פרוטוקול זה מתאר כיצד ציאנובקטריום נימה השייך למתנדים יכול להשתנות על ידי טרנספורמציה טבעית. הוא גם מראה כיצד ניתן לחקור סוגים שונים של תנועה. טרנספורמציה טבעית היא טכניקת הטרנספורמציה הפשוטה ביותר, אם היא עובדת.
רק דנ"א, תאים ואמצעי גדילה נדרשים. עד כה, אף חבר אחר במערכת המתנדים לא יכול היה להשתנות על ידי טרנספורמציה טבעית. אנו מקווים שהמחקרים שלנו יעוררו קבוצות אחרות לנסות תנודות אחרות.
לשם שינוי, הכינו תרבות טובה ובריאה למראה והכנת דנ"א טובה. עבור מחקרי תנועה, השתמש תמיד בתרבית שטופלה באולטרסאונד. הטיפול צריך להיות טרי.
מי שתדגים את ההליך תהיה נורה ובר, טכנאית מהמעבדה שלי. התחל על ידי חיסון 50 מיליליטר נוזלי F2 בינוני לתוך כל אחד משני צלוחיות 250 מיליליטר עם מיליליטר אחד של חוטי P.lacuna מתרבית ריצה. מטפחים באור לבן תחת תסיסה במשך כחמישה ימים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
לאחר חמישה ימים, הומוגניזציה של 100 מיליליטרים של תרחיף תאי P.lacuna ב-10, 000 סל"ד במשך שלוש דקות ומדוד את הצפיפות האופטית ב-750 ננומטר. לאחר מכן, צנטריפוגה של תרחיף התא למשך 15 דקות ב-6, 000 פעמים G.הסר את הסופרנטנט והשעה את הכדור ב-800 מיקרוליטרים של הנוזל הנותר ותוספת F2+medium. קחו שמונה צלחות אגר F2+Bacto המכילות 120 מיקרוגרם למיליליטר קנאמיצין ופיפטה 10 מיקרוגרם של דנ"א באמצע כל צלחת אגר.
מיד פיפט 100 מיקרוליטרים של תרחיף התא על גבי הדנ"א. שמור את צלחת האגר ללא מכסה על הספסל הנקי כדי לאפשר לנוזל העודף להתאדות. סגרו את הצלחת וטפחו אותה באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
לאחר יומיים, פזרו את החוטים של כל צלחת אגר על מספר צלחות אגר F2+Bacto טריות המכילות 120 מיקרוגרם למיליליטר קנאמיצין עם לולאת חיסון. טפחו את הלוחות באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ובדקו את התרביות באופן קבוע תחת מיקרוסקופ. לאחר 14 עד 28 ימים, זהו את החוטים החומים המתים וחפשו חוטים שעברו טרנספורמציה מתחת למיקרוסקופ.
החוטים שעברו טרנספורמציה נראים בריאים וירוקים ושונים מרוב החוטים. העבר כל נימה אחת שהתהפכה לבקבוקי 50 מיליליטר עם 10 מיליליטרים של F2+ בינוני עם 250 מיקרוגרם למיליליטר קנאמיצין. מטפחים באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס על שייקר וצפו בצמיחה עד ארבעה שבועות.
מעבירים את החוטים בחזרה למדיום האגר המכיל 250 מיקרוגרם למיליליטר קנאמיצין ומחכים שהחוטים יגדלו. לאחר מכן, הגדל שוב את ריכוז הקנאמיצין כדי להאיץ את ההפרדה. עבור ביטוי GFP, מתבונן בחוטים בודדים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 40 או 63X ולוכד תמונת שידור בשדה בהיר ותמונת פלואורסצנציה.
טפחו P.lacuna ב-F2 בינוני מתחת ל-50 סל"ד תסיסה אופקית באור לבן במשך כחמישה ימים עד שהצפיפות האופטית המשוערת ב-750 ננומטר תהפוך ל-0.35. אחסן את המדגם בארבע מעלות צלזיוס. הומוגניזציה של החוטים עם אולטרסאונד למשך דקה אחת בעוצמה מקסימלית ומחזור של אחד.
מדוד את הצפיפות האופטית ב-750 ננומטר והעביר שמונה מיליליטרים של המדיום המכיל P.lacuna לתוך צלחת פטרי של שישה סנטימטרים. המתן מספר דקות עד שהדגימה תגיע לטמפרטורת החדר ולאחר מכן כיסה את צלחת פטרי בנייר כסף צלופן. הניחו שקופית מיקרוסקופ על טבלת X-Y של מיקרוסקופ סטנדרטי עם מצלמה.
הפעילו את אור המיקרוסקופ והזיזו מטרה של פי 4 או 10X לנתיב האור. לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי על גבי המגלשה. התאם חוטים בודדים או צרורות נימה לפי תנועות X, Y ו-Z של הטבלה.
שימו לב לתנועות של חוטים בודדים או צרורות ותעדו את התנועות באמצעות מצלמת מיקרוסקופ סטנדרטית. ודא שהעדשה האובייקטיבית אינה נוגעת בנוזל. פיפטה 0.5 מיליליטר של תמיסה המכילה P.lacuna על פני השטח של בקט אגר של צלחת פטרי של שישה סנטימטרים.
אפשרו לנוזל להיכנס לפני השטח. לאחר כ-20 דקות, סגרו את צלחת פטרי והתבוננו בתנועת החוטים על פני השטח באמצעות מטרה של 4X או 10X. צלם את הקלטות קיטועי הזמן באמצעות מצלמת עיניים ומערכת מחשב קטנה.
החוטים חייבים להיות ממוקדים תחילה על ידי העין ולאחר מכן דרך המצלמה העין. ודא שמרווח הזמן בין התמונות הבאות הוא חמש שניות עד דקה אחת. תכנת את סקריפט הלינוקס של המיני-מחשב כדי לשלוט בהקלטת קיטועי הזמן.
הכן מחזיקי LED שבהם נוריות ה- LED של חמישה מילימטרים מותקנות כדי להקרין שטח של 20 מילימטרים מרובעים מלמטה למעלה. מדוד והתאם את עוצמות ה-LED. ודאו שהסביבה כולה נמצאת בחדר חשוך או במיכל סגור וחשוך.
מניחים שמונה מיליליטרים של המדיום המכיל P.lacuna לתוך צלחת פטרי של שישה סנטימטרים, סוגרים את צלחת הפטרי עם המכסה, ומניחים אותה על מחזיק LED כך שהנורית נמצאת במרכז צלחת הפטרי. לאחר יומיים בדרך כלל, צלמו תמונה של צלחת פטרי עם מצלמת סמארטפון המכוונת ישירות למיקום הטיפול באור. השתמש במחזיק ובגיליון לבן כרקע כדי להבטיח את אותו מרחק ותנאי תאורה עבור כל תמונה.
פתח את תוכנת ImageJ, לחץ על קובץ, פתח ובחר את הקובץ. לאחר מכן, לחץ על Enter. בחר את הכפתור הישר ולחץ על לחצן העכבר השמאלי כדי לצייר קו מקצה אחד של צלחת פטרי לקצה הנגדי.
ודא שהקו עובר דרך מרכז מעגל החוטים. לחץ על נתח ומדוד כדי לראות את אורך צלחת הפטרי. לאחר מכן, לחץ על ניתוח ופרופיל עלילה בתפריט ImageJ.
הערך ערך ממוצע עבור עוצמת הפיקסלים מחוץ למעגל וערך ממוצע נוסף עבור עוצמת הפיקסל בתוך העיגול. כוון את העכבר למיקום Y בין ערכים אלה כדי להעריך את ערכי X משני צידי המעגל. שים לב לשני הערכים וחשב את ההפרש.
לאחר מכן בחר בלחצן הישר וצייר קו בערך האמצעי-מקסימלי של עוצמת הפיקסל. לבסוף, לחץ על נתח ולאחר מכן מדוד כדי לקבל את אורך מעגל התא הפנימי. אינטגרציה והפרדה של הוספה לאחר הטרנספורמציה של P.lacuna עם PAK1 מוצגת כאן.
בדיקת PCR עם פריימרים חיצוניים כשבוע לאחר הטרנספורמציה כוללת בדרך כלל שני פסים על ג'ל האלקטרופורזה, אחד בגודל של פס מסוג פראי, ורצועה נודדת איטית יותר אחת המציינת את החדרת קלטת ההתנגדות. כאן, נתיבים 1 עד 4 מייצגים תוצרי PCR של חוטים לאחר שבעה ימים, 11 ימים, 14 ימים ו-17 ימים של בידוד של נימה עמידה, ומסלול 5 מייצג תוצר PCR מסוג פראי. במדגם של שבעה ימים, התוספת נמצאת בחלק קטן של הכרומוזומים.
שבר זה גדל עד 17 יום, שבהם לא נראה להקה מסוג פראי;כלומר, ההפרדה הושלמה. תמונה זו מייצגת את הווקטור pMH1 עבור ביטוי sfGHP תחת שליטה של מקדם בטא של פיקוציאנין אנדוגני. הרצף ההומולוגי P.lacuna, עמוד השדרה הווקטורי pUC19, וההוספה עם sfGFP ועמידות קנאמיצין מוצגים כאן.
ב-pMH1, הגן sfGHP ממוקם בשלושה ראשונים של גן הבטא phycocyanin;ולכן, הוא מונע על ידי מקדם הבטא האנדוגני cpc. תמונות פלואורסצנטיות של חוטי בר מסוג P.lacuna ולאחר טרנספורמציה עם PAK1, PAK2, PAK3 ו- pMH1 מוצגות כאן. הביטוי של sfGFP מונע על ידי מקדם cpc 560, מקדם a2813, מקדם psbA2S, או מקדם ביתא cpc אנדוגני.
התמונות הממוזגות המוצגות כאן מראות את תנועתיות הפורמידיום לקונה. התנועה על פני האגר מוצגת כאן. מרווח הזמן היה דקה אחת.
התנועה במדיום הנוזלי מוצגת כאן. מרווח הזמן היה 10 שניות. טרנספורמציה טבעית היא שיטה פשוטה.
פשוט ערבבו דנ"א פלסמידי עם קלטת עמידות ברצפים הומולוגיים עם התאים ותנו לתאים לגדול על מדיום עם אנטיביוטיקה. גנים יכולים להיות מושתקים וחלבונים יכולים להיות ביטוי יתר. זה חשוב לכל מחקר בסיסי ולמחקרים ביוטכניים.
בציאנובקטריה חד-תאית, שבה נוצרת גם טרנספורמציה טבעית, טופלו מחקרים מולקולריים על פוטוסינתזה או פוטורצפטורים וכו'.
