אנו רוצים להכיר את רוח שיתוף פעולה של כל חברי המעבדה קולדוול. פרס אוקונור בזיל המלומד מן מצעד הפרוטות ואת פרס הקריירה מן הקרן הלאומית למדע כדי GAC, וכן מחקר לתואר ראשון במדעי תוכנית גרנט מן הווארד יוז רפואי במכון של אוניברסיטת אלבמה, לממן רגישות עצבית ו אפילפסיה מחקר מעבדה קולדוול.

Aldicarb פרדיגמה חשיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הראשון, להבטיח כי לפחות שלושים צעירים בשלב הבוגר של תולעים גנוטיפ של לשכפל כל אחד יהיה זמין עבור מבחני aldicarb ביום השני. זה הכי טוב אם הנסיין בוחר חמישים או יותר תולעים בשלב L4 לצלחות NGM טרי (הכי טוב בלי nystatin), אשר מכילים E. coli (רצוי OP50) כמקור מזון, לגדל אותם במשך 12-24 שעות בטמפרטורת עקבית מתירני (20 ° C עד 22 ° C היא הטובה ביותר, למרות 25 מעלות זה בסדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום השני, לעשות 100 מניות mM פתרון של aldicarb עם אתנול 70% (EtOH) ו -30% DDH 2 O. מורחים את הכמות המתאימה של aldicarb לצלחות NGM מינוס nystatin עם כמויות מוגדרות כדי להשיג את הריכוזים aldicarb הרצוי. אנחנו באופן עקבי להשתמש 0.5 aldicarb mM על ידי ציפוי 37.5 μL aldicarb של 100 מ&quot;מ על גבי צלחות 7.5 מ&quot;ל NGM. אפשר צלחות aldicarb להתייבש במשך כ 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. אין צורך לפצח את העפעפיים. לחלופין, aldicarb ניתן להוסיף NGM ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע. &nbsp;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כרכים, צלחת ייבוש עקבית של E. coli (רצוי OP50) על גבי במרכז כל צלחת aldicarb ויבש למשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. אנחנו באופן עקבי צלחת 25 μL של OP50, אשר יוצרת הדשא מזון בגודל מספיק כדי לשמור על תולעים מרוכז במקום קטן בלי הצפיפות. &nbsp;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדשא מזון יבש, אפשר להמשיך עם מבחני aldicarb. בשל האופי הסובייקטיבי של מבחני aldicarb, מומלץ מאוד כי הניסויים יבוצעו &quot;בצורה עיוורת&quot;. עמיתו של הניסוי הראשוני יכול מחדש התווית המקורית צלחות עם תולעים להיות assayed. כמו כן, העמית יכול להעביר תולעים מהצלחות המקורי צלחות aldicarb מוצפנת מיד לפני תחילת טיימר. אם הנסיין צופה assaying זן מסוים של תולעים עם פנוטיפ אופייני, כגון uncoordination, אז חייב להיות גם שליטה עם פנוטיפ דומה כדי לצמצם הטיות. יתר על כן, עדיף אם הנסיין מבחני זן wild-type, כמו גם זן עמיד זן רגיש, במקביל כדי לסייע לתקנן ניסויים. הנסיין צריך לשאוף לנתח מספר עקבית של תולעים עבור לשכפל כל אחד. אנחנו באופן עקבי לנתח thirty תולעים של גנוטיפ אחד עבור כל לשכפל. אנחנו גם לבצע לפחות שלוש משכפל עבור כל ניסוי. הנסיין מנוסה אמור להיות מסוגל לנתח לפחות ששה זנים בכל פעם. &nbsp;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תולעים משותק על ידי דרבון באופן עקבי כל תולעת עם חוט פלטינה. אנחנו באופן עקבי לדרבן תולעים שלנו פעמיים על הראש ופעמיים על הזנב כל 30 דקות עבור סכום כולל של שלוש שעות. הפסקת השאיבה בלוע עשוי לשמש גם כדי להגדיר שיתוק, אבל רק אם הנסיין מעסיקה הגדרה עקבית של שיתוק על כל מבחני. כמו כן, ראוי לציין כי חלק תולעים, במיוחד אלה עמידים aldicarb, עשויים לנסות לזחול מעל צלחת. במקרה זה, הניסוי עלול להתפשט כמות קבועה של חומצה פלמיטית, מכשול פיזי כדי תנועה תולעת, סביב צלחות aldicarb. פרשנו 25 μL של 10 מ&quot;ג חומצה פלמיטית / mL EtOH. </li></ol> PTZ פרדיגמה חשיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הראשון, להבטיח כי לפחות שלושים צעירים בשלב הבוגר של תולעים גנוטיפ של לשכפל כל אחד יהיה זמין עבור מבחני PTZ ביום השני. זה הכי טוב אם הנסיין בוחר חמישים או יותר תולעים בשלב L4 לצלחות NGM טרי (הכי טוב בלי nystatin), אשר מכילים E. coli (רצוי OP50) כמקור מזון, לגדל אותם במשך 12-24 שעות בטמפרטורת עקבית מתירני (20 ° C עד 22 ° C היא הטובה ביותר, למרות 25 מעלות זה בסדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום השני, ליצור 0.5 גרם PTZ / mL DDH פתרון 2 O המניות של PTZ. מורחים את הכמות המתאימה של PTZ על NGM מינוס צלחות nystatin עם כמויות מוגדרות כדי להשיג את בריכוזים PTZ הרצוי. כי אנחנו מעדיפים מנה תגובה עבור מבחני PTZ, אנו צלחת כמויות משתנות של PTZ על צלחות 7.5 מ&quot;ל NGM. לדוגמה, אחד עשוי צלחת 37.5 μL הפתרון מניות PTZ לצלחת mL 7.5 NGM לעשות PTZ 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון. אפשר צלחות PTZ להתייבש במשך כ 60-120 דקות בטמפרטורת החדר. אין צורך לפצח את העפעפיים. לחילופין, ניתן להוסיף PTZ ישירות NGM, אך יש להשתמש מיד לאחר לחיזוק עבור מבחני. יציבות PTZ היא הרבה פחות מזה של aldicarb. לכן, מבחני עם מבוגרים צלחות PTZ מהימנים פחות. PTZ צריך להיות מאוחסן ב -20 מעלות ייבוש עם סוכן ייבוש לפני השימוש. אנחנו מעדיפים להתעלם PTZ כחודשיים לאחר הפתיחה כדי להבטיח יציבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כרכים, צלחת ייבוש עקבית של E. coli (רצוי OP50)על גבי במרכז כל צלחת PTZ ויבש עוד 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. אנחנו באופן עקבי צלחת 25 μL של OP50, אשר יוצרת הדשא מזון בגודל מספיק כדי לשמור על תולעים מרוכז במקום קטן בלי הצפיפות. &nbsp;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדשא מזון יבש, אפשר להמשיך עם מבחני PTZ. למרות מבחני PTZ הן סובייקטיביות פחות מבחני aldicarb, הוא עדיין מומלץ מאוד לבצע ניסויים &quot;באופן עיוור&quot;. עמיתו של הניסוי הראשוני יכול מחדש התווית המקורית צלחות עם תולעים להיות assayed. כמו כן, העמית יכול להעביר תולעים מהצלחות המקורי צלחות PTZ מוצפנת מיד לפני תחילת טיימר. אם הנסיין צופה assaying זן מסוים של תולעים עם פנוטיפ אופייני, כגון uncoordination, אז חייב להיות גם שליטה עם פנוטיפ דומה כדי לצמצם הטיות. יתר על כן, עדיף אם הנסיין מבחני זן wild-type, כמו גם זנים עם גוף מלא עוויתות קדמית או, במקביל כדי לסייע לתקנן ניסויים. הנסיין צריך לשאוף לנתח מספר עקבית של תולעים עבור לשכפל כל אחד. אנחנו באופן עקבי לנתח thirty תולעים של גנוטיפ אחד עבור כל לשכפל. אנחנו גם לבצע לפחות שלוש משכפל עבור כל ניסוי. הנסיין מנוסה אמור להיות מסוגל לנתח לפחות שלושה זנים בכל פעם. עם זאת, התדירות והעוצמה של PTZ-Induced עוויתות השיא בדרך כלל בין 15-30 דקות של חשיפה, ולאחר מכן להחליש כמו תולעים להיות משותק או, במקרים מסוימים, להסתגל לתרופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת &quot;דמויי אפילפסיה&quot; עוויתות תולעים כל 30 דקות עבור סכום כולל של שעה אחת. זה הכי טוב כדי להבקיע את מספר תולעים עם עוויתות הקדמי, שאנו מכנים &quot;הראש מיטלטל&quot;, בנפרד במספר תולעים עם גוף מלא, עוויתות, שיתוק גוף מלא, שאנו מכנים &quot;טוניק&quot;, או שילוב של עוויתות קדמית עם שיתוק BWM, שאנו מכנים &quot;טוניק-clonic&quot;. רוב התולעים של גנוטיפ אחד התערוכה רק סוג אחד של פרכוס. עם זאת, טוניק-clonic תולעים לעתים קרובות להיות טוניק לחלוטין, ולכן יש להמשיך את assay בעבר 30 דקות, גם אם כל התולעים הפגינו כבר עוויתות. כמו כן, ראוי לציין כי תולעים מסוימים עשויים לנסות לזחול מעל צלחת. במקרה זה, הניסוי עלול להתפשט כמות קבועה של חומצה פלמיטית סביב צלחות PTZ. פרשנו 25 μL של 10 מ&quot;ג חומצה פלמיטית / mL EtOH. </li></ol> תגובות התנהגותיות של מוטאנטים C. elegans נבחרים הילוכים Synaptic כדי Aldicarb ו PTZ <table style="height: 157px;;text-align:right;direction:rtl" border="1"><tbody><tr><th> Mutant שם </th><th> Synaptic תפקיד </th><th> התנהגות ללא תרופות </th><th> תגובה התנהגותית כדי Aldicarb (בהשוואה ל wild-type N2) </th><th> תגובה התנהגותית כדי PTZ </th></tr><tr><td> tom-1 (ok188) </td><td> מעכב הולכה סינפטית </td><td> ללא תיאום </td><td> שיעור משופרת של שיתוק </td><td> נבדל wild-type </td></tr><tr><td> UNC-43 (n498n1186) </td><td> מורכב </td><td> ללא תיאום </td><td> שיעור משופרת של שיתוק </td><td> גוף מלא עוויתות </td></tr><tr><td> UNC-25 (e156) </td><td> מקדם תמסורת GABA </td><td> ללא תיאום </td><td> שיעור משופרת של שיתוק </td><td> עוויתות הקדמי, גוף מלא שיתוק </td></tr><tr><td> snb-1 (md247) </td><td> מקדם ההולכה הסינפטית </td><td> ללא תיאום </td><td> שיעור מופחת של שיתוק </td><td> קדמית עוויתות </td></tr><tr><td> UNC-4 (E120) </td><td> מקדם תמסורת ACH </td><td> ללא תיאום </td><td> שיעור מופחת של שיתוק </td><td> נבדל wild-type </td></tr></tbody></table> שני ממריצים עצבית, מעכב acetylcholinesterase, שנקרא aldicarb, וכן אנטגוניסט לרצפטור GABA, שנקרא pentylenetetrazole (PTZ), ניתן להשתמש באופן משלים לאפיין C. elegans מוטנטים בשידור סינפטי. אצטילכולין מעוררים עודף (ACH) מצטבר בגוף התולעת קיר neuromuscular צמתים (NMJs) מן המוטציות המזיקות של הרגולטורים שלילית של אח השידור (למשל tom-1 ו-UNC-43) או רגולטורים חיוביים של השידור GABA מעכבות (למשל, UNC-25). לעומת זאת, מעוררים רמות אח בבית NMJs תולעת הם פחתה על ידי מוטציות מזיקות ב הרגולטורים חיובי של שידור הסינפטי כללי (למשל, snb-1) או אח העברת גנים ספציפיים (למשל UNC-4). כאשר בהשוואה ל wild-type תולעים N2, תולעים מוטציה עם שידור גבוהות אח מעוררים ב NMJs התערוכה שיעורי מוגברת של שיתוק aldicarb-Induced, ואילו תולעים מוטציה עם הילוכים הוריד אח מעוררים להפגין מוזלים של שיתוק aldicarb-Induced. למרות PTZ משבש בתיאום עצבי ב C. elegans קיר השרירים בגוף, שלא כמו aldicarb, PTZ גם מהופך GABA מעכבות ב C. elegans שרירי הראש. כתוצאה מכך, הרגישות aldicarb לא יכול לחזות במדויק את הרגישות PTZ. תולעים Mutant עם פגמים ספציפיים regul חיובית או שליליתation של שידור אח הם נבדלים מן wild-type תולעים N2 בנוכחות PTZ, ואילו תולעים מוטציה עם ליקויים בוויסות החיובי של שידור הסינפטי כללית או פגמים ספציפיים בתערוכה מעכבות השידור GABA חזקים PTZ-Induced עוויתות הקדמי. יתר על כן, UNC-43-הפסד של פונקציה מוטנטים להציג גוף מלא עוויתות בנוכחות PTZ וסביר יש הפרעות בשידור סינפטי נוספים, אשר תורמים התגובות הייחודי שלהם לסמים.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

פרוטוקולים נוכחי לחשיפה aldicarb עם C. elegans אינם מאפשרים להבחין בין הנסיינים מוטנטים עם גירעונות ספציפיים שידור ACH ו מוטנטים עם גירעונות כללית בשידור סינפטי, כמו גם סוגים של מוטציות התערוכה התנגדות aldicarb. כמו כן, aldicarb לא ניתן להשתמש כדי לקבוע אם יש גירעונות מוטנטים ספציפיים השידו...

<table><tbody><tr><td>Aldicarb</td><td>Reagent</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>PS734</td><td>Purchasable from Sigma</td></tr><tr><td>Pentylenetetrazole</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td></td></tr></tbody></table>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

נמטודות, Caenorhabditis elegans, הפך מודל רצוי ללימוד עצבית. סי אלגנס הוא ייחודי בין במודלים של בעלי חיים, כמו אנטומיה קישוריות של מערכת העצבים שלו נקבע מן micrographs אלקטרונים ומעודן ידי מבחני תרופתי. בסרטון הזה, אנו מתארים כיצד שני ממריצים עצביים משלימה, מעכב acetylcholinesterase, שנקרא aldicarb, וכן חומצה גמא-aminobutyric (GABA) אנטגוניסט לרצפטור, שנקרא pentylenetetrazole (PTZ), יכולים להיות מועסקים במיוחד כדי לאפיין איתות ב C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) ולהקל על ההבנה שלנו של מעגלים עצביים אנטגוניסטית. מתוך 302 C. elegans נוירונים, אלף תשע GABAergic D-סוג מנוע נוירונים קיר innervate גוף שרירי (BWMs), בעוד ארבעה נוירונים GABAergic, שנקרא RMEs, שרירי הראש innervate. לעומת זאת, 39 הנוירונים המנוע לבטא את הגירוי העצבי, אצטילכולין (ACH), ואת להרגיז השידור GABA על BWMs לתאם תנועה. טבע אנטגוניסטית של נוירונים מנוע GABAergic ו cholinergic ב NMJs הגוף קיר נקבע בתחילה על ידי אבלציה לייזר חיזקה מאוחר יותר על ידי חשיפה aldicarb. חשיפה אקוטית aldicarb תוצאות שיתוק זמן מנות או מנה תגובה ב wild-type תולעים. עם זאת, הפסד של שידור אח מעוררים מקנה עמידות aldicarb, כמו אח פחות מצטבר ב NMJs תולעת, המוביל גירוי פחות BWMs. ההתנגדות aldicarb אפשר לראות עם אח ספציפי או כללי מוטנטים פונקציה הסינפטי. בהתאם GABA אנטגוניסטית ו ACH השידור, אובדן השידור GABA, או כישלון שלילי להסדיר אח שחרורו, מקנה רגישות יתר aldicarb. למרות החשיפה aldicarb הוביל לבידוד של homologs תולעת רבים של גנים עצבית, חשיפה aldicarb לבדו לא יכול לקבוע ביעילות תפקידים הרווחת עבור גנים מסלולים ספציפיים C. elegans נוירונים המנוע. לשם כך, יש לנו הציגה גישה ניסויית משלימים, אשר משתמשת PTZ. מוטנטים עצבית להציג פנוטיפים ברורים, להבדיל משיתוק aldicarb-Induced, בתגובה PTZ. Wild-type תולעים, כמו גם מוטנטים עם inabilities ספציפי לשחרר או לקבל אח, לא מראים רגישות ברור PTZ. עם זאת, מוטציות GABA, כמו גם מוטנטים בכלל פונקציה הסינפטי, להציג עוויתות הקדמי באופן זמן או כמובן במינון תגובה. מוטאנטים שלא ניתן לווסת באופן שלילי שחרור הנוירוטרנסמיטר כללי, ולכן מפרישים כמויות עודפות של אח על BWMs, הפך משותק PTZ. PTZ-Induced פנוטיפים של כיתות מוטציה בדידה עולה כי גישה משלימים עם aldicarb ו פרדיגמות PTZ החשיפה C. elegans עשוי להאיץ את הבנתנו עצבית. יתר על כן, קטעי וידאו המדגים כיצד אנו מבצעים מבחני תרופתי צריך להקים שיטות עקבית למחקר C. elegans.

Watch this Scientific Journal Video about Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants at JoVE.com

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

וידאו זה מדגים כיצד להעסיק two ממריצים עצביים, aldicarb ו pentylenetetrazole (PTZ), בדרכים משלימות ללמוד לתפקד סינפטיים של נמטודות, C. elegans. גישה זו משלימה עשוי לשמש גם כדי לשפוך אור על מנגנוני שמור באבולוציה עבור בתיאום ויסות עצבי ויש לו השלכות על אפילפסיה והתקפים.

פרדיגמות אפיון תרופתי של C. elegans מוטאנטים הילוכים Synaptic

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

paradigms-for-pharmacological-characterization-c-elegans-synaptic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  University of Alabama. וידאו זה מדגים כיצד להעסיק two ממריצים עצביים, aldicarb ו pentylenetetrazole (PTZ), בדרכים משלימות ללמוד לתפקד סינפטיים של נמטודות, C. elegans. גישה זו משלימה עשוי לשמש גם כדי לשפוך אור על מנגנוני שמור באבולוציה עבור בתיאום ויסות עצבי ויש לו השלכות על אפילפסיה והתקפים.

Video: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Behavior

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Neuroscience

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) controls several functions in C. elegans including learning and motor activity. Conditions that stimulate DA release (e.g., amphetamine (AMPH) treatments) or that prevent DA clearance (e.g., animals lacking the DA transporter (dat-1) which are incapable of reaccumulating DA into the neurons) generate an excess of extracellular DA ultimately resulting in inhibited locomotion. This behavior is particularly evident when animals swim in water. In fact, while wild-type animals continue to swim for an extended period, dat-1 null mutants and wild-type treated with AMPH or inhibitors of the DA transporter sink to the bottom of the well and do not move. This behavior is termed "Swimming Induced Paralysis" (SWIP). Although the SWIP assay is well established, a detailed description of the method is lacking. Here, we describe a step-by-step guide to perform SWIP. To perform the assay, late larval stage-4 animals are placed in a glass spot plate containing control sucrose solution with or without AMPH. Animals are scored for their swimming behavior either manually by visualization under a stereoscope or automatically by recording with a camera mounted on the stereoscope. Videos are then analyzed using a tracking software, which yields a visual representation of thrashing frequency and paralysis in the form of heat maps. Both the manual and automated systems guarantee an easily quantifiable readout of the animals' swimming ability and thus facilitate screening for animals bearing mutations within the dopaminergic system or for auxiliary genes. In addition, SWIP can be used to elucidate the mechanism of action of drugs of abuse such as AMPH.

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming induced paralysis (SWIP) is a well-established behavioral assay used to study the underlying mechanisms of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans (C. elegans). However, a detailed method to perform the assay is lacking. Here, we describe a step-by-step protocol for SWIP.

שחייה המושרה שיתוק כדי להעריך דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle contraction. As in vertebrate skeletal muscle, cholinergic signaling in the body wall muscles of the model organism Caenorhabditis elegans is required for locomotion. Exposure to levamisole, a pharmacological agonist of one class of ACh receptors on the body wall muscles, causes time-dependent paralysis of wild-type animals. Altered sensitivity to levamisole suggests defects in signaling at the NMJ or muscle function. Here, a protocol for a liquid levamisole assay performed on C. elegans grown in 24-well plates is presented. Vigorous swimming of the animals in liquid allows for the assessment and quantitation of levamisole-induced paralysis in hundreds of worms over a one-hour time period without requiring physical manipulation. This procedure can be used with both wild-type and mutants that have altered sensitivity to levamisole to demonstrate the functional consequences of altered signaling at the NMJ.

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

The present protocol describes an assay to determine response to levamisole, a pharmacological agonist of one class of Caenorhabditis elegans acetylcholine receptors. In this liquid levamisole swim assay, researchers visually observe and quantitate the time-dependent paralysis of animals cultivated in 24-well plates.

מדידת רגישות Caenorhabditis elegans לקולטן אצטילכולין אגוניסט לבאמיזול

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Genetics

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

שיטות לחקר מנגנוני פעולה של אנטי פסיכוטיות סמים ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

הימנעות אוסמוטי ב Caenorhabditis elegans: Synaptic פונקציה של שני גנים, Orthologues של האדם NRXN1 ו NLGN1, כמו מועמדים אוטיזם

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

מציאה גן בקנה מידה גדולה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

פרדיגמות אפיון תרופתי של C. elegans מוטאנטים הילוכים Synaptic

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video