לכן, באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים לדמיין ציטונמות ברקמת עכבר קבועה לאורך כל העובר באמצעות מיקרוסקופיית אור סטנדרטית. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לחקור חלבוני איתות אנדוגניים הנעים לאורך ציטונמות, במקום להסתמך על מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית המשתמשים בחלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לטפל בעדינות בחתכי רקמות לשימור אופטימלי של ציטונמות.
מי שידגימו את ההליך הזה יהיו מרים דילארד, חוקרת ראשית בקבוצה שלי, וכריסטינה דאלי, סטודנטית לתואר שני בסנט ג'וד. כדי להתחיל, השתמש במספריים ומלקחיים לנתח כדי לבצע חתך Y לחלל הצפק. לבלות את הרחם המכיל עובר E 9.5.
לנתח את העוברים במדיום גדילה DMEM מלא. השתמש במלקחיים כדי להסיר את החלמון SAC, השליה, ואת הממברנות הסובבות. יש לשטוף את העוברים המבודדים ב-HBSS כדי להסיר כל רקמת מי שפיר ודם שיורית.
לאחר מכן, הכן את הקיבוע על ידי הוספת paraformaldehyde ל- HBSS עבור ריכוז עובד של 4% paraformaldehyde. הוסף מיליליטר אחד של פתרון זה לכל באר של צלחת 24 באר. מכניסים את העוברים לבארות בודדות.
לדגום את העוברים במשך 45 דקות עם תסיסה עדינה על נדנדה. לאחר הדגירה, מוציאים את הקיבוע ושוטפים את העוברים שלוש פעמים, למשך 30 דקות ב-PBS עם תוספת סידן, מגנזיום ו-0.1% טריטון. לאחר מכן דגירו את העוברים בתמיסת חסימה עם תסיסה עדינה פעמיים, במשך שעה כל אחד.
לאחר הדגירה השנייה, יש לשטוף את העוברים באמצעות תמיסת חסימה טרייה. בינתיים, הכינו את תמיסת הנוגדנים הראשונית על ידי דילול הנוגדנים בתוסף PBS. לאחר השלמת השטיפה, יש להסיר את תמיסת החסימה ולהוסיף מיליליטר אחד של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר.
דוגרים את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין במשך שלושה ימים. לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים, שטפו את העוברים בתוסף PBS חמש פעמים במשך שעה אחת על נדנדה ב-20 סל"ד. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תמיסת נוגדנים משנית לכל באר.
דוגרים את הצלחת עם נדנדה עדינה בארבע מעלות צלזיוס בחושך במשך שלושה ימים. הסר את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו את העוברים שלוש פעמים במשך 30 דקות בתוסף PBS. מכינים תמיסה של 4% לפי משקל של אגרוז נקודת התכה נמוכה ב-PBS עם סידן ומגנזיום.
במקביל, הניחו צלחת של 12 בארות באמבט החרוזים של 55 מעלות צלזיוס והוסיפו שלושה מיליליטרים של אגרוז לכל באר. לאחר מכן, הניחו את הצלחת על ספסל והעבירו את העוברים לבארות בודדות באמצעות כפית מחוררת. השתמשו בקצות פיפטה כדי להטמיע ולכוון בעדינות את העובר כך שהוא יהיה מרוכז בתוך התמיסה.
לאחר שהעוברים מכוונים, הניחו את הצלחת על מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לצורך התמצקות. לאחר מכן באמצעות אזמל, להסיר את כל בלוק agarose מן הבאר. חותכים גוש מלבני סביב העובר, ומשאירים כ-0.3 סנטימטרים של הבלוק בכל צד.
השאירו אורך נוסף של הבלוק לאורך הקצה הקאודאלי של העובר. כדי להרכיב את העובר על הוויברטום, תחילה להחיל רצועת סרט על מחזיק הדגימה. כיוונו את העובר במיקום זקוף בחלק העליון של הבלוק והדביקו את גוש האגרוז לקלטת, כך שהלהב יפיק מקטעים ציריים ברצף קדמי עד אחורי.
לאחר מכן, מלאו את תא הוויברטום ב-HBSS קר כדי לטבול את הדגימה במלואה ואז הקיפו את התא בקרח. הגדר את הפרמטרים על הוויברטום ובצע חתך צירי סדרתי של העובר. השתמש במלקחיים כדי להעביר חלקים בודדים למנה נפרדת מלאה ב- HBSS.
זכרו להשתמש במלקחיים להחזקת האגרוז בלבד כדי למנוע נזק לרקמות והרס של ציטונמים. כדי לבצע צביעת F-actin, הסר HBSS ודגרר את החלקים למשך 40 דקות עם תמיסת ActinRed ו- DAPI בתוספת PBS. לאחר הדגירה, לשטוף קטעים שלוש פעמים במשך 20 דקות בתוספת PBS.
בעזרת עט סמן הידרופובי, ציירו מחסום סביב הקצוות של שקופית מיקרוסקופ טעונה והוסיפו נפח קטן של HBSS לאזור המילוי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להעביר מקטעים לשקופית. הסר אגרוז עודף באמצעות מלקחיים.
לאחר שכל החלקים הועברו למגלשה, הסר עודפי נוזלים על ידי צנרת ושימוש בפינה של מגבת סופגת. לאחר מכן הוסף מספר טיפות של מדיום הרכבה לשקופית. הרכיבו את החלקת הכיסוי על ידי הנחתו בעדינות על המגלשה.
לצורך ניתוח, בצע הדמיה של חלקי הרקמה עבור מינימום של שלושה עוברים לכל גנוטיפ על קונפוקל או כל מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה. מקטעים מכוונים כהלכה שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מוצגים כאן. בהשוואה לחתך ויברטום, חתך קריוסטאט של הרקמה לא שימר את השלוחות התאית.
כמה מקטעי ממברנה חיוביים ל-GFP זוהו בין תאים של הנוטוכורד והתעלה העצבית, ובין תאי צינור עצביים סמוכים בקטעי קריוסטאט. עם זאת, צביעת F-אקטין של שלוחות תאיות בתאים המזנכימליים המקיפים את הצינור העצבי נפגעה בקטעי קריוסטאט. חתך הוויברטום הבטיח הפרעה מינימלית של חתכי עוברים שלמים ורקמות בודדות.
מקטעים שטופלו בצורה אופטימלית אפשרו זיהוי של ctyonemes בין תאי אפיתל עצביים של לוחות רצפה מקומיים סמוכים לבין תאים מזנכימליים. חלקים מקופלים או חבושים ניכרו בהפרדה גדולה בין הנוטוקורד לבין לוח הרצפה הגחונית של הצינור העצבי. ואובדן של הרחבות של קרום התא הנודדות בין תאי אפיתל.
למקטעים המוכתמים ב-F-אקטין וב-DAPI היה ריווח עקבי של תאים מזנכימליים וקטיונמים המקיפים את הצינור העצבי ואת הנוטוקורד. ייתכן שעיוותים קלים בחתכים גרמו לפיצול של הרחבות מבוססות אקטין ולפערים גדולים להיווצרות בין התאים, מה שמדגיש את הצורך בטיפול עדין. לאחר חתך העוברים, חובה למזער כל כיפוף או קיפול של חלקי רקמות.
כדי למנוע שבירת ציטונמים. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לדמיין באופן ישיר כיצד מולקולות איתות, כמו מורפוג'נים, מתפשטות על פני רקמות. זה נותן לנו תובנות חדשות על האופן שבו רקמות ואיברים מעוצבים.
