פרוטוקול זה הוא משמעותי כפי שהוא מאפשר להבהיר את התפקיד כוחות הסלולר לשחק בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון ריפוי פצעים גרורות סרטן, למשל. היתרון העיקרי של טכניקה מבוססת מכניקה זו הוא יכולתה לשבש בו זמנית צמתים של תאים ולמדוד את השפעתה על כוחות מכניים שנוצרו על ידי תאים, בעיקר מתיחה ומלחצים בין תאיים. הפרוטוקול שלנו ישים על מגוון רחב של תהליכים פתופיזיולוגיים, כגון גרורות סרטן, טרשת יותרת המוח, יתר לחץ דם, למשל.
ניתן לשלב את השיטות שלנו לביצוע ניתוח ביוכימי וביומכני עם מודלים של איברים על שבבים, מבני רקמות מהונדסים ביולוגית, מערכות אספקת תרופות במבחנה ומערכות תרבות-רקמות. הפרוטוקול שלנו הוא די פשוט לבצע. עם זאת, אנו ממליצים לאלה שעושים פרוטוקול זה בפעם הראשונה יש סבלנות ולא למהר דרך השלבים של פרוטוקול זה.
הפרוטוקול שלנו כולל שלבים ייחודיים שעשויים שלא להיות ברורים למשתמשים בפעם הראשונה. לכן, אנו מעודדים את המשתמשים לפעול בהתאם לנהלים הכתובים שלנו צעד אחר צעד ולהשתמש בהדגמות חזותיות כהדרכה. כדי להתחיל, להכין פתרון עיוור-סילאן על ידי ערבוב 200 מיליליטר של מים טהורים במיוחד עם 80 microliters של חומצה אצטית ו 50 microliters של סילאן מתאקרילאט.
מערבבים את תטגם Bind-silane על צלחת ערבוב במשך שעה אחת לפחות. יש לטפל היטב במרכזה של צלחת פטרי עם פתרון Bind-silane למשך 45 דקות. מוציאים את תסנון ה-Bind-silane ושטיפת צלחת פטרי במים טהורים במיוחד פעמיים עד שלוש פעמים.
יבש את משטח צלחת פטרי ולאחסן בטמפרטורת החדר לשימוש עתידי. כדי להכין את פתרון הידרוג'ל, יש לערבב 12.49 מיליליטר של מים טהורים במיוחד ל-2.062 מיליליטר של 40% אקרילאמיד ו-375 מיקרוליטר של 2%bisacrylamide בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. הוסיפו 80 מיקרוליטרים של גם גם פדילי פלורסנט לתספורת ההידרוגל.
בעדינות לנער את הצינור כדי לערבב את חרוזים עם פתרון ג'ל. שמור את הכובע רופף על צינור הצנטריפוגה ולמקום אותו בתא ואקום. דה גז פתרון הג'ל לפחות 45 דקות בתא ואקום.
כדי להפוך את ההידרוג'ל לפילמור, הוסיפו תחילה 75 מיקרוליטרים של 10% אמוניום פרסולפט ולאחר מכן הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של TEMED לתתסמת ההידרוגל. מניחים 24 מיקרוליטרים של פתרון הידרוג'ל במרכז צלחת פטרי. לחץ על הידרוג'ל עם להחליק כיסוי 18 מילימטר כדי לשטח את הידרוג'ל ולעשות גובה של כ 100 מיקרומטר.
המתן לפחות 30 עד 40 דקות לפולימריזציה של ג'ל. תטביעו את ההידרוגל המפולמר במים טהורים במיוחד כדי למנוע התייבשות ג'ל. מכסים את צלחת פטרי בנייר אלומיניום כדי למנוע פוטובלאצ'ים של חרוזים פלואורסצנטיים ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס.
ראשית, מערבבים את בסיס הסיליקון PDMS עם סוכן ריפוי הסיליקון ביחס של 20 לאחד בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. הפוך את הצינור במהופך ורעד במרץ מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב נכון של פתרון PDMS. הסר את הבועות בתסכת PDMS על ידי צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 190 פעמים G.Pour חמישה עד שישה מיליליטר של פתרון PDMS במרכז צלחת פטרי 100 מילימטר להתסיס את המנה עד פתרון PDMS מכסה את כל משטח צלחת פטרי.
לרפא את פתרון PDMS לילה ב 50 עד 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר סטנסיל PDMS מעגלי בקוטר 16 מ"מ עם מחץ חורים. השתמש בניקוב ביופסיה בקוטר 1.25 מילימטר כדי ליצור חורים קטנים בסטנסיל PDMS.
סטרילייז PDMS stencils על ידי טבילת אותם 70%אתנול במשך שתיים עד שלוש דקות, שאפתן את אתנול עודף ולאחר מכן הצבת תחת אור UV במשך חמש דקות. שאף כל נוזל עודף והסר את החלקת המכסה מההידרוג'ל. מניחים את סטנסיל PDMS על פני השטח הידרוג'ל ולהשתמש פינצטה כדי להפעיל לחץ אור על סטנסיל PDMS כדי להבטיח חותם אטום מים הדוק בין סטנסיל PDMS משטח הידרוג'ל.
לכסות את פני השטח של הידרוג'ל עם Sulfo-SAMPA מומס 0.1 פתרון חיץ HEPES טוחן בריכוז של אחד עד 1, 000 ולמקום הידרוג'ל תחת מנורת UV עם כוח של 36 וואט במשך שמונה דקות. שאפו את פתרון ה-Sulfo-SAMPA וה-HEPES העודף ושטוף את ההידרחון פעמיים עם 0.1 HEPES טוחן ואחריו שתי שטיפות נוספות עם מים טהורים במיוחד. שאפו עודפי מים טהורים במיוחד ולהשתמש פיפט 200 מיקרוליטר כדי לצפות את הידרוג'ל עם 0.1 מיליגרם למיליליטר של קולגן-1.
מכסים את המנה כדי להגן על החרוזים הפלואורסצנטיים מפני פוטובלאצ'ים ולאחסן את ההידרוגל בארבע מעלות צלזיוס בן לילה. עכשיו, להוסיף שלושה מיליליטר של 1X טריפסין לתוך הבקבוק ולמקם אותו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות כדי לנתק את התאים מבקבוק תרבות הרקמה. לאחר טריפסיניזציה, מוסיפים שלושה מיליליטר של מדיה לתרבות התאים לתוך הבקבוק, מסתחררים כדי לערבב, ולהעביר את התערובת לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.
צנטריפוגה פתרון התא במשך שלוש דקות ב 1, 710 פעמים G.Aspirate supernatant מחדש להשעות את התאים במדיה לריכוז של 50 פעמים 10 לארבעה תאים למיליליטר. מוציאים את צלחת ההידרוגל מהמקרר. מוציאים את הקולגן-1 מההידרוגל ושטיפת פעם אחת עם PBS.
הוסף 75 פעמים 10 לתאים השלישיים לראש סטנסיל PDMS ולאפשר לתאים לצרף את פני השטח הידרוג'ל לפחות שעה אחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. הסר את הסטנסיל PDMS וטביעת הסטנסיל PDMS ב טריפסין 10X למשך 10 עד 15 שניות כדי להסיר תאים מחוברים. מוסיפים לפחות שני מיליליטר של מדיה לצלחת פטרי ומעקרים את הסטנסיל על ידי ריסוס עם 70% אתנול, ולאחר מכן מניחים תחת אור UV במשך חמש דקות.
מניחים את צלחת פטרי באינקובטור לפחות 36 שעות, או עד מונולייזר confluent הוא ציין. תמונות ניגודיות פאזה של 30 דקות לפני הטיפול chalcone ו שעתיים לאחר הטיפול chalcone הושוו. תזוזות חרוזים הנגרמות על ידי התא נצפו כדי להקטין הן chalcone במינון נמוך ותנאי chalcone במינון גבוה בהשוואה לשליטה HUVEC monolayers.
לפני טיפול chalcone, המתיחה RMS היו סביב 51 פסקל עבור כל התנאים. לאחר טיפול chalcone, חלה עלייה קטנה המתיחה RMS ל 59 פסקל במינון נמוך chalcone מטופלים monolayers וירידה כמעט כפולה במתיחה RMS ל 18 פסקל במינון גבוה chalcone מטופלים monolayers לעומת הבקרה. טיפול Chalcone גדל סדר הגודל הממוצע נורמלי מתח בין תאי עם מינון נמוך, אבל ירד באופן משמעותי את גודל הלחץ הבין תאי הנורמלי הממוצע עם מינון גבוה בהשוואה לשליטה.
הטיפול בצ'לקוניה גם הפחית את הלחצים הבין-תאיים המרביים בריכוז זיכרון נמוך וגבה בהשוואה לשליטה. ההשפעה של טיפול chalcone היא מובהקת סטטיסטית מבוסס על שני T-בדיקות ומבחן ANOVA גורם יחיד. בזמן הנחת סטנסיל PDMS על גבי הג'ל, ודאו שהג'ל יבש מספיק כדי להבטיח איטום הדוק למים בין סטנסיל PDMS לג'ל.
פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם כדי לחקור את התרומה הביומכנית של מגוון של צמתים תאים, חלבונים cytoskeletal, מולקולות הידבקות מטריצת התא, או מולקולות חוץ תאיים עם הדמיה חיה. עם פרוטוקול במבחנה זה, החוקרים יכולים כעת לחקור בהצלחה שורה של תכונות ביומכניות, כמו גם ביוכימיות במהלך תיקון רקמות, ריפוי פצעים, או גרורות סרטן ללא מודל בעלי חיים. אנו ממליצים לצופים שלנו להיות זהירים מאוד בעת טיפול chalcone ו DMSO כמו שאיפה של תרופות אלה הוא דיווח להיות מזיק.
