12.14 : Fluorescenza e fosforescenza: strumentazione

I fluorometri e gli spettrofluorimetri sono due tipi di strumenti che vengono usati per misurare la fluorescenza molecolare. Questi strumenti si differenziano nel modo in cui selezionano le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione e nel tipo di sorgenti luminose che utilizzano. I fluorometri usano dei filtri d’interferenza di assorbimento per scegliere le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione. La sorgente di eccitazione in un fluorometro, di solito, è una lampada a vapori di mercurio a bassa pressione che emette delle linee intense distribuite nelle regioni ultraviolette e visibili. Mentre i fluorometri sono adatti per i lavori quantitativi e possono misurare l'intensità della fluorescenza, non possono registrare degli spettri di eccitazione o di emissione.

Al contrario, gli spettrofluorimetri usano un monocromatore per selezionare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione. Questi strumenti usano una lampada ad arco allo xeno ad alta pressione come sorgente di eccitazione, che produce uno spettro di emissione continuo. Gli spettrofluorimetri possono registrare degli spettri di eccitazione o emissione, consentendo un'analisi della fluorescenza più dettagliata. Sono anche adatti per effettuare delle misurazioni quantitative. 

Nel caso della fosforescenza molecolare, è richiesta una strumentazione specializzata, nota come fosforimetria, per distinguere tra la fosforescenza e la fluorescenza. La fosforescenza ha una durata maggiore della fluorescenza, quindi viene incorporato un ritardo tra l'eccitazione e la misurazione dell'emissione fosforescente. Questo può essere ottenuto utilizzando due chopper che ruotano fuori fase. I chopper bloccano l'emissione fluorescente quando la sorgente di eccitazione è focalizzata sul campione, e bloccano la sorgente di eccitazione quando misurano l'emissione fosforescente. Per impedire la disattivazione dello stato eccitato tramite la conversione esterna, una forma di rilassamento senza radiazioni in cui l'energia viene trasferita al solvente o alla matrice del campione invece di essere emessa come luce, i campioni per le misurazioni della fosforescenza, di solito, vengono disciolti in un solvente organico adatto e congelati alla temperatura dell’azoto liquido. Questo forma una matrice solida otticamente trasparente che riduce al minimo la conversione esterna. In alternativa, il campione può essere immobilizzato su un substrato solido, consentendo la misurazione della fosforescenza a temperatura ambiente.