פרוטוקול זה יאפשר לחוקר לנתח עורקים מעניינים ולבודד תאי כלי דם כדי לבצע מגוון רחב של בדיקות תפקודיות. חוקר יכול לחקור מיטות כלי דם שונות וסוג תא כדי להרחיב את הידע בביולוגיה של תאי כלי דם ומנגנון של תפקוד לקוי של כלי הדם. שיטה זו ישימה ביותר לחוקרים החוקרים ביולוגיה בסיסית של תאי כלי הדם, כמו גם תפקוד לקוי של תאי כלי דם במודלים של מחלות בבעלי חיים.
יש לנקוט בזהירות מיוחדת כדי לייעל את פרוטוקול העיכול, במיוחד כאשר מיטות כלי הדם של עניין שונים מאלה שהוצגו כאן. כדי להתחיל, אבטח את העכבר באמצעות פיני נתיחה ורסס את משטח הגחון ב-70% אתנול. השתמש מלקחיים כדי להרים את העור ממש מעל איברי המין, ולעשות חתך קטן של כשני מילימטרים בעור.
מכניסים את קצה המספריים לאתר החתך, ומבצעים חתך בקו האמצע באורך של ארבעה עד חמישה סנטימטרים המתחיל בחתך הראשוני, וחותך בגולגולת לבסיס עצם החזה. בצע חתך של סנטימטר אחד המשתרע לרוחב מקו האמצע מיד מתחת לגפה הקדמית. בצע חתך אלכסוני של סנטימטר אחד בין הגפה האחורית לאיברי המין.
בצעו חתכים קטנים לאורך חתכים בעור בקו האמצע כדי לקלף את רקמת החיבור הקשורה, וחשפו את מחסן השומן התת עורי. זהה את רקמת השומן התת עורית בצורת C ואת העורק או הווריד העובר בניצב לחלל הבטן. התחל מתחתית צורת C ליד איברי המין, ותפס בעדינות את רקמת השומן כדי לחשוף את רקמות החיבור.
בצע חתכים קטנים ברקמת החיבור כדי להפריד את השומן מהעור, והימנע מהפרעה לכלי הדם החשופים. המשיכו לנתח את רקמת החיבור עד שניתן יהיה להסיר את רקמת השומן התת עורית בשלמותה. יש להפריד בזהירות את העורק החשוף מרקמת החיבור המקיפה אותו.
אחסנו את השומן התת-עורי המבודד במאגר HEPES על קרח. חזור על הדיסקציה עבור מחסן השומן התת עורי האחורי הנותר. כדי לבודד את מחסן השומן המזנטרי, השתמש במלקחיים Graefe כדי להרים את דופן חלל הצפק הדק מעל שלפוחית השתן, ולבצע חתך קטן באמצעות מספריים ישרים.
מרימים באיטיות את דופן חלל הצפק ומכניסים את מספריים הקשתית הישרה לאתר החתך. בצע חתך של ארבעה עד חמישה סנטימטרים משלפוחית השתן לעצם החזה. לאחר מכן בצע שני חתכים אופקיים של סנטימטר אחד כאשר מספריים הקשתית הישרים משתרעים לרוחב מקו האמצע עד מיד מעל הגפה האחורית ומתחת לגפה הקדמית.
השתמש מלקחיים Graefe כדי לקלף בחזרה את שרירי הבטן ולחשוף את הקרביים הצפק. השתמש זוג מלקחיים מספר חמש כדי להרים את המעיים מתוך חלל הקרביים כדי לחשוף את השומן המזנטרי. השתמשו במספריים המעוקלים ובמספר חמש מלקחיים כדי להפריד את השומן לאורך המעי הגס, החל מהצקום ועד למקום שבו המעי הגס יורד מהעין.
לאחר מכן, להפריד את השומן לאורך המעי הדק ללבלב. הסר חלק קטן של הלבלב כדי לבודד לחלוטין את השומן mesenteric. אחסנו את השומן המזנטרי המבודד במאגר HEPES על קרח.
כדי לבודד את העורקים, תחילה להעביר את רקמת השומן לצלחת ניתוח המכיל 10 מיליליטר של חיץ HEPES קר. תחת מיקרוסקופ סטריאו, מקם את רקמת השומן התת עורית כדי לחשוף את זוג הוורידים של העורק. מקמו את רקמת השומן הקרבית כדי לחשוף את צורת הכרובית ואת זוג ורידי העורק בהתאמה.
השתמש מספר 55 מלקחיים כדי להסיר בזהירות את השומן parenchymal מן העורק. הסר חתיכות קטנות של שומן בכל פעם מבלי לפגוע בכלי הדם של עניין. ממשיכים עד שהעורקים ריקים לחלוטין מרקמת שומן פרנכימלית.
השתמש במספר חמש מלקחיים כדי להעביר את העורקים הנקיים לצינור חדש עם חיץ HEPES טרי, ולשמור על קרח עד מוכן לעיכול. ראשית, הוסף מיליגרם אחד כל אחד של dispase ו elastase לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר. מוסיפים שני מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה, מערבולת, ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה.
השתמש במספר חמש מלקחיים כדי להעביר את העורקים הנקיים לצינורות הדגימה המתאימים. לדגור את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם תסיסה עדינה על ידי היפוך כל 10 עד 15 דקות. בינתיים, הוסיפו מיליגרם אחד של קולגן מסוג 1 לכל דגימה לצינורות חדשים.
לאחר הדגירה, לאפשר לעורקים להתיישב בתחתית הצינור ולהעביר 500 microliters של החיץ מלמעלה לתוך צינורות המכילים collagenase. מערבולת ולהחזיר פתרון זה לצינורות הדגימה בהתאמה. לדגור את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
ודא שהעורקים נפרדים לחתיכות בעת ניעור צינור הדגימה. באמצעות פיפטה זכוכית, במרץ triturate את הרקמה המעוכלת 10 עד 15 פעמים כדי לנתק מכנית את התאים. העבירו את הדגימות המעוכלות דרך מסננת תאים של 70 מיקרון או מסננת צינור ציטומטריה של זרימה כדי לקבל מתלים של תא בודד.
צנטריפוגה של מתלה התא הבודד ולהסיר את supernatant. השהה מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של PBS עם 5% BSA למשך 30 דקות. מוסיפים מיקרוליטר אחד של כתם כדאיות התא ודוגרים בחושך במשך 30 דקות.
צנטריפוגה של תלייה התא והשעיה מחדש של גלולת התא ב 200 מיקרוליטר של PBS עם 1% BSA. מוסיפים נוגדנים ראשוניים המצומדים ל-CD31 ו-CD45 ודוגרים על נדנדה במקרר למשך 15 דקות. שטפו את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS עם 1% BSA ישירות לתרחיף התא.
צנטריפוגה של מתלה התא ולהשעות מחדש את הכדור ב 200 microliters של 1% פורמלדהיד עם 0.1% BSA. מכסים את הצינורות ברדיד אלומיניום ומאחסנים במקרר עד שהם מוכנים לציטומטריה של זרימה. תכשירי תאים שהתקבלו מעורקי שומן תת-עוריים מעוכלים שימשו לזיהוי אוכלוסיות תאי האנדותל באמצעות ציטומטריה של זרימה.
תאים שליליים CD31 חיוביים CD45 זוהו כתאי אנדותל. כתם הכדאיות של התא איפשר לזהות רק את התאים בני הקיימא ששרדו את פרוטוקול הבידוד והעיכול לפני הקיבוע. כדי לזהות את ההבדלים בביטוי חלבוני הממברנה ובתאי האנדותל מכלי דם שונים של מחסן השומן, התאים המבודדים נבדקו עבור טרנסלוקאז של חומצת שומן CD36.
תאי אנדותל חיוביים ל-CD36 זוהו בשומן תת-עורי ומזנטרי. כימות ביטוי CD36 ותאי אנדותל תת-עוריים ומזנטריים גילה כי הן אחוז תאי האנדותל המבטאים CD36, והן עוצמת הביטוי של CD36 היו גבוהים יותר בתאי אנדותל תת-עוריים. חשוב מאוד לנתח, לזהות ולנקות את העורקים בזהירות.
והכי חשוב, פרוטוקול העיכול אמור לייצר תפוקה מספקת של תאים בני קיימא עבור יישומים במורד הזרם. לאחר הליך זה, אוכלוסיית התאים המבודדים יכולה לשמש ליישומים הכוללים, בין היתר, אלקטרופיזיולוגיה, פרופיל מולקולרי ויצירת קו תאים ראשוניים לבדיקת תרופות במבחנה.
