פרוטוקול זה משמעותי בשל הפשטות של פלטפורמת חיישני TGT המשמשת לחקר הצלבת EGFR-integrin והשפעתה על הכוחות המכניים של התא. ראו התווה לחקור את הוויסות התלוי ב-EGF של מכניקת התאים. הפרוטוקול ניתן להתאמה עבור ליגנדות שונות, סוגי תאים, פרדיגמות גירוי, וניתן להצמיד אותו ל-TGTs בעלי סף מתח משתנה.
סינתזת פני השטח עשויה להיראות מאיימת בהתחלה. המפתח הוא להיות מוכן ומאורגן כדי לבצע במדויק את השלבים המורכבים על ידי שימוש ברשימת תיוג להכנת ריאגנט וחישובים. ביום הראשון, מניחים עד שמונה כיסויי זכוכית בקוטר 25 מ"מ מחליקים לתוך מתלה פוליטטראפלואורואתילן.
הניחו את המדף בכוס בורוסיליקט 50 מיליליטר המכילה 40 מיליליטר של אתנול עמיד בפני 200 איש. Sonicate בתדר הפעלה של 35 קילוהרץ במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. מלאו של 50 מיליליטר ב-40 מיליליטר של תמיסת פיראנה שהוכנה זה עתה על ידי ערבוב חומצה גופרתית ומי חמצן ביחס של 3:1 בכוס Pyrex וערבוב עם פיפטה מזכוכית.
מעבירים את מתלה החלקת הכיסוי לתוך הכוס ומדגרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במכסה האדים כדי לחרוט את משטח החלקת הכיסוי. לאחר התחריט, העבירו את מתלה החלקת הכיסוי לכוס עם מים אולטרה-אפורים עם פינצטה. בדקו באופן חזותי את תלושי הכיסוי כדי לוודא שהמשטחים נראים נקיים ללא דפוסים או חלקיקי אבק על פני השטח של הזכוכית.
מעבירים את מתלה החלקת הכיסוי לכוס עם אתנול עמיד בפני 200 ושוטפים פעמיים למשך 15 שניות כדי ליישר את המשטחים לממס אורגני. העבר את מתלה החלקות הכיסוי לתמיסת אתנול חסינת 200 עם 3% APTES למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להסלף את תלושי הכיסוי. טבלו את המדף בכוס נקייה עם תמיסת אתנול חסינת 200.
ייבשו את החלקות הכיסוי באמצעות גז חנקן בלחץ יציאה נמוך. מניחים את הכיסוי מחליק לתוך צלחת פוליסטירן באורך 10 ס"מ עם פיסת סרט פאראפין מונחת שטוחה בתוכה. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של שני מיליגרם למיליליטר תמיסת NHS-ביוטין ב-DMSO לארבעה תלושי כיסוי המונחים על סרט פרפין.
הניחו כריך עם ארבעת החלקות הכיסוי האחרות למעלה, כאשר שתי החלקות כיסוי פונות זו לזו עם תמיסת הפונקציונליזציה באמצע. ביום השני, מוציאים את המנה מארבע מעלות צלזיוס ומפרידים את תלושי הכיסוי הסנדוכים. יש להימנע מגירוד או פגיעה במשטח המתפקד בעת הפרדת הכריך.
לאחר מכן, כיוונו את החלקות הכיסוי במדף כאשר המשטח המצופה פונה זה לזה. יבש עם גז חנקן. מניחים את הכיסוי בצלחת חדשה עם סרט פאראפין בתוכו.
הוסיפו 800 מיקרוליטרים של אלבומין סרום בקר 0.1% ב-1X PBS לכל עטיפה. דגירה של החלקות הכיסוי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי להעביר את פני השטח ולחסום קשירה לא ספציפית של ריאגנטים פונקציונליים הבאים. כדי לתפקד את תלושי הכיסוי, הוסיפו 800 מיקרוליטרים של מיקרוגרם אחד למיליליטר של סטרפטווידין ב-1X PBS בטמפרטורת החדר למשך 45 עד 60 דקות.
הרכיבו את בדיקות ה-TGT בצינור PCR באמצעות תרמוציקלר. לאחר הדגירה, לשטוף את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם 1X PBS. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של בדיקות ה-TGT שהורכבו מראש לארבעה תלושי כיסוי והכינו סנדוויצ'ים באמצעות ארבעת החלקות הכיסוי הנותרות כאשר הצד הפונקציונלי פונה לגשושיות.
מכסים בנייר אלומיניום. לאחר הדגירה, הפרידו את הכריכים ושטפו את תלושי הכיסוי עם 1X PBS שלוש פעמים. הרכיבו בזהירות את החלקות הכיסוי לתוך תאי הדמיה מנוקים מראש.
כדי לחקור את ההשפעה של גירוי גורם הגדילה האפידרמלי על מכניקת Cos-7, הידבקות והתפשטות תאים, נסה את השימוש בתאי Cos-7 עם 0.05% טריפסין-EDTA למשך שתי דקות. נטרלו את הטריפסין על ידי שטיפה עם HBSS וצנטריפוגה ב-800 גרם למשך חמש דקות. תאי צלחת בצפיפות של 40, 000 תאים על משטחי ה-TGT המורכבים ב-DMEM בתוספת 50 ננוגרם למיליליטר EGF או DMEM ללא EGF.
לאחר הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1X PBS. יש לתקן עם שני מיליליטרים של 4% פרפורמלדהיד במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את החלקות הכיסוי חמש פעמים עם PBS 1X במרווחים של חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לחלופין, דגירו את תלושי הכיסוי עם אמוניום כלוריד 50 מילימולרי ב-1X PBS למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים חיץ A ומניחים את תאי ההדמיה עם החלקות כיסוי במיכל לחות. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לחסום ולחלחל את התאים.
דיללו את הנוגדן העיקרי נגד פקסילין ב-1:250 דילולים במאגר החסימה. דגירה עם 200 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים ראשונית לתלוש כיסוי למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. סמן את התאים בו-זמנית עם תערובת של נוגדן משני עז/אנטי-ארנב מצומד בשעה 1:800 דילול ופאלואידין מצומד בשעה 1:400 דילולים ב-200 מיקרוליטרים של חיץ חוסם לכל החלקת כיסוי.
שטפו את המשטחים חמש פעמים עם 1X PBS במרווחים של חמש דקות. כדי להתחיל, להוסיף שמן למטרה, לנקות את החלקה כיסוי התחתון של תא הדגימה, ולהניח את הדגימה על הבמה. התמקדו בתא והתמקדו באופן מושלם.
יישרו את ה-RICM על ידי סגירה ומרכוז של הסרעפת עם מפתח הצמצם epi-illumination. מקד את הלייזר 488 ננומטר לנקודה קטנה בתקרת החדר והגדיל את זווית ההיארעות עד מעבר לזווית הקריטית, תוך ניטור פלואורסצנטיות במצלמה במצב חי. שימו לב לירידה חדה בפלואורסצנציה ברקע ובמישור מיקוד יחיד כאשר הזווית הקריטית עולה עליה.
זהה תאים להדמיה באמצעות המצב החי של המצלמה באמצעות RICM. רכשו את תמונות ה-RICM וה-TIRF של אקטין בעירור של 488 ננומטר, מתח אינטגרין בעירור של 561 ננומטר, ופקסילין בעירור של 647 ננומטר. השג תמונות ברצף באמצעות זמן חשיפה של 200 אלפיות השנייה.
החליפו את תלושי הכיסוי, התמקדו וחזרו על הפעולה. תאי Cos-7 צופו על משטח TGT זה עם או בלי גירוי EGF כדי לחקור את ההשפעה של הפעלת EGFR עם גירוי ליגנד על מכניקת האינטגרין. אם אינטגרין קושר את הליגנד ומפעיל כוח גדול יותר מסך סף המתח של הבדיקה, דופלקס הדנ"א ייפרד, מה שיוביל לפלואורסצנציה.
כל גשושית TGT שכוח מכני לא נקרע תישאר לא פלואורסצנטית. התאים דוגרו עם או בלי EGF על משטחי ה-TGT במשך 60 דקות, תוקנו וטופלו באופן חיסוני כדי להציג את התפלגות ההדבקה המוקדית ואת ארגון השלד של הציטוסקלטון. בתמונת ה-RICM, התפשטות תאי Cos-7 על פני השטח של 56-piconewton TGT שופרה באופן משמעותי עם גירוי EGF בהשוואה ללא גירוי.
גירוי עם EGF הביא למורפולוגיה מעגלית יותר, המייצגת את התפשטות תאי Cos-7 וגדלים. הפלואורסצנציה מבדיקות פתוחות גבוהה יותר גם עם גירוי EGF, כפי שנצפה בתמונת הפלואורסצנציה של המתח. העוצמה המשולבת של בדיקות פתוחות פרופורציונלית למספר הגשושיות הפתוחות הייתה גבוהה בהרבה עם גירוי EGF מאשר ללא גירוי.
זכרו תמיד את הכיוון של החלקות הכיסוי, תוך שמירה על המשטח המתפקד פונה כלפי מעלה. כאשר מפרידים את הכריך, היו עדינים כך שהמשטח לא נשרט או ניזוק. לאחר סינתזת פני השטח, ניתן לחקור חלבונים ציטופלסמיים המווסתים את הידבקות התא או את ההתמרה המכניקה.
זה מאפשר זיהוי של מולקולות איתות במורד הזרם המעורבות בתיאום מכניקת התאים בקרום הפלזמה.
