איסוף נתוני Cryo-EM של חלקיק יחיד עם הטיית במה באמצעות Leginon

הטיית שלב הדגימה מספקת דרך פשוטה וניתנת להכללה להגדלת התפלגות הכיוון של חלקיקים במהלך איסוף נתוני cryo-EM של חלקיק יחיד. הפיזור האחיד של החלקיקים המתקבלים כתוצאה מהטיה של שלב הדגימה מאפשר שיפור באיכות המפה הכוללת וביכולת הפרשנות. התחל על ידי יישור המיקרוסקופ כדי להבטיח הארה מקבילה של הדגימה ולמזער סטיות תרדמת.

כדי לזהות את הריבועים המתאימים לאיסוף נתונים, רשום אטלס רשת ללא הטיית במה או עם הטיית שלב, המספק סקירה כללית של איכות הרשת הכוללת ואינדיקציה ראשונית לאזורים מתאימים לאיסוף נתונים. בדוק את הריבועים באופן ידני בהגדלה המשמשת בצומת רכישת ריבועים. חפשו את הריבועים שבהם נייר הכסף שלם, אינו נראה מיובש ובעל עובי קרח אידיאלי, והזיזו את שלב הדגימה לריבוע מעניין.

קבע את הגובה האוצנטרי עבור מיקום הבמה באמצעות נדנוד אלפא בהטיית במה בסביבות 15 מעלות וכוונן את גובה Z כדי להביא את הבמה לגובה אאוצנטרי באמצעות לוח המקשים למיקרוסקופ. ודא שהיסט התמונה מינימלי במהלך שגרת נדנוד אלפא. כדי למצוא גובה Z מדויק יותר, הערך אותו בצומת המיקוד בהגדלה המשמשת בצומת רכישה ריבועית.

התאם את ההגדרות עבור צומת המיקוד והפעל או בטל את אפשרות המיקוד Z העדינה במהלך התור הראשוני של ריבועים. לאחר מכן לחץ על Simulate. הטה את שלב הדגימה לזווית ההטיה הרצויה לאיסוף נתונים בגובה האוצנטרי האמיתי ומרכז מחדש את הבמה במידת הצורך.

הקש Simulate בצומת הרכישה הריבועי כדי להתחיל להציב יעדים בתור עבור חשיפות שלמות של צומת רכישה. לאחר מכן, בחרו יעד מיקוד Z ואזורים עם חורים המתאימים לחשיפות להגדלה גבוהה והגישו את המטרות לתור להדמיה. החזירו את שלב הדגימה למצבו הבלתי מוטה ולאחר מכן עברו לריבוע הבא.

חזור על שלבים אלה עד למספר מספיק של חשיפות שלמות בתור. לאחר שכל הריבועים עומדים בתור, עבור אל צומת הפילוח כולו ולחץ על שלח יעדים בתור. בחר אפשר לאימות משתמש של יעדים נבחרים בהגדרות צומת ובדוק ידנית את המטרות שנבחרו על-ידי צומת רכישת החשיפה להגדלה גבוהה כדי לבדוק אם מאתר חורי ה- EM האוטומטי יכול לזהות במדויק את האזורים המתאימים לרכישת תמונה בעת הטיית שלב הדגימה.

לאחר שהמשתמש מרוצה מדיוק הפילוח, בטל את הבחירה באפשרות אפשר אימות משתמש של יעדים נבחרים לאיסוף נתונים אוטומטי. התמונות המייצגות של הרשת בהגדלה מרובעת עם זוויות הטיה שונות שנאספו קרוב ורחוק מגובה Z האיוצנטרי מוצגות כאן. מרכז הקרן מסומן על ידי מרכז הטבעות הקונצנטריות האדומות והחץ הירוק מציין את ריבוע העניין.

קיימת תכונת רשת שבורה הצמודה לריבוע העניין לצורך התייחסות. להלן החשיפות המייצגות לחורים וממוצעים דו-ממדיים שנאספו בזוויות הטיה של 0 מעלות, 30 מעלות ו-60 מעלות. למרות שריכוז החלבון אינו משתנה על פני זוויות ההטיה השונות, זווית הטיה גבוהה יותר גורמת לאזור המצולם להיראות צפוף יותר במונחים של ריכוז חלקיקים.

ממוצעי מחלקות דו-ממדיות המושפעים מצפיפות מוצגים בתיבה אדומה זו. פשטות הפרוטוקול מאפשרת לכל משתמש סטנדרטי במיקרוסקופ להתאים בקלות אסטרטגיית איסוף נתונים מוטה.