פרוטוקול זה תיאר שיטה לספירת תאי גידול אדומים, ואת בידוד CTC קליני. כדי להתחיל, תרבית את תאי הגידול MCF-7, MDA-MB-231, ו- HeLa בבקבוק תרבית תאים בבת אחת 10 עד החמישי במילימטר אחד של DMEM, בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
כאשר קווי התאים גדלים כחד-שכבות דבקות למפגש של 95%, נתקו אותם מצלחת התרבית עם תמיסת טריפסין 0.25% למשך שתי דקות. מכתימים את תאי הגידול על ידי הוספת שלושה מיקרוליטרים של Calcein AM, ומניחים את המנה באינקובטור למשך 30 דקות. בסוף הדגירה, לעכל את כל התאים עם טריפסין.
לספור את תאי הגידול בתרבית PBS עם תא ספירת תאים, ולדלל עד 100 תאי גידול לכל מיליליטר של PBS מתקבלים. לאחר מכן, להציג את השעיית התא המדולל לתוך שבב microfluidic באמצעות מזרק עם משאבת מזרק בקצבי זרימה מגוונים. השג את יעילות הלכידה עבור קצבי הזרימה השונים, וקבע את קצב הזרימה האופטימלי.
ספרו את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב, וזורמים החוצה מהשקע. חשב את יעילות הלכידה באמצעות הנוסחה הנתונה. חזור על ההליך כדי להשיג את יעילות הלכידה עבור מספר שונה של תאים סרטניים, מ 10 עד 100.
בדוק ותקף את השבב המיקרופלואידי עבור מספר נדיר של תאים סרטניים. הזריקו את 10 מתלי הדגימה הללו לתוך השבבים המיקרופלואידים באמצעות מחט חלולה העשויה עם מושך מיקרופיפטה כדי לשאוף תאי גידול מדוללים. לזהות ולמנות את מספר תאי הגידול עבור כל דגימה לאחר לכידתם על השבב.
לאחר מכן, להכתים את תאי הגידול עם Calcein AM, ולמנות 100 תאים סרטניים בחמישה מיקרוליטרים של PBS. יש להקפיץ תאים אלה למיליליטר אחד של דגימת דם שלמה ונורמלית. הכנס תאים אלה לתוך השבב, ולמנות את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב עם immunofluorescence ירוק.
בצע ספירת in vivo כמתואר, וחשב את יעילות הלכידה לאחר הלכידה. מנה אחד עד 10 תאים סרטניים ללא צביעה. יש להפוך את התאים האלה למיליליטר אחד של דם שלם ונורמלי.
הכנס דגימות אלה לתוך שבב microfluidic, וללכוד את תאי הגידול. הוסף שלושה עד חמישה מיקרוליטרים של צבע פלואורסצנטי לתוך 20 עד 30 מיקרוליטר של PBS, ולהציג פתרון זה על השבב עם מזרק. מנה את מספר תאי הגידול שנלכדו על השבב עם immunofluorescence כחול וירוק כדי לקבוע את יעילות לכידה.
לאחר מכן, שנה את פני השטח של השבב עם 100 מיקרוליטר של 4%3-mercaptopropyl trimethoxysilane ואתנול בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות ללכידה מבוססת זיקה של מולקולת הידבקות תאים אנטי אפיתל. בסוף הדגירה, לשטוף את השבב שלוש פעמים עם אתנול. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של סוכן הצימוד GMBS, ולאפשר לו אינטראקציה במשך 30 דקות.
בסוף הדגירה, להשתמש מזרק לשטוף את השבב שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS. טפל בשבב עם 30 עד 40 מיקרוליטר של 10 מיקרוגרם למיליליטר נויטרווידין בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, מה שמוביל לשיתוק התאים ל- GMBS, ולאחר מכן שטוף עם PBS כדי להסיר עודפי אבידין. שנה את השבב עם שלושה מיקרוליטרים של נוגדן מולקולת הידבקות תאי אפיתל אנטי-ביוטינילציה, ודגור בן לילה.
כל תאי הגידול נלכדו סביב מערך שבב הגל ללא תאים חסרים, מה שמעיד על יעילות הלכידה הגבוהה של השבב המיקרופלואידי. תאי גידול מוכתמים עם Hoechst ו Calcein AM מוצגים כאן. CTCs מחולה סרטן קיבה שנלכדו באמצעות מיקרו-מסננים אליפסה קטנים מוצגים כאן.
כמו כן, מוצגים CTCs מחולה סרטן המעי הגס שנלכד באמצעות מיקרו-פילטרים טרפזיים, ופולטים פלואורסצנטיות כחולה וירוקה. יעילות לכידה גבוהה וכדאיות נצפתה עבור תאים סרטניים שנלכדו באמצעות מיקרו-מסננים גדולים של אליפסה. ניתוח אימונופלואורסצנטי קליני של CTCs המעי הגס שנלכדו על השבב המיקרופלואידי זיהה CTCs כחיובי DAPI, CK-חיובי, CD45-שלילי, ואת WBCs כחיובי DAPI, CK-שלילי, CD45-חיובי.
תאי גידול במעי הגס שגודלו בתרבית על שבב האליפסה הגדול לאחר לכידתם, ותאי גידול מעי גס שנלכדו על מיקרו-פילטרים של האליפסה הגדולה מוצגים כאן. שיטה זו של שינוי עם aptamer מספקת גישה חדשה להעשרת בידוד CTC.
