בהתחשב בכך שנוירון הנוציצפטור מפריש נוירופפטידים שונים ושתא NK ביטא את הקולטן לנוירופפטידים אלה, החלטנו להמציא שיטת תרבית משותפת כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תא ה-NK לבין תאי הנוירונים של הנוציצפטור. שיטה רדוקציוניסטית כזו יכולה להיות שימושית כדי לחקור כיצד נוירון nociceptor לשלוט על תפקוד אנטי סרטני של תא NK, וזה יכול להיות גם מעניין לחקור כיצד תא NK שולט על חיסול של נוירונים פצועים. מי שידגים את ההליך יהיה עלי אחמדי, סטודנט לתואר שני לשעבר מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל את ההרג הטבעי או בידוד תאים NK ותרביה, לאסוף את הטחול העכבר בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר המכיל 500 microliters של PBS סטרילי, ולאחר מכן הומוגניות הטחול באמצעות מזיק. לאחר מכן, לדלל את התאים עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי ולסנן את התערובת דרך מסננת תאים של 50 מיקרון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. טען את נפח ההומוג'נט המסונן ל-10 מיליליטר באמצעות PBS סטרילי.
לספור את התאים ב 10 microliters של הומוגנט מדולל באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה של התאים הנותרים במשך חמש דקות ב 500 G ולהסיר את supernatant. לאחר מכן יש להשעות את התאים ב-10 עד 8 תאים למיליליטר בתוספת RPMI 1640 בינונית.
לטהר באופן מגנטי את תאי הטחול NK באמצעות ערכת בידוד תאי NK של עכבר ולאשר את טוהר תאי NK באמצעות ציטומטריה של זרימה. סופרים את התאים באמצעות המוציטומטר, ואחריו צנטריפוגה בחמש דקות ב-500 גרם, ואז מסירים את הסופר-נאטנט. כדי לעורר את תאי ה-NK הכדוריים, יש להשעות את התאים הללו בתרבית RPMI 1640 בתוספת IL-2 ו-IL-15.
תרבית פעמיים 10 עד השישית תאי NK למיליליטר בצלחת U-bottom של 96 באר במשך 48 שעות. 24 שעות לפני גירוי תאי NK, מצפים את צלחת 96 הבאר עם 100 מיקרוליטר לכל באר של למינין ודגירה אותו במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הסר את התמיסה ואפשר לבארות להתייבש באוויר בארון הבטיחות הביולוגית.
לאחר מכן, אבטח את העכבר המומת על הלוח במצב נוטה. הרימו את העור וחתכו את העור לאורך העמוד הגבי. חותכים את המפרק המותני ומפרידים את העצה מעמוד השדרה המותני באמצעות מספריים.
לאחר מכן להפריד את עמוד השדרה על ידי חיתוך השרירים והצלעות משני הצדדים בכיוון הגולגולת עד בסיס הגולגולת הוא הגיע. השתמש מספריים כדי לחתוך את עמוד השדרה במפרק atlantooccipital. לאחר מכן, להסיר את השריר ואת רקמת השומן מן עמוד השדרה.
הצמד ופתח את עמוד השדרה כדי להסיר את חוט השדרה לפני קבלת גישה לשורש הגבי גנגליון או DRG בפורמינה הבין חולייתית המחוברת לחוט השדרה דרך השורש הגבי. לאחר מכן, קצרו את ה-DRGs לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר מלא ב-10 מיליליטר של DMEM קר כקרח. לאחר מכן צנטריפוגה את ההכנה במשך חמש דקות ב 200 G בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.
הוסף 250 מיקרוליטרים של PBS המכילים מיליגרם אחד למיליליטר קולגן IV ו -2.4 יחידות למיליליטר dispase II.דגירה של DRG זה עם תמיסת קולגן-דיספאז במשך 80 דקות עם תסיסה קלה. כדי להשבית את האנזימים, הוסיפו חמישה מיליליטרים של תוסף DMEM בינוני וצנטריפוגה של התמיסה ב-200 גרם.לאחר חמש דקות, הסירו בעדינות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה והשאירו כ-100 מיקרוליטרים של הסופר-נאטנט כדי למנוע אובדן תאים לא רצוי. לאחר מכן, הוסיפו מדיום DMEM של מיליליטר אחד לתאים והשתמשו באקדח פיפטה ובשלושה פיפטות פסטר מזכוכית בגדלים הולכים ופוחתים כדי להפוך בעדינות את ה-DRG להכנת תא אחד.
תוך כדי עבודה בארון בטיחות ביולוגית, יש לדלל אלבומין בסרום בקר או BSA ב-PBS סטרילי לריכוז סופי של 15% ולאחסן אליקוט מיליליטר אחד במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי ליצור שיפוע BSA בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, הוסף שני מיליליטר של PBS סטרילי ולאחר מכן החלק באיטיות מיליליטר אחד של תמיסה של 15% BSA בתחתית הצינור. הימנע מהפרעה לשיפוע על ידי הסרה עדינה של הפיפטה.
באמצעות פיפטה P200, הוסף את תרחיף הגרעינים המשולש המכיל את הנוירונים על צד הצינור לתוך השיפוע. לאחר מכן הגדר את ההאצה וההאטה למינימום כדי לצנטריפוגה של הנוירון המכיל את שיפוע BSA למשך 12 דקות ב 200 G.לאחר הצנטריפוגה, הסר את כל הסופרנטנט באמצעות פיפטה והשעה את התאים ב -500 מיקרוליטרים של Neurobasal. צלחת 10, 000 נוירונים לכל באר בצלחת תחתית שטוחה מצופה למינין 96 באר.
כדי לאפשר את ההתקשרות של הנוירונים, לדגור את צלחת 96 באר לילה ב 37 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בהתרבות משותפת, הסר באיטיות את הנוירובסל מתרבית הנוירונים. לאחר 48 שעות של גירוי עם IL-2 ו- IL-15, השהה את תאי ה- NK והוסף 10 לתאי ה- NK החמישי לכל באר לתרבית הנוירונים.
תרבית משותפת של התאים בתוספת Neurobasal MX בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 48 שעות, לאסוף ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS וצנטריפוגה אותם במשך חמש דקות ב 500 G בארבע מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant לפני מכתים את התאים עם אחד עד 1, 000 מדולל כדאיות צבע eFluor 780 במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לשטוף ולעשות צנטריפוגה של התאים כפי שהוכח, ולאחר מכן לטפל עם CD 1632 במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לחסום אתרים לא ספציפיים על התאים, ולאחר מכן לאסוף ולשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. לאחר המחזור הבא של שטיפה וצנטריפוגה, הכתימו את התאים ב-BV421, אנטי-NK-1.1, פלואורסצין איזותיוציאנט אנטי-NKp46, ופיקואריתרין אנטי-GM-CSF למשך 15 דקות. שוב, לאסוף ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS, צנטריפוגה אותם ולהשליך את supernatant, ולאחר מכן להשעות את התאים ב 500 microliters של חיץ FACS ואימונופנוטיפ תאי NK באמצעות ציטומטריה זרימה.
כאשר תרבית לבדה, תאי NK ביטאו רמות בסיסיות של גורם מגרה מושבת גרנולוציטים מקרופאגים או GM-CSF ו- NKp46. כאשר תרבית משותפת עם נוירוני DRG שנקטפו מעכברים שלמים של nociceptor, גירוי קפסאיצין הפחית את הביטוי של תאי NK של GM-CSF. לקפסאיצין לא הייתה השפעה על פעילות תאי NK כאשר הוא תרבית יחד עם נוירוני DRG שנקטפו מעכברים אבלטים של nociceptor.
הרמה של NKp46 לא הושפעה. השלבים המרכזיים בפרוטוקול זה הם הדיסוציאציה והבידוד של DRG. הרעיון הוא לשמור על כדאיות עצבית מקסימלית על ידי הימנעות מיצירת בועות ושימוש בפיפטה בגודל הנכון.
לאחר הפרוטוקול, החוקרים יכולים להשתמש בריצוף RNA או qPCR כדי למדוד שינוי תעתיק בתאים מטוהרים של FACS, או שהם יכולים להשתמש ב- ELISA כדי למדוד את הפרשת הציטוקינים או הנוירופפטידים. יחסי גומלין כאלה מגלים כי תפקוד תאי NK ככל הנראה מכוון על ידי נוירון nociceptor. וההצלבה הזו עשויה להיות חשובה בתהליכים ביולוגיים המשתרעים מפגיעה עצבית, זיהום חיידקי וויראלי, ועד ממאירויות.
