פרוטוקול זה מספק מודל ניתן לשחזור של דלקת ריאות היוצרת פגיעה חזקה וחריפה בריאות. יתרונות נוספים של מודל זה הוא שניתן להשתמש בו כדי לשחזר ARDS זיהומיות או תסמונת מצוקה נשימתית חריפה בעכברים. כפי שציינתי, מודל זה ניתן לשחזור רב שבו ניתן בקלות לדרג את רמת התמותה והפציעה כדי להעריך שלבים מוקדמים ומאוחרים של פגיעה ריאתית חריפה ופתרון, המשמש פלטפורמה להערכת אסטרטגיות טיפוליות.
למרות שפרוטוקול זה אינו מספק גישה חדשנית לאבחון או טיפול בפגיעה ריאתית, זהו מודל אמין שבו ניתן לבדוק טיפולים חדשים, שהוא שימושי במיוחד בתחומים הקשורים לאימונולוגיה, מחלות ריאה ומחלות זיהומיות. אחד היתרונות של טכניקה זו הוא יכולת השחזור שלה. עם זאת, אנשים המבצעים טכניקה זו בפעם הראשונה עלולים להיתקל בקשיים בהחדרת הצנתר תוך קנה הנשימה.
לכן באופן אידיאלי, אנשים הלומדים טכניקה זו צריכים להתחיל לתרגל בעלי חיים מורדמים. כדי להתחיל, לחמם צלחת אגר דם במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר מחומם או אינקובטור. מוציאים בקבוקון חדש של בקטריאל מהמקפיא ומפשירים אותו בתסיסה עדינה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד שהבקבוקון מופשר לחלוטין.
יש להימנע מלגעת בטבעת ה-O או במכסה במים חמימים. כדי לספור ידנית את מושבות החיידקים בצלחת, בצע דילול 1 פעמים 10 עד שש וצלחת 200 מיקרוליטר מהדילול האחרון על צלחת אגר דם שחומם מראש. דוגרים על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, לקבוע את ריכוז החיידקים החדש על ידי יישום נוסחה נתונה. הניחו את העכבר המורדם על משטח נקי ומעוקר. תלו את העכבר ליד החותכות והדביקו בעדינות את הגפיים הקדמיות.
יש לגלח את אזור הצוואר ולחטא את האזור עם כלורהקסידין ו-70% אלכוהול. לאחר מכן באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך צוואר של סנטימטר אחד, שטחי קו האמצע כדי לדמיין את קנה הנשימה. אם רואים שפע של רקמת שומן, לנתח בזהירות את רקמת השומן אנכית כדי לדמיין את קנה הנשימה.
משוך את הלשון החוצה בעדינות והכנס צנתר אנגיו 20 מד דרך הפה, מקדם את הצנתר לתוך קנה הנשימה. הפעל לחץ עדין על קנה הנשימה כדי להקל על אינטובציה. לאחר אינטובציה, חבר את העכבר למכונת הנשמה כדי לאשר אינטובציה.
הגדר את פרמטרי ההנשמה ל -200 מיקרוליטר נפח גאות ושפל ו -200 פעימות לדקה. לאחר אישור אינטובציה, לנתק את העכבר ממכונת ההנשמה בזהירות להחדיר 50 מיקרוליטר של סוכן חיידקי דרך קטטר אנגיו באמצעות פיפטה 200 מיקרוליטר, קצה העמסת ג'ל. לאחר ההתקנה, חבר שוב את העכבר למכונת ההנשמה כדי לסייע בהפעלה מחדש של הנשימה.
השאר את העכבר על מכונת ההנשמה למשך 30 עד 60 שניות כדי לפקח על הנשימה. אם נצפה דפוס נשימה איטית, חבר שוב את העכבר למכונת ההנשמה. סגור את החתך על ידי הוספת טיפה אחת של דבק לעור.
חברו יחד את קפלי העור והפעילו לחץ עדין עד שהדבק מתייבש. הניחו את העכבר המרדים על לוח ניתוחים נקי ותלו אותו על ידי החותכות. לאחר ריסוס עור העכבר עם אתנול 70%, באמצעות מספריים, לבצע כריתה קטנה, שטחית, קו האמצע הצוואר כדי לדמיין את קנה הנשימה.
לערבב את קנה הנשימה עם קטטר של 20 מד ולהוסיף בזהירות מיליליטר אחד של PBS ללא סידן תוך קנה הנשימה באמצעות מזרק של מיליליטר אחד. אפשר הרחבת ריאות מלאה, ולאחר מכן לשאוף את הנוזל באמצעות אותו מזרק. חזור על ההליך פעמיים עבור סך של שני מיליליטר.
מעבירים את שטיפת הסימפונות, או BAL, לתוך aliquot שני מיליליטר. באמצעות מספריים, לפתוח את חלל החזה כדי לחשוף את הריאה, הלב קנה הנשימה. בזהירות לנתח את הסרעפת ולהסיר את כלוב הצלעות להבטיח לא לצבוט את רקמת הריאה.
לחצות את אבי העורקים הבטני כדי לאפשר exsanguination. לנקב את רקמת הריאה על ידי ביצוע חתך קטן של כמילימטר עד שני מילימטרים בחדר הימני באמצעות מספריים והזרקת חמישה מיליליטר של PBS קר, באמצעות קטטר 20 מד. לאחר זילוח מוצלח, רקמת הריאה הופכת לבנה וחיוורת, וה- PBS עוזב את התא התוך כלי דרך אבי העורקים הבטן.
לאחר מכן בזהירות לחלץ את הריאה לנתח אותו מן קנה הנשימה. לחלופין, אם הריאה משמשת להיסטולוגיה, הכנס בזהירות קטטר של 20 מד כדי לנפח את הריאות עד 25 ס"מ עם תמיסת פורמלין. לאחר שהריאות אינן מנופחות, העבירו חוט תפר 3/O באורך של כחמישה סנטימטרים מתחת לקנה הנשימה וקשרו אותו בחוזקה פעמיים כדי להבטיח שהפורמלין יישאר ברקמת הריאה.
נתחו בעדינות את הריאה משאר הרקמות והניחו אותה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של תמיסת פורמלין. צנטריפוגו את ה-BAL ב-500 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות והוציאו את הסופרנאטנט נטול התאים בצינור נפרד. Lyse תאי הדם האדומים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חיץ lysing במשך דקה אחת.
נטרל את תגובת השקר על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS. צנטריפוגו את ה-BAL, והסירו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את הגלולה ב-100 עד 300 מיקרוליטר של PBS. לאחר מכן, בצע ספירת תאים עם כתם כחול של 0.4% טריפאן על ידי ספירת תאים אוטומטית.
נתחו בעדינות את הריאה מהרקמות בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של PBS קר. לאחר הנתיחה, הסר את הריאה מה- PBS וייבש אותה באמצעות מגבת נייר. לנתח את הריאה הימנית והשמאלית מרקמות אחרות שחולצו גם הן, כגון קנה הנשימה.
הכינו קוקטייל עיכול כמתואר בכתב היד של הטקסט והעבירו את הריאה לצינור C המכיל מיליליטר אחד של קוקטייל עיכול. העבר את הצינור למפזר הרקמה ופעל לפי הפרוטוקול הסטנדרטי לעיבוד רקמת הריאה. לאחר דיסוציאציה, להוסיף 10 מיליליטר של PBS קר לתוך הצינור ולערבב כראוי.
סנן את התרחיף החד-תאי באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרון על גבי צינור חרוטי של 50 מיליליטר על קרח. צנטריפוגר את המתלה והסר את הסופרנטנט. מוסיפים מילימטר אחד של חיץ שוכב למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של PBS קר כדי לעצור את תגובת השקר ולהסיר את הסופרנטנט. השהה מחדש את התאים ב- PBS ובצע ספירת תאים עם כתם כחול טריפאן על ידי ספירת תאים אוטומטית. לאחר פגיעה ריאתית חיידקית הנגרמת על ידי דלקת ריאות בעכברים, הקבוצות הנגועות הציגו משקל גוף נמוך יותר בהשוואה לקבוצת הביקורת שלא נדבקו.
קבוצת Streptococcus pneumoniae או Spn התאוששה ממשקל גופם לקראת נקודת ההתחלה, בעוד ש-Klebsiella pneumoniae, או עכברים נגועים ב-Kpn הציגו התאוששות איטית לאחר שישה ימי הדבקה. ריכוז חלבון BAL וספירת התאים הכוללת הן עבור BAL והן עבור הריאות היו גבוהים במידה ניכרת בקבוצות הנגועות. חתכים היסטולוגיים מייצגים המציגים את התהליך הדלקתי בשני המודלים התקבלו ביום השני, הרביעי והשישי לאחר החיסון והראו עדות לדלקת מכתשית מתמשכת בעכברים שנדבקו ב- Kpn, אפילו ביום העשירי.
עכברים שנדבקו ב-Kpn המשיכו את הפציעה עד היום ה-10, בעוד שעכברים שנדבקו ב-Spn פתרו את דלקת הריאות ביום השישי. נוף תאי חיסון על ידי ציטומטריית זרימה מרובת צבעים לאחר שישה ימים של זיהום Spn הראה מספר מוגבר של גרנולוציטים, מקרופאגים אינטרסטיציאליים, מונוציטים, תאי B ותאי T, כולל תאי הרג טבעיים. בעת ניסיון שיטה זו, החדרת הצנתר היא המפתח לזיהומים הניתנים לשכפול.
זוהי שיטה אמינה המשמשת פלטפורמה לזיהוי מטרות לחקר פגיעה ריאתית חריפה ופתרון.
