יצירת ספרואידים תלת ממדיים להערכת תרופות

פרוטוקול זה הדגים שיטה סטנדרטית לבניית גידולים תלת מימדיים של ספרואידים. ומתודולוגיה זו סיפקה ניתוח מעגל גבוה ותוכן גבוה של מבני גידול תלת ממדיים. על ידי שימוש בשיטה סטנדרטית של בניית ספרואידים סרטניים ומערכת הדמיה וניתוח בתפוקה גבוהה, ניתן להגדיל באופן דרמטי את היעילות והדיוק של בדיקות סמים שנוצרו על ספרואידים תלת מימדיים.

בפרוטוקול זה, השתמשנו ב- AMG510 לטיפול בספרואיד NCI-H23 כדוגמה. מהניסוי יכולנו לראות השפעה משמעותית של תרופה סרטנית ממוקדת מטרה על ספרואידים סרטניים. כדי להתחיל, פיפטה 100 מיקרוליטר של מגיב אנטי הידבקות לתוך כל באר של צלחת 48 באר עם תחתית באר בצורת U ולשמור במשך 10 דקות.

לאחר 10 דקות, שאפו את מגיב הציפוי ושטפו פעמיים עם PBS מעוקר. הניחו את צלחת התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באוויר לח עם 5% פחמן דו חמצני עד לשימוש. התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ.

לאחר מכן, שטפו את התאים בתרבית בבקבוק T25 פעמיים עם PBS כדי להסיר את מדיום התרבית ולטפל בתאים המורחבים עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA למשך דקה עד שתיים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. אשר את צורת התא מתחת למיקרוסקופ. ואז להפסיק את הטיפול טריפסין על ידי שאיפת ההשעיה בשימוש טריפסין EDTA בבקבוק T25 ושטיפת התאים עם ארבעה מיליליטר של מדיום טרי.

מעבירים את כל התרחיף לצינור של 15 מיליליטר ומשתמשים במיליליטר אחד של מדיום טרי כדי לשטוף את התאים השיוריים ולהוסיף אותו לצינור. צנטריפוגו את התאים בטמפרטורה של 186.48 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנטנט. מוסיפים 10 מיליליטר של מדיום טרי לכדורית התא ופיפטה עדינה עד שהתאים נמצאים בתרחיף הומוגני.

שאפו 0.1 מיליליטר של תרחיף תאים לתוך צינור צנטריפוגה חדש. מוסיפים 0.9 מיליליטר של מדיום טרי ולאחר מכן פיפטה את ההשעיה היטב. לחלץ 10 מיקרוליטר של תרחיף התא לספירת תאים.

חזור על תהליך זה פעם או פעמיים וקבל ערך ממוצע. לדלל את ההשעיה כדי להגיע לצפיפות זריעה סופית של 50, 000 תאים למיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 200 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת 48 באר U-תחתית.

עוטפים את סרט האיטום סביב הצלחת וצנטריפוגות אותו בטמפרטורה של 119.35 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, משוך את סרט המגן והוסף חמישה עד שמונה מיליליטר מים מעוקרים לתעלת המים המקיפה את הבארות. דוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים.

אין להחליף או להוסיף מים לתעלת המים במהלך תקופה זו ולצפות בצבירת התאים במהלך חמשת הימים הבאים. להטמעת הג'ל, לאחר הוצאת הג'ל הקפוא מהמקרר במינוס 20 מעלות צלזיוס, מניחים אותו על קופסת קרח למשך כל הזמן במהלך הניסוי. התבוננו בכדורי התא מתחת למיקרוסקופ.

לפני תחילת הטבעה בג'ל, יש לבדוק שוב את מצב הספרואידים. בזהירות להסיר 150 מיקרוליטר של המדיום ולהטמיע כל spheroid בג'ל על ידי הוספה איטית של ג'ל נוזלי מצד הקיר של הבאר תוך הזזת קצה פיפטה מקורר מראש סביב ובתוך הבאר. המתן חמש דקות ואם הג'ל אינו מתפשט באופן שווה, פיפטה בעדינות את הג'ל עם קצה פיפטה 10 מיקרוליטר.

כל באר מכילה ספרואיד גידולי, 25 מיקרוליטר של 3.5 מיליגרם למיליליטר ג'ל, ו-50 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם. הוסף 75 מיקרוליטר של בינוני לבקרות גם כן. לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד hydrogelation הושלם במלואו.

אשר את מצב הג'לציה מתחת למיקרוסקופ. שכבו 125 מיקרוליטר של מדיום טרי על כל דגימה ותרבו את הספרואידים למשך 7 עד 10 ימים נוספים. הכינו קבוצות של ספרואידים עם ארבע עד שש בארות כל אחת ובחרו לפחות שלוש מהן לניתוח.

להמיס את התרופה על פי הוראות היצרן ולהכין 100 פעמים פתרונות עבודה עם DMSO. השתמש 0.1% DMSO כבקרה חיובית ולהוסיף 125 מיקרוליטר של מדיום מטופל בתרופות לכל באר. מחזירים את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באוויר לח עם 5% פחמן דו חמצני.

בשלב זה, כל באר מכילה ספרואיד גידול, 25 מיקרוליטר של 3.5 מיליגרם לג'ל מיליליטר, ו 175 מיקרוליטר של המדיום. הפקדים מכילים 200 מיקרוליטר של המדיום. מדוד את הכדאיות הספרואיד באמצעות ערכת בדיקה alamarBlue בהתאם להנחיות היצרן.

שאפו 100 מיקרוליטר של התווך הסופרנאטנטי מכל באר לצלחת בדיקה חדשה. לאחר מכן, למדוד את הכדאיות באמצעות פוטומטר microplate. מדדו אותו ביום הראשון, ביום הרביעי, ביום השביעי וביום העשירי לאחר הטמעת הספרואידים בג'ל.

מוסיפים 80 מיקרוליטר של מדיום טרי לכל באר של צלחת התרבית. לאחר מכן להחליף עוד 100 מיקרוליטר של המדיום המטופל בתרופה. ודאו שאין שרידים של אלמר בלו בבאר.

שאפו החוצה 100 מיקרוליטר של המדיום לפני ההדמיה והניחו את הצלחת על הבמה. קבל תמונות דיגיטליות של הספרואידים באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי עם מטרה פי עשרה. המיקרוסקופ יכול למקד ולרכז את הספרואידים הללו באופן אוטומטי.

המתן להדמיה האוטומטית. ארבע תמונות נרכשות עבור כל ספרואיד. תמונה משולבת נוצרת ומעובדת עם התוכנה המחוברת למערכת הדמיה תוכן גבוה.

לחץ על כפתור תהליך תיקון התמונה ובחר את התמונות המשולבות בתוכנה. בחר דגם U net והקלד את יחס ההמרה. לחץ בתחתית המסך כדי להתחיל בעיבוד התמונה.

שמור את נתוני הקוטר, ההיקף והחספוס בתוכנת הגיליון האלקטרוני. לבסוף, להוסיף 100 מיקרוליטר של מדיום טרי עם התרופה ומניחים את הצלחת בחזרה לתוך האינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס באוויר לח עם 5% פחמן דו חמצני. תמונות שדה בהיר של ספרואידים של תאי NCI-H23 שטופלו בריכוזים שונים של AMG510 ונלכדו אוטומטית על ידי מיקרוסקופ בעל תוכן גבוה מוצגות באיור זה.

העמודות מייצגות ימים שונים והשורות מייצגות ריכוזי תרופות שונים. התוצאות כוללות שלושה ספרואידים לכל מצב. כדאיות הגידול של קבוצות הדגימה שטופלו ב-AMG510 נמדדה ביום הראשון, ביום הרביעי, ביום השביעי וביום העשירי.

כדאיות התא הסופי של הדגימות עם שיפועי ריכוז מוצגת באיור זה. קוטר כדורי הגידול נמדד ביום הראשון, ביום הרביעי, ביום השביעי וביום העשירי. יחס הגידול הספרואידי הוגדר כנפח הסופי ביחס לנפח המקורי וחושב באמצעות קוטר הספרואידים.

יחס עיכוב הצמיחה הספרואידי הוגדר ביחס לנפח וחושב באמצעות קוטר הספרואידים. חספוס הגידול נמדד על ידי התוכנה ביום הראשון, ביום הרביעי, ביום השביעי וביום העשירי, מה שמצביע על הפולשנות של כדורי הגידול. היקף הספרואיד אותר ושורטט על ידי התוכנה באמצעות אלגוריתמים של למידה עמוקה.

האזורים הכדוריים במישור המוקד נמדדו אז על ידי תמונה J ומדד היקפי עודף חושב על סמך נתונים אלה. למרות שקל לעקוב אחר הודעה זו, עדיין יש לטפל בדגימות בזהירות.