Le nouveau test ECL 6-Plex est le premier test multiplex validé et maintenant appliqué en essai clinique pour le dépistage dans la population générale. Il combine simultanément six tests d’autoanticorps adaptés au dépistage du diabète de type 1, de la maladie cœliaque et de la COVID-19 dans une large population. Par rapport au test d’autoanticorps standard actuel, cette technique peut dépister plus efficacement plusieurs autoanticorps pour plusieurs maladies auto-immunes simultanément.
L’implication de cette technique rendra le dépistage à grande échelle plus réalisable et spécifique à la maladie, conduisant à une prédiction précoce de la maladie pour la prévention et à un diagnostic plus précis pour la thérapie. Pour commencer, ajoutez quatre microlitres de GAD65 biotinylé, de SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 et de protéine d’antigène proinsulinique dans un tube contenant 156 microlitres de BSA à 1% et mélangez avec 240 microlitres de liants conjugués à la streptavidine correspondants, 1, 2, 3, 8, 9 et 10. Ensuite, incuber le mélange pendant 30 minutes à température ambiante.
Aliquote 160 microlitres de solution stop dans chaque tube et incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. Maintenant, prenez 400 microlitres de la solution de mélange de chaque tube et combinez-les ensemble. Ajoutez quatre microlitres de GAD65 marqué au ruthénium, de SARS-CoV-2 RBD, d’IA-2, de tTG, de ZnT8 et d’antigène proinsulinique au mélange.
Ensuite, ajoutez 1,6 millilitre de solution d’arrêt et 3,2 millilitres de PBS. Bien mélanger tous les composants. Et maintenant, la solution antigénique est prête à être utilisée dans le test.
Pour une plaque PCR à 96 puits, aliquote sept microlitres de sérum par puits et recouvrir la plaque d’un film d’étanchéité. Ensuite, préchauffez le sérum à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes sur une machine de PCR et centrifugez brièvement la plaque à 100 fois G pendant une minute. Ajouter 63 microlitres de solution d’antigène préparée par puits, mélanger avec le sérum et couvrir la plaque PCR avec une feuille d’étanchéité pour éviter la lumière.
Secouer la plaque sur un shaker à une vitesse de 450 tr/min pendant deux heures à température ambiante. Et puis, incuber la plaque à quatre degrés Celsius pendant 18 à 24 heures. Prenez une assiette 6-Plex du réfrigérateur à quatre degrés Celsius, permettant à la plaque d’atteindre la température ambiante.
Ensuite, ajoutez 150 microlitres de 3%Blocker A à chaque puits de la plaque 6-Plex. Couvrir la plaque avec du papier d’aluminium pour éviter la lumière. Remettez l’assiette dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius et incuber pendant la nuit.
À la fin de l’incubation, une fois la plaque retirée du réfrigérateur, retirez tout le tampon de la plaque. Tapotez l’assiette sur les serviettes en papier pour sécher et lavez-la trois fois avec 150 microlitres de tampon de lavage par puits à chaque fois. Sécher la plaque sur la serviette en papier et aliquoter 30 microlitres d’antigène sérique incuber de chaque puits de la plaque de PCR d’incubation nocturne dans deux puits de la plaque 6-Plex.
Couvrir la plaque avec du papier d’aluminium, puis mettre la plaque sur un agitateur à plaques et agiter à une vitesse de 450 tr / min à température ambiante pendant une heure. Videz la solution présente dans la plaque 6-Plex et lavez la plaque trois fois avec 150 microlitres de tampon de lavage au chlorure de sodium 0,4 M par puits. Une fois le troisième lavage terminé, séchez l’assiette contre la serviette en papier et ajoutez 150 microlitres de tampon de lecture dans chaque puits.
Les niveaux de six autoanticorps contre GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA et COVID-19A du test ECL 6-Plex étaient bien corrélés avec leur test ECL unique correspondant et le test standard actuel de liaison radiologique. Les valeurs indicatrices pour chaque échantillon pour les six anticorps ont été calculées par rapport aux témoins positifs et négatifs correspondants. Une valeur d’indice supérieure à la valeur seuil a été observée, ce qui indique un résultat positif.
Les autoanticorps dans le sérum ont violé l’antigène marqué au ruthénium à l’antigène biotinylé, formant un complexe avec un agent de liaison spécifique pour construire une plate-forme de multiplexage. Cette tactique rend le dépistage à grande échelle plus réalisable et plus efficace dans la population générale pour le diabète de type un et les maladies concomitantes, conduisant à la prédiction précoce et à la prévention des maladies.
