una linea cellulare RIP1 knockout U937 utilizzando il sistema CRISPR-Cas9

Man mano che i protocolli relativi a CRISPR diventano sempre più utili e accessibili, possono ancora sorgere complicazioni e ostacoli in specifiche condizioni sperimentali. Questo protocollo delinea la creazione di una linea cellulare umana knockout per serina/treonina-proteina chinasi 1 (RIPK1/RIP1) che interagisce con il recettore utilizzando CRISPR/Cas9 ed evidenzia le potenziali sfide incontrate durante questo processo.

Questo protocollo delinea una procedura per eliminare il gene RIP1 utilizzando CRISPR/Cas9 nella linea cellulare di monociti umani U937. Il metodo utilizza plasmidi di RNA guida designati e plasmidi di confezionamento lentivirale per ottenere il knockout del gene RIP1. Il protocollo affronta le sfide e i miglioramenti dei metodi CRISPR tradizionali, consentendone la replicazione per futuri studi sulla morte cellulare. Le cellule mutanti risultanti possono essere utilizzate per studiare i cambiamenti meccanicistici nella morte cellulare, dove le proteine funzionali RIP1 svolgerebbero altrimenti un ruolo. I saggi di vitalità hanno dimostrato una significativa riduzione della morte cellulare nelle cellule knockout in seguito all'induzione della necroptosi. La microscopia a fluorescenza ha rivelato una marcata diminuzione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) mitocondriali nelle cellule knockout nelle stesse condizioni. Insieme, questi saggi funzionali confermano la perdita della proteina RIP1. Ottimizzata per l'uso con monociti umani U937, questa procedura può anche essere adattata per colpire altri regolatori chiave della morte cellulare, producendo mutanti funzionali e non letali. Le potenziali insidie vengono affrontate in tutto il percorso per fornire informazioni sulle sfide che possono sorgere durante la generazione dei mutanti.

L'uso della tecnologia di editing genetico CRISPR/Cas9 si è evoluto rapidamente dalla sua scoperta ^1,2,3. La capacità di knock-in o knockout di geni all'interno di linee cellulari o batteri è inestimabile per far progredire la ricerca e la comprensione dei meccanismi intracellulari 1,2,3,4,5,6. Il sistema CRISPR-Cas9 migliora i precedenti metodi di editing genetico, come la nucleasi effettrice simile all'attivatore della trascrizione (TALEN), semplificando l'ingegnerizzazione della specificità genica. Questa procedura include due componenti fondamentali: l'RNA guida (gRNA) utilizzato per localizzare il bersaglio genico previsto e Cas9, che è un'endonucleasi che modifica la posizione del genoma prevista con una rottura del DNA a doppio filamento ^3,4. Il gRNA fungerà da guida per l'endonucleasi Cas9 per localizzare e avviare la rottura a doppio filamento nella sequenza genetica prevista attraverso l'appaiamento di basi Watson-Crick. L'intero processo di editing del genoma da parte del sistema CRISPR/Cas9 coinvolge il macchinario cellulare che ripara queste rotture a doppio filamento nel DNA attraverso l'unione di estremità non omologa (NHEJ) o la ricombinazione omologa ^3,7. È più probabile che si verifichi NHEJ, creando efficacemente una mutazione nel genoma che si traduce in una perdita di espressione per il gene bersaglio ^3,4.

Le fonti commerciali sono state in grado di creare librerie di bersagli di gRNA che possono essere espressi attraverso la crescita batterica e l'isolamento, il che migliora significativamente la loro facilità d'uso. Tuttavia, il principale limite del sistema CRISPR/Cas9 è la difficoltà di veicolare il gRNA e il complesso Cas9 nelle linee cellulari bersaglio. Queste limitazioni insorgono nelle linee cellulari in sospensione, poiché sono generalmente indicate come⁸ difficili da trasfettare. I metodi di trasfezione tipici non sono generalmente efficienti nel fornire il sistema CRISPR/Cas9 in cellule di sospensione, motivo per cui i metodi di somministrazione virale come la trasfezione e la trasduzione lentivirale sono più adatti per questo tipo di linea cellulare ^8,9.

Questo tipo di trasfezione richiede un vettore lentivirale che codifica il gRNA e l'endonucleasi Cas9 insieme all'aggiunta di plasmidi di imballaggio lentivirale, che vengono trasfettati in una linea cellulare in grado di produrre particelle lentivirali. Una linea cellulare tipicamente scelta per questo processo è HEK293T cellule, in quanto sono più facili da trasfettare e lavorano in modo molto efficiente nell'assemblaggio di gRNA e Cas9 ^9,10. Queste particelle vengono quindi rilasciate come lentivirus nel surnatante, che può essere utilizzato per trasdurre il gRNA e Cas9 nella linea cellulare di sospensione prevista, come i monociti umani U937. Pertanto, la procedura qui descritta presenta le seguenti modifiche rispetto ai metodi consolidati: (1) Metodo di trasfezione alternativo per linee cellulari difficili da trasfettare; (2) Non è necessario concentrare il DNA plasmidico CRISPR o utilizzare l'ultracentrifuga; e (3) Elimina la necessità di clonazione di singole cellule.

L'obiettivo diretto di questo articolo è stato quello di eliminare il gene RIP1 nei monociti umani U937. La forma canonica della necroptosi della via di morte cellulare altamente infiammatoria è controllata da RIP1, che funge da bersaglio fondamentale per gli studi sulla morte cellulare. 11,12,13,14 Quando RIP1 diventa attivo attraverso l'autofosforilazione, recluta e provoca la fosforilazione diretta e l'attivazione della serina/treonina-proteina chinasi 3 (RIPK3/RIP3) che interagisce con il recettore e della pseudochinasi MLKL (Mixed Lineage Kinase Domain-Like) per formare il necrosoma. A seguito di questa formazione, il necrosoma è libero di muoversi all'interno della cellula per interagire con organelli come i mitocondri^12,13. A livello dei mitocondri, RIP1 potenzia un ciclo di feedback positivo con il metabolismo cellulare, influenzando direttamente la produzione di ROS mitocondriali, che a sua volta promuove un'ulteriore autofosforilazione di RIP1, la formazione di necrosomi e l'esecuzione a valle della necroptosi 11,12,13,14.

Mentre l'obiettivo dell'attuale gruppo di ricerca è il ruolo di RIP1 nella morte cellulare, altri motivi per studiare RIP1 includono i suoi ruoli nell'infiammazione e nell'infezione. Dopo l'attivazione da parte di recettori di morte come i recettori del TNF, RIP1 promuove l'attivazione della via di segnalazione NF-κB, che innesca la trascrizione di citochine pro-infiammatorie, chemochine e altre molecole essenziali per il reclutamento delle cellule immunitarie e l'amplificazione della risposta infiammatoria¹⁵. Oltre all'attivazione di NF-κB, RIPK1 può anche coinvolgere le vie di segnalazione MAPK, migliorando ulteriormente l'infiammazione^15,16. Per quanto riguarda il suo ruolo nelle risposte all'infezione, RIP1 agisce come mediatore fondamentale della risposta infiammatoria dell'ospite, in particolare in risposta a pattern molecolari associati a patogeni (PAMP) riconosciuti dai recettori di riconoscimento dei pattern (PRR) come i recettori Toll-like (TLR)¹⁷. Inoltre, durante la sepsi, RIP1 viene attivato dalla segnalazione attraverso i recettori di morte come il recettore del TNF, portando all'inizio di cascate pro-infiammatorie. RIPK1 media l'attivazione delle vie NF-κB e MAPK, promuovendo la produzione di citochine pro-infiammatorie come TNF-α, IL-1β e IL-6, che sono fattori chiave della risposta infiammatoria sistemica caratteristica della sepsi¹⁸.

Una rappresentazione schematica della procedura è fornita nella Figura 1. L'RNA guida (gRNA) e la sequenza target sono riportati nella Tabella 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Raccolta di CRISPR gRNA vettore di espressione lentivirale CRISPR contenente l'endonucleasi Cas9 e la resistenza alla puromicina da Escherichia coli

1. E. coli striato a quadrante che ospita il gRNA del vettore lentiviralesu piastre di agar LB integrate con 100 μg/mL di ampicillina.
2. Incubare le piastre a 37°C per 1-2 giorni fino a quando le singole colonie sono visibili nell'area più diluita della piastra.
3. Selezionare una singola colonia con ansa sterile e aggiungere individualmente ciascuna colonia a 5 ml di brodo LB integrato con 100 μg/mL di ampicillina in una provetta conica da 50 mL. Assicurarsi di pipettare accuratamente su e giù dopo aver aggiunto la singola colonia per garantire l'omogeneizzazione.
4. Sfiatare e fissare con nastro adesivo il tappo della provetta conica da 50 mL e incubare in un agitatore orbitale a 37°C e 225 giri/min per 8 ore.
5. Durante l'incubazione di 8 ore a 37°C, aggiungere 40 mL di brodo LB integrato con 100 μg/mL di ampicillina a ciascuna delle quattro provette coniche separate da 50 mL.
6. Dopo l'incubazione di 8 ore a 37°C, prelevare 40 μL di E cresciuto.coli e aggiungerlo a tutte e quattro le provette coniche da 50 mL.
7. Sfiatare e fissare con nastro adesivo i tappi delle provette coniche da 50 mL e incubarle in un agitatore orbitale a 37°C e 225 giri/min per 12-16 ore.
8. Dopo questa incubazione a 37°C, centrifugare tutte le provette a 3220 x g in un rotore a secchiello oscillante per 20 minuti per pellettare i batteri E. coli cresciuti.
9. Decantare i surnatanti in un becher di scarto, quindi unire tutti e quattro i pellet in 10 ml di brodo LB integrato con 100 μg/mL di ampicillina.
10. Centrifuga di nuovo i pellet combinati alla massima velocità in un rotore a secchio oscillante per 20 minuti per ottenere un pellet singolare.
11. Scartare la maggior parte possibile dei surnatanti nel becher di scarto e procedere con una delle seguenti opzioni: (1) Congelare il pellet umido a -80° per un massimo di 1 mese. (2) Procedere con la purificazione del plasmide vettore lentivirale.
    NOTA: Se si sceglie l'opzione 1, il protocollo potrebbe essere messo in pausa qui.

2. Trasfezione di cellule HEK293T con vettore di espressione lentivirale CRISPR gRNA purificato che ha come bersaglio RIP1

1. Seminare HEK293T cellule per una notte a una concentrazione di 3 × 10-6-5 × 10⁶ cellule in una piastra di 10 cm contenente DMEM con 4,5 g/L di D-glucosio, L-glutammina, 110 mg/L di piruvato di sodio e il 10% di FBS inattivato termicamente.
2. Il giorno seguente, assicurati che le piastre abbiano una confluenza di circa il 70%-90%, quindi procedi con il protocollo.
3. Impostare la trasfezione delle cellule con un rapporto 1:1:1:1 di plasmidi (plasmide CRISPR sperimentale: pLP1: pLP2: pLP/VSVG) utilizzando il reagente di trasfezione in un rapporto 3:1 (3 parti di reagente: 1 parte di DNA plasmidico), insieme a un terreno sierico ridotto.
   NOTA: La porzione pLP1: pLP2: pLP/VSVG del rapporto è una miscela di confezionamento lentivirale.
   1. Equilibrare il reagente di trasfezione, il terreno sierico ridotto, il DNA plasmidico CRISPR e la miscela di confezionamento lentivirale a temperatura ambiente prima di impostare la trasfezione.
   2. Miscelare insieme 75 μl di reagente di trasfezione, 2500 μl di terreno sierico ridotto e 25 μg di DNA totale (calcolo basato sull'analisi spettrofotometrica per il DNA plasmidico CRISPR e il rapporto 1:1:1:1 con la miscela di confezionamento lentivirale).
   3. Lasciare incubare questa miscela a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Pipettare con cura l'intero volume di questa miscela nella piastra cellulare HEK293T confluente direttamente nel terreno (non è necessario cambiare il terreno).
4. Agitare delicatamente la piastra per garantire un'adeguata omogeneizzazione della miscela di trasfezione e del terreno di coltura della piastra. Incubare la piastra a 37 °C per 48 ore.

3. Trasduzione lentivirale di cellule U937 o cellule bersaglio

1. Una volta completata l'incubazione di 48 ore a 37 ^°C , trasferire il terreno dalla piastra cellulare del produttore HEK293T in una provetta conica da 15 mL.
2. Centrifugare il volume a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettare eventuali celle HEK293T rimanenti. Rimuovere tutto il surnatante contenente virus, facendo attenzione a non disturbare le cellule HEK293T pellettate, e conservarlo in una provetta conica separata da 15 mL. Quindi, decontaminare e gettare il tubo contenente pellet nell'apposito contenitore per rifiuti a rischio biologico.
   NOTA: I surnatanti del lentivirus a base di HIV possono essere conservati a -80°C; Tuttavia, ciò comporta il rischio di una perdita di stabilità del virus fino al 55% dopo il primo ciclo di congelamento/disgelo¹⁹.
3. Contare e ottenere un pellet di 2 × 10⁶ cellule U937 in una provetta conica da 15 mL centrifugando un volume appropriato a 400 x g per 10 minuti a temperatura ambiente e decantare il surnatante, lasciando il pellet di cellule nella provetta.
4. Risospendere il pellet di cellule U937 con tutto il surnatante contenente virus e quindi centrifugare la provetta a 290 x g per 60 minuti.
5. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta per risospendere il pellet con il surnatante contenente il virus già nella provetta.
6. Posizionare il tubo su un rotatore end-over-end (o un dispositivo rotante simile) per 60 minuti.
   1. Dopo questa incubazione, centrifugare le provette a 400 x g per 10 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule.
   2. Risospendere il pellet cellulare con una miscela di terreni con rapporto 1:1 di surnatanti contenenti virus e terreni RPMI-1640 completi integrati con FBS inattivato a caldo al 10%.
7. Trasferire la miscela di cellule in una piastra di coltura tissutale di 10 cm e incubare a 37°C per 48 ore.
8. Dopo questa incubazione, centrifugare le cellule U937 a 400 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
   1. Risospendere il pellet con un terreno RPMI-1640 completo integrato con il 10% di FBS inattivato a caldo e 5 μg/mL di puromicina e trasferire le cellule in un pallone T25.
   2. Incubare le cellule a 37 °C intatte per 2-3 settimane, assicurandosi di controllarle ogni 1-2 giorni per rilevare eventuali segni di crescita cellulare.
      NOTA: Una volta che le cellule diventano confluenti e hanno un tempo di turnover sano dopo un passaggio iniziale, possono essere testate per l'efficacia del protocollo completato.

4. Verifica dell'efficacia del protocollo completato nella creazione di cellule mutanti CRISPR RIP1 mediante analisi Western blot

1. Generare lisati proteici cellulari di monociti U937 wild-type (WT), cellule CRISPR di controllo non mirate (NTC) e cellule mutanti CRISPR RIP1 11,12,13.
2. Eseguire questi lisati su un gel SDS-PAGE e procedere con l'analisi Western blot¹⁴.
   1. Normalizzare prima i campioni in una proteina di pulizia.
   2. Dopo la normalizzazione, analizzare i campioni per i livelli di espressione della proteina RIP1 per determinare adeguatamente il successo della creazione di una linea cellulare mutante CRISPR RIP1 ¹⁴.
3. Dopo la conformazione dell'analisi western blot, le cellule possono essere utilizzate a scopo di sperimentazione.

A seguito della produzione di una popolazione confluente di cellule U937 mutanti CRISPR RIP1 , sono state eseguite analisi SDS-PAGE e Western blot. L'analisi Western blot è stata utilizzata per determinare il successo della creazione di una linea cellulare mutante CRISPR RIP1 valutando la perdita dei livelli di espressione della proteina RIP1. Questa determinazione è stata effettuata sulla base del risultato comparativo dei monociti WT U937 e delle cellule NTC. Nella ...

Questo protocollo mira a fornire istruzioni dettagliate e analisi delle potenziali insidie nell'efficienza e nell'affidabilità della trasfezione e della trasduzione lentivirale per creare una linea cellulare RIP1 knockout U937. Sebbene questo metodo di trasfezione e trasduzione richieda molto lavoro e tempo, è generalmente considerato un modo efficiente per incorporare il gRNA scelto e l'endonucleasi Cas9 in linee cellulari difficili da trasfettare

Nessuno.

Questa ricerca è stata finanziata dal National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) del National Institutes of Health (NIH), numero di sovvenzione NIH 2R15-HL135675-02 a T.J.L.