בדיקת 6-Plex ECL החדשה היא בדיקת המולטיפלקס הראשונה שאומתה ומיושמת כעת בניסוי קליני לסינון אוכלוסייה כללית. הוא משלב בו זמנית שישה מבחני נוגדנים עצמיים המתאימים לבדיקת סוכרת מסוג 1, מחלת צליאק וקורונה באוכלוסייה גדולה. בהשוואה לבדיקת הנוגדנים העצמיים הסטנדרטית הנוכחית, טכניקה זו יכולה לסנן ביעילות רבה יותר נוגדנים עצמיים מרובים עבור מספר מחלות אוטואימוניות בו זמנית.
המשמעות של טכניקה זו תהפוך את ההקרנה בקנה מידה גדול לאפשרית יותר וספציפית למחלה, ותוביל לחיזוי מוקדם של המחלה למניעה ולאבחון מדויק יותר לטיפול. כדי להתחיל, הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של GAD65 שעבר ביוטינילאטציה, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 וחלבון אנטיגן פרואינסולין לצינור המכיל 156 מיקרוליטרים של 1% BSA וערבבו עם 240 מיקרוליטרים של מקשרים מצומדים מקבילים של סטרפטאווידין, 1, 2, 3, 8, 9 ו-10. לאחר מכן, לדגור את התערובת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
Aliquot 160 microliters של תמיסת עצירה לתוך כל צינור לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. עכשיו, לקחת 400 microliters של פתרון תערובת מכל צינור ולשלב אותם יחד. הוסיפו לתערובת ארבעה מיקרוליטרים של GAD65 עם תווית רותניום, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 ואנטיגן פרואינסולין.
לאחר מכן, הוסף 1.6 מיליליטר של תמיסת עצירה ו -3.2 מיליליטר של PBS. מערבבים היטב את כל הרכיבים. ועכשיו, פתרון האנטיגן מוכן לשימוש בבדיקה.
עבור צלחת PCR של 96 באר, aliquot שבעה מיקרוליטר של סרום לכל באר ולכסות את הצלחת עם סרט איטום. לאחר מכן, מחממים את הסרה ב-56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על מכונת PCR ומנצלים לזמן קצר את הצלחת ב-100 פעמים G למשך דקה אחת. מוסיפים 63 מיקרוליטרים של תמיסת אנטיגן מוכנה לכל באר, מערבבים עם הסרה, ומכסים את צלחת ה-PCR ברדיד אלומיניום כדי למנוע אור.
נערו את הצלחת על שייקר במהירות של 450 סל"ד למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. ואז, לדגור את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך 18 עד 24 שעות. קחו צלחת 6-Plex מהמקרר בארבע מעלות צלזיוס, כדי לאפשר לצלחת להגיע לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטרים של 3% חוסם A לכל באר של צלחת 6-Plex. מכסים את הצלחת בנייר כסף כדי למנוע אור. מחזירים את הצלחת למקרר של ארבע מעלות צלזיוס ודוגרים למשך הלילה.
בסוף הדגירה, לאחר הסרת הצלחת מהמקרר, להסיר את כל החיץ מהצלחת. טפחו את הצלחת על מגבות הנייר לייבוש, ושטפו אותה שלוש פעמים עם 150 מיקרוליטר של חיץ כביסה לכל באר. ייבשו את הצלחת על מגבת הנייר ו-30 מיקרוליטרים של אנטיגן בסרום דוגרים מכל באר של צלחת ה-PCR הדוגרה למשך הלילה לשתי בארות של צלחת ה-6-Plex.
מכסים את הצלחת בנייר כסף, ואז מניחים את הצלחת על שייקר צלחת ומנערים במהירות של 450 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך שעה. השליכו את התמיסה הקיימת בצלחת 6-Plex ושטפו את הצלחת שלוש פעמים עם 150 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה נתרן כלורי 0.4 M לכל באר. לאחר השלמת הכביסה השלישית, ייבשו את הצלחת כנגד מגבת הנייר והוסיפו 150 מיקרוליטרים של חיץ קריאה לכל באר.
הרמות של שישה נוגדנים עצמיים עבור GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA ו- COVID-19A מבדיקת ECL 6-Plex היו מתואמות היטב עם ששת בדיקות ה- ECL היחידות המקבילות שלהם, ובדיקת קשירת הרדיו הסטנדרטית הנוכחית. ערכי המדד עבור כל דגימה עבור כל ששת הנוגדנים חושבו כנגד הבקרות החיוביות והשליליות המתאימות. נצפה ערך מדד גדול מערך הניתוק, שהצביע על תוצאה חיובית.
נוגדנים עצמיים בסרום הפרו את האנטיגן המסומן רותניום לאנטיגן הביוטינילציה, ויצרו קומפלקס עם מקשר ספציפי לבניית פלטפורמת ריבוב. טקטיקה זו הופכת את ההקרנה בקנה מידה גדול לאפשרית ויעילה יותר באוכלוסייה הכללית עבור סוכרת מסוג 1 ומחלות נלוות, מה שמוביל לחיזוי מוקדם ומניעה של המחלות.
