פרוטוקול זה מציג מדריך שלב אחר שלב למדידת הנוקשות של הידרוג'לים ותאים באמצעות ננו-אינדנטר זמין מסחרית וגם מציג תוכנת קוד פתוח לניתוח מחדש של נתונים שנרכשו. הפרוטוקול מאפשר לנו לקבל נתונים דמויי מיקרוסקופיה של כוח אטומי, עם זאת, בשבריר מהמורכבות. אז הפרוטוקול הזה יהיה שימושי למדענים המעוניינים לחקור תכונות מכניות של דגימות בריאות וחולות, אך אנו גם מאמינים שהוא יהיה בעל ישימות רחבה יותר בהקשר של ננו-כניסה לחומרים רכים.
לאחר הפעלת המכשיר והרכבת הגשושית שנבחרה לניסוי, התחל לכייל את הבדיקה. לחץ על אתחול בחלון התוכנה הראשי. בתפריט הכיול שמופיע, הזן את פרטי הבדיקה בתיבות הקלט.
לאחר מכן, מלאו צלחת פטרי עבה מזכוכית עם תחתית שטוחה עם אותו מדיום כמו צלחת הדגימה, והתאימו את הטמפרטורה של המדיום לזו של הדגימה. לאחר מכן, הניחו את צלחת הכיול מתחת לבדיקה. לכיול בנוזל, הרטיבו מראש את הבדיקה עם טיפה של 70% אתנול או איזופרופנול עם קצה הפיפטה במגע קל עם פרולת הזכוכית, כך שהטיפה מחליקה על הקצה הכדורי.
לאחר מכן, החליקו ידנית את זרועו של הננו-אינדנטר כלפי מטה עד שהגשושית שקועה במלואה אך עדיין רחוקה מתחתית צלחת הפטרי. יש להמתין חמש דקות כדי לאפשר הגעה לתנאי שיווי משקל בנוזל. לאחר מכן, בתפריט האתחול של התוכנה, לחץ על סרוק אורך גל.
המסך של האינטרפרומטר יציג מד התקדמות. בדוק אם הסריקה האופטית הצליחה על-ידי ניווט ללוח סריקת אורך הגל בתיבת האינטרפרומטר. לאחר מכן, בתפריט אתחול, לחץ על מצא משטח כדי להוריד בהדרגה את הבדיקה.
הגשושית מפסיקה לזוז כאשר היא יוצרת קשר עם צלחת פטרי הזכוכית. לאחר שהגשושית באה במגע עם פני השטח, הזז את הגשושית במיקרומטר אחד למטה באמצעות לחצן החץ y כלפי מטה בחלון התוכנה הראשי. התבונן באות הירוק בחלון החי לשינויים בקו הבסיס עם כל צעד של מיקרומטר אחד.
לאחר מכן, לחץ על כיול מתפריט אתחול. לאחר השלמת הכיול, בדוק את גורמי הכיול הישנים והחדשים בחלון המוקפץ המוצג. אם מקדם הכיול החדש נמצא בטווח הנכון, כפי שמוסבר בכתב היד, לחץ על השתמש בגורם חדש.
לאחר מכן, הזז את הפיאזו ב-500 מיקרומטר. לאחר מכן, בדוק אם מעגל הדמודולציה כויל כראוי על ידי ניווט לכרטיסייה דמודולציה בשולחן העבודה של האינטרפרומטר. הקש בעדינות על השולחן האופטי או על הננו-אינדנטר כדי לגרום למספיק רעש.
עיגול לבן של נקודות נתונים בדידות אמור לכסות בקירוב את העיגול האדום. העמיסו את צלחת הפטרי המכילה את הדגימה על במת המיקרוסקופ, והזיזו ידנית את הגשושית של הננו-אינדנטר למיקום הרצוי מעל הדגימה. החלק את הבדיקה בתמיסה, תוך הקפדה להשאיר מילימטר אחד עד שניים בין הגשושית לבין פני השטח של הדגימה.
המתן חמש דקות עד שהגשושית תתאזן בתמיסה. התמקדו בגשושית באמצעות המיקרוסקופ האופטי. כדי למדוד את מודולוס החומרים הרכים של יאנג, לחץ על הגדר ניסוי.
הוסף שלב Find Surface וכניסה יחידה בבקרת תזוזה כדי לקבוע פרמטרים ניסיוניים לשימוש לאחר מכן עבור סריקת המטריצה האוטומטית. אם הכניסה היחידה מצליחה, הגדר סריקת מטריצה המכילה 50 עד 100 נקודות במרווחים של 10 עד 100 מיקרומטר. לאחר שווידאת שהתיבה משטח חיפוש אוטומטי מסומנת, לחץ על השתמש במיקום שלב כדי להתחיל את סריקת המטריצה ממיקום השלב הנוכחי.
הגדר את פרופיל סריקת המטריצה בבקרת תזוזה. השאר את מספר המקטעים על חמישה, והשתמש בפרופיל התזוזה המוגדר כברירת מחדל. במידת הצורך, שנה את פרופיל התזוזה ואת הזמן עבור כל מקטע משופע.
אין לחרוג מקצבי מאמץ הגדולים מ-10 מיקרומטר לשנייה. שמור את הניסוי שהוגדר בנתיב הניסוי הרצוי. לחץ על הפעל ניסוי והמתן עד להשלמתו.
כאשר כל הנתונים נרכשים, נקה את הבדיקה וכבה את המכשיר כמתואר בטקסט. לסינון עקומות תזוזה בכוח והפקת ערכת נתונים מנוקים בפורמט JSON, הפעילו הכנה. py משורת הפקודה במחשב המעבדה.
בחר את פורמט הנתונים Optics11 מהרשימה הנפתחת. אם הנתונים אינם נטענים כראוי, הפעל מחדש את ממשק המשתמש הגרפי ובחר Optics11 Old. לאחר מכן, לחץ על טען תיקייה ובחר תיקיה המכילה את הנתונים לניתוח.
נקה את ערכת הנתונים באמצעות הכרטיסיות הקיימות בצד ימין של ממשק המשתמש הגרפי. לאחר מכן, לחץ על שמור JSON והזן שם מתאים לערכת הנתונים המנוקה. שלח את קובץ JSON למחשב שבו הותקנה תוכנת NanoAnalysis, אם הוא שונה מהמחשב הנוכחי.
הפעל את הננו. קובץ py משורת הפקודה. בפינה השמאלית העליונה של ממשק המשתמש הגרפי, לחץ על טען ניסוי ובחר את קובץ JSON.
פעולה זו תאכלס את רשימת הקבצים ואת גרף העקומות הגולמיות המציג את ערכת הנתונים במונחים של עקומות תזוזת כוח. בתיבה נתונים סטטיסטיים, סמן את הערכים של שלושת הפרמטרים, N הופעל, N נכשל ו- N לא נכלל. כדי לדמיין עקומה מסוימת בפירוט רב יותר, לחץ על העקומה.
פעולה זו תדגיש אותו בירוק ותציג אותו בגרף העקומה הנוכחי. לאחר שנבחרה עקומה בודדת, הפרמטרים R ו- k יאוכלסו בתיבה סטטיסטיקה. לאחר ניקוי נוסף של ערכת הנתונים, סנן את כל הרעשים בעקומות באמצעות המסננים המיושמים בתיבה סינון.
לאחר מכן, בדוק את העקומות המסוננות בגרף העקומות הנוכחי. העקומה המסוננת היא בשחור, ואילו הגרסה הלא מסוננת היא ירוקה. כדי למצוא את נקודת הקשר, מהתיבה נקודת מגע, בחר אחת מסדרה של הליכים מספריים שיושמו בתוכנה.
התאם את הפרמטרים של האלגוריתם כך שיתאימו לערכת הנתונים כך שנקודת המגע תהיה ממוקמת כראוי, כפי שמוסבר בכתב היד. כדי לראות היכן נמצאה נקודת המגע בעקומה בודדת, בחר את העקומה על-ידי לחיצה עליה. לאחר מכן, לחץ על בדוק.
בדוק את החלון המוקפץ שמופיע כדי לזהות היכן נמצאה נקודת הקשר. לאחר מכן, לחץ על ניתוח הרץ. זה יפיק שלושה גרפים.
בדוק את נתוני הזחת הכוח עבור כל עקומה בערכת הנתונים, יחד עם ההתאמה הממוצעת של הרץ המוצגת באדום. לאחר מכן, בדוק את עקומת כניסת הכוח הממוצע באמצעות רצועת שגיאה המציגה סטיית תקן אחת, יחד עם התאמת הרץ הממוצעת המוצגת באדום. לאחר מכן, בדוק את חלקת הפיזור של המודולוס של יאנג שמקורה בהתאמת מודל הרץ לכל עקומה בנפרד.
בדוק את תיבת התוצאות עבור המודולוס של יאנג הממוצע המחושב ואת סטיית התקן שלו, וודא שהם סבירים לניסוי הנתון. לאחר מכן, בתיבה שמור, לחץ על הרץ. בחלון הקופץ, הזן את שם הקובץ והספרייה ולחץ על שמור.
ייווצר קובץ tsv. פתח את קובץ ה- tsv בכל תוכנה נוספת לניתוח סטטיסטי והתוויה נוספת. לקבלת נתוני ננו-אינדנטנציה של תאים, לחץ על ניתוח ספקטרום גמישות.
בדוק את שתי החלקות המיוצרות, כלומר מודולוס יאנג כפונקציה של עומק הכניסה עבור כל עקומה והמודולוס של יאנג הממוצע כפונקציה של הזחה המותאמת על ידי מודל דו-שכבתי. לאחר סיום הניתוח, לחץ על ES בתיבה שמור. פעולה זו תייצא קובץ tsv בספרייה שצוינה, אשר ניתן לפתוח ולהתוות בכל תוכנה אחרת לבחירה.
ניסוי מוצלח מביא למקטע הגישה של עקומת תזוזת כוח, בעל קו בסיס ברור ושטוח, אזור מעבר ואזור משופע. עקומות המציגות שינויים מצורה זו מוסרות בקלות ממערך הנתונים באמצעות NanoPrepare. עקומות הזחת כוח ממוצעות יחד עם מודל הרץ הממוצע עבור הידרוג'ל פוליאקרילאמיד רך והידרוג'ל נוקשה מוצגים כאן.
על ידי התוויית ערכים אינדיבידואליים של המודולוס של יאנג, המודולוס הממוצע הצפוי של יאנג נשלף עבור שני ההידרוג'לים. עבור ניסויי ננו-אינדנטנציה של תאים, עקומת כניסת הכוח הממוצעת ומודל הרץ הממוצע המקביל מראים שמודל הרץ אינו לוכד באופן מלא את האבולוציה של הכוח עם עומק כניסה הולך וגדל עבור ניסויי ננו-אינדנטנציה של תאים. ספקטרום האלסטיות הממוצע המותאם עד לכניסה של 200 ננומטר מודגם כאן.
ספקטרום האלסטיות הממוצע מתחיל לעלות בעומק כניסה של 200 ננומטר, מה שמעיד על תרומתו של מצע למודולוס של יאנג הנראה לעין. בגלל זה, 200 ננומטר נבחר כטווח ההתאמה הן עבור הרץ והן עבור המודל הדו-שכבתי. התאמת המודל הדו-שכבתי מאפשרת לחלץ מידע נוסף על המצב המכני של התא, כולל עובי קליפת המוח אקטין התא, מודולוס קליפת המוח של התא ומודולוס נפח התא, כפי שמוסבר בטקסט הראשי.
השוואה ישירה בין מודל הרץ לגישת ספקטרום האלסטיות במונחים של התפלגות המודולוס של יאנג מגלה התפלגויות חופפות באמצעים דומים, ומדגימה את ההיתכנות של גישת ספקטרום האלסטיות. איתור מדויק של נקודת המגע ושמירה על עקביות הפרמטרים של האלגוריתם שנבחר בין מערכי הנתונים שרוצים להשוות הוא בעל חשיבות עליונה להשגת השוואות מהימנות בין דגימות. השיטה היא בעלת תחולה כללית לכימות התכונות האלסטיות המקומיות של דגימות ביולוגיות, כולל ספרואידים, אורגנואידים, רקמות, ובאופן כללי כל החומר הרך.
