המחזיק המודפס בתלת-ממד המשמש בפרוטוקול זה מאפשר לנו לעקוב אחר איתות תאי לטווח קצר ואירועי נדידה סלולרית ארוכת טווח בקרניות פצועות בזמן אמת. על ידי שמירה על כדור הארץ שלם, בר קיימא וחסר תנועה, פרוטוקול זה מפיק תמונות חיות באיכות גבוהה של תאי הקרנית, כולל האפיתל והעצבים. ניתן היה לשנות בקלות את המחזיק המודפס בתלת-ממד עבור גלובוסים בגדלים ומינים שונים.
אנו יכולים גם לכוון את העיניים באופן שונה לתמונה של אזורים אחרים או לבצע ניסויי כניסת ננו. כדי להתחיל, לאחר הסרת ראשו של עכבר מורדם, הנח אותו מיד על הקרח כדי לשמור על הכדאיות של הרקמה. לאחר מכן עטפו את הגלובוסים על ידי הנמנמתו, באמצעות פינצטה.
ולקצץ את עצב הראייה באמצעות מספריים דיסקציה ממש מתחת למקום שבו הוא מוחזק על ידי פינצטה. דגירה של הגלובוסים בשני מיליליטרים של המדיום בצלחת תרבית תאים P-35, כולל מחוון סידן ו/או כתם קרום התא למשך שעה אחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני בתנאי תאורה נמוכים, כדי להבטיח שהגלובוסים יהיו שקועים במדיום הכתמים להכתמה אחידה. כדי להדביק את המחזיקים לכיסוי תחתון נקי מזכוכית, שטפו את המחזיק ב-70% אתנול והניחו דבק על המחזיק.
לאחר מכן, הדביקו את המחזיק לכיסוי התחתון של הזכוכית, וודאו שאין דבק באזור הפנימי של המחזיק, שכן דבק יכול להתנפץ, מה שמסבך את ההדמיה. לאחר שהדבק מתמצק, ודא שהמחזיק מאובטח מפני תלוש הכיסוי. הסר את הגלובוסים מתמיסת הכתם באמצעות טפטפות סטריליות, תוך הקפדה על מניעת נזק לרקמות באזור העניין.
שוטפים את הגלובוסים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, תוך שימוש במלח זרחתי סטרילי כדי להסיר כתמים עודפים ולהניח את הגלובוסים בתווך להובלה למיקרוסקופ. כדי לפצוע את הגלובוסים באמצעות מחט סטרילית של 25 מד באזור העניין, הרימו והחזיקו את הגלובוס מהחלק האחורי של העין, באמצעות טפטפת סטרילית כדי לשמור על יציבות הגלובוס ולמנוע ממנו להתגלגל. עבור פצע שריטה, יש להזיז בעדינות מחט סטרילית בגודל 25 מד על פני הקרנית החשופה או ללחוץ בעדינות את המחט ישירות לתוך הקרנית המרכזית לפצע ניקוב, כדי להבטיח שהפצע לא יחדור את קרום מרתף הקרנית.
מניחים את אזור הקרנית או הלימבל על מחליק הכיסוי באזור הפנימי של המחזיק, תוך אישור שהגלובוס ממוקם כראוי ושאתר העניין נמצא במגע עם כיסוי הזכוכית. ייצוב באמצעות הכיסוי המודפס בתלת-ממד המודבק למחזיק, באמצעות דבק. ואל תנסה להסיר את כדור הארץ, שכן זה עלול לגרום נזק לרקמות.
הפעילו את המיקרוסקופ וקבעו את התא הסביבתי ל-35 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני וודאו את התא הלח. הניחו את מחזיק הכיסוי ואת הגלובוס המיוצב על במת המיקרוסקופ בתוך התא והתמונה הסביבתית, תוך שימוש בטכניקות הדמיה של תאים חיים. על ידי בדיקה של מדיית גידול נוספת על גבי הכיסוי כדי למנוע התייבשות ולשמור על כדאיות הרקמות, ולהבטיח שיש מספיק מדיום בבאר כדי לכסות את כדור הארץ במחזיק.
התחל ניסויים באמצעות טכניקות הדמיה של תאים חיים, תוך שימוש בהגדרות לייזר בהספק נמוך כדי לשמר את הרקמה ולמנוע נזק לרקמות ומטרות מתאימות לניסויים ממושכים. הקלט ושמור נתונים בתבנית הקובץ המועדפת של קבצי CZI להקלטת נתונים. נתוני הדמיה באיכות גבוהה של מבנה רב-שכבתי התקבלו עבור קרנית X vivo, מיוצבת באמצעות מחזיק מודפס בתלת-ממד, המדגימה אירועי איתות סידן בשכבות האפיקליות, הבסיסיות והסטרומליות של הקרנית.
תמונות Z-stack של קרנית, משותקת במחזיק המודפס בתלת-ממד, בפצע שריטה, התקבלו כדי להמחיש את קרומי התאים ואת איתות הסידן לאורך שכבות הקרנית וגיוס הסידן במישורי Z שונים. ניסוי בסדרת זמן של קרנית בוצע כדי לחקור את נדידת התאים לתוך מיטת הפצע במהלך תגובת הריפוי, וחשף תנועה מועטה של כדור הארץ בכיווני X, Y או Z. זה היה ציין כי על ידי הצבת כדור הארץ במחזיק, אזורים שונים של הקרנית, הן במרכז והן באזור הלימבל הקרנית ניתן לדמיין.
פרוטוקול זה מאפשר לנו לדמות עיניים ממודלים של מחלות המציגות הבדלים בריפוי פצעים. אנו יכולים לאפיין סטיות באיתות התא ותנועתיות ברקמה חיה.
