כאשר אנו חוקרים הזדקנות ואלגני ים, אנו בדרך כלל עוקבים אחר אוכלוסיית בעלי חיים לאורך זמן. זה נותן לנו הצצה למה שהתהליך שאתם חוקרים עושה באוכלוסייה בכל נקודת זמן, אבל זה לא אומר לכם איך התהליך משתנה אצל בעלי חיים בודדים לאורך זמן. סביבות תרבית של בעלי חיים בודדים אלה מאפשרות לנו לעקוב אחר שינויים דינמיים בתהליכים מולקולריים ובתהליכים פיזיולוגיים בבעלי חיים בודדים לאורך זמן עבור מאות בעלי חיים במקביל.
אנו מוצאים כי ישנם שני דברים עיקריים שיכולים באמת להשפיע על האיכות של מערכות תרבות מרובות בארות אלה. האחד הוא ייבוש הבארות או מתחתיו, והשני הוא זיהום. ואנחנו מנסים לציין לאורך כל הפרוטוקול צעדים ספציפיים שבהם אתה יכול לנסות להקל על בעיות אלה.
מי שתדגים את הפרוטוקול היום תהיה אמילי גרדאה. היא טכנאית במעבדה שלי ועשתה הרבה עבודה כדי לייעל את הפרוטוקול הזה. לאחר הכנת כל הריאגנטים, מערבבים 60 גרם בסיס PDMS ושישה גרם חומר מרפא לכל תבנית בסירה חד פעמית גדולה באמצעות מרית חד פעמית.
הניחו את תערובת PDMS בתא ואקום למשך 30 דקות בטמפרטורה של מינוס 0.08 מגה פסקל כדי להסיר בועות. יוצקים וממלאים את תערובת PDMS לכל תבנית מודפסת בתלת-ממד. הכניסו את התבנית המלאה וכל תערובת PDMS נוספת לתא הוואקום למשך 25 דקות במינוס 0.08 מגה פסקל.
מוציאים את התבנית המלאה מתא הוואקום ומפוצצים את כל הבועות שנותרו בעזרת מרית חד פעמית. מתחילים בקצה אחד, מורידים לאט יריעת אקריליק שטוחה מעל תבנית מלאה PDMS. אם מתרחשת היווצרות בועה, המשך כמתואר בכתב היד.
מניחים משקולת של 2.5 קילו על האקריליק ומכניסים את התבניות המשוקללות לתנור. תנו להם לרפא ב 55 מעלות צלזיוס בן לילה. בתום הדגירה מוציאים את המשקולות והתבניות מהתנור.
לאחר מכן, לעבוד סכין גילוח בין אקריליק לבין PDMS נרפא כדי לשבור את החותם באמצעות סכין גילוח או מרית מתכת, בזהירות לשחרר את הצדדים של PDMS נרפא ולהסיר אותם מן התבנית. עטפו את התקן PDMS ברדיד אלומיניום. אטמו אותו בסרט הדבקה אוטומטי ועיקרו אותו על ידי אוטוקלאבינג במחזור יבש למשך 15 דקות לפחות בלחץ מד של 121 מעלות צלזיוס ו-15 פאונד לאינץ' מרובע.
כדי להכין את המכשיר רב באר, לחמם מראש אינקובטור אמבטיה חרוזים יבש ל 90 מעלות צלזיוס. בטל עטיפת התקן מרובה בארות אוטומטי וחתוך חריץ קטן בפינה השמאלית העליונה של המכשיר. הכניסו עד שלושה מכשירים לא עטופים לשואב הפלזמה כשהבארות פונות כלפי מעלה והפעילו את מנקה הפלזמה.
יש לעקר מגש פוליסטירן אחד לכל מכשיר על ידי ריסוס החלק הפנימי של המגש באתנול 70% וניגוב יבש במגבון משימה. הסר כל מכשיר ממנקה הפלזמה ביד כפפה והנח אותו במגש ניקוי. לאחר מכן מניחים אגן פיפטה חד פעמי של 25 מיליליטר באינקובטור אמבט החרוזים שחומם מראש ב 90 מעלות צלזיוס.
יש למלא שפופרת אחת של תערובת LMNGM מוצקה לכל מכשיר והניחו אותה בכד זכוכית של 200 מיליליטר. מסירים את הפקק ואת הפרפילם ומחממים במיקרוגל עד שהמדיה נמסה מספיק כדי לשפוך. יוצקים את תערובת LMNGM המותכת מראש לתוך עוד סטרילית של 200 מיליליטר.
ניתן לשלב מספר מבחנות בכד זה אם ממלאים יותר ממכשיר אחד בכל פעם. חממו במיקרוגל את התערובת המקדימה של LMNGM למשך 20 שניות נוספות. אם התערובת המוקדמת מתחילה לרתוח, עצרו את המיקרוגל ואפשרו לו לשקוע.
הוציאו את תערובת ה-LMNGM המותכת מהמיקרוגל וקררו אותה ל-60 מעלות צלזיוס. הוסיפו את שאר מרכיבי LMNGM לתערובת שערבבו מראש ומזגו את LMNGM המותך לאגן 25 מיליליטר באמבט החרוזים. מלא את בארות המכשיר באמצעות פיפטה משחזר רב ערוצי 200 מיקרוליטר.
הגדר את המשחזר כדי לחלק aliquots של 14 מיקרוליטר ו mount חמישה קצוות פיפטה. טען את הקצוות עם LMNGM מותך ושחרר את 14 המיקרוליטרים הראשונים בחזרה לאגן המכיל LMNGM. נע במהירות אך בזהירות, שחרר 14 מיקרוליטר לתוך הבארות הפנימיות של המכשיר ושחרר את LMNGM הנותרים בחזרה לאגן כמו aliquot הסופי הוא בדרך כלל פחות מ 14 מיקרוליטר.
לאחר מכן, להגדיר את המשחזר כדי לחלק aliquots של 15 מיקרוליטר ולמלא את הטבעת החיצונית ביותר של בארות. באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר, שחררו 200 מיקרוליטר של תמיסת נחושת גופרתית לחפיר המכשיר בכל פינה. הימנע ממילוי יתר של החפיר וודא שהנחושת הגופרתית אינה נוגעת במשטח העליון של הבארות.
אם הנחושת הגופרתית אינה זורמת בקלות דרך החפיר כולו, השתמש בחוט פלטינה קצר כדי לעזור לשבור את המתח ולגרור את גופרתי הנחושת דרך החפיר. לאחר שנחושת גופרתית זרמה דרך החפיר כולו, להסיר כמה שיותר נחושת גופרתית באמצעות פיפטה 200 מיקרוליטר או שאיפה עם ואקום. באמצעות בקבוק לחיצה, מוסיפים את גבישי המים ברווחים שבין המכשיר לדפנות המגש.
סגור את מכסה המגש ועטוף את כל ארבעת הצדדים בחתיכת Parafilm. הוסיפו שתי חתיכות פרפילם נוספות כדי לאטום את הצלחת לחלוטין. בעזרת פיפטה מהדר מזהים כל באר חמישה מיקרוליטרים של חיידקים מרוכזים.
הימנע ממגע ישיר עם משטח LMNGM. יבשו את המכשירים באמצעות קופסת ייבוש בהתאמה אישית, אותה ניתן לבנות בעלות מינימלית באמצעות מאווררי מארז מחשב ומסנני HEPA. תחת היקף דיסקציה, בדוק בארות כדי לוודא שכל הבארות התייבשו בהצלחה.
בעזרת פיק פלטינה, מעבירים את בעלי החיים מצלחות התולעת המוכנות ומוסיפים תולעת אחת לכל באר. הוסיפו טיפה של תמיסת ניקוי מוכנה לחלק הפנימי של מכסה המגש ושפשפו עם מגבון משימה עד שתמיסת חומרי הניקוי מתייבשת. עטפו את המגש בשלוש חתיכות של פרפילם כמתואר בכתב היד.
הארכת תוחלת החיים מ-daf-2(RNAi) חסומה על-ידי מוטציית האפס daf-16. תוחלת הבריאות ירדה גם בנוכחות daf-2(RNAi)ממוצע הפעילות המתגלגל של שלושה ימים לאורך תוחלת החיים מופחת על ידי מוטציה של daf-16 ו- daf-2(RNAi)השונות בתוחלת החיים ובתוחלת הבריאות בין בעלי חיים בודדים בהשוואה במונחים מוחלטים או כשבריר מתוחלת החיים הכוללת מוצגת. הפעילות המצטברת לאורך תוחלת החיים של בעלי חיים בודדים מתואמת טוב יותר עם תוחלת החיים מאשר הפעילות של בעלי חיים בודדים בכל יום ספציפי לאורך תוחלת החיים.
חשוב למלא את הבארות ולהוסיף את התולעים מהר ככל האפשר. אחרת הבארות יכולות להתייבש והתולעים לא ישרדו. מערכת זו תואמת להדמיה אוטומטית שניתן להשתמש בה כדי לאסוף נתונים בתפוקה גבוהה כגון תוחלת חיים, פעילות וגודל גוף או צורה.
