ביטוי הטרולוגי של קונקסינים ופונקסינים בביציות קסנופוס הוא גישה רבת עוצמה לניתוח תכונות ביופיזיות של צמתי פערים. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא להשתמש בגישת מדידת זרם בצד גבוה המתאימה למהדקי מתח כפולים באתר. ההליך יודגם על ידי יואן שואי, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי.
ברגע ש-70% עד 80% מהביציות מתפרקות, מפרקים את תמיסת האנזים על ידי הטיה עדינה של הצינור. לשטוף את הביציות חמש פעמים על ידי מילוי הצינור עם תמיסת ND96 ולאחר מכן decanting את התמיסה. לאחר הכביסה הסופית, העבירו את הביציות לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה תמיסת ND96.
השתמשו בזכוכית נקייה של פיפטה פסטר כדי לקטוף ולהעביר ביציות גדולות ובריאות למראה לצלחת פטרי באורך 60 מ"מ המכילה תמיסת ND96 בתוספת נתרן פירובט ופניצילין סטרפטומיצין. הכינו צלחת להזרקת ביציות על ידי הדבקת חתיכה קטנה של רשת ניילון לתחתית צלחת פטרי של 35 מילימטרים. מלאו את צלחת הזרקת הביציות בערך באמצע הדרך בתמיסת ND96 בתוספת פירובט ופניצילין סטרפטומיצין.
לאחר מכן, הניחו 25 עד 30 ביציות בשורות בתוך צלחת פטרי. גב למלא מיקרופיפט הזרקה בשמן מינרלי קל משקל ולהחדיר אותו למחזיק המיקרופיפט של המזרק. העבירו את ה-cRNA מאחד האליקוטים המאוחסנים אל המשטח הפנימי של כיסוי צלחת פטרי או תחתיתו על ידי צנרת.
לחץ על כפתור המילוי בבקר המזרק כדי לשאוף את טיפת ה- cRNA לקצה המיקרופיפט. לאחר מכן, לחץ על כפתור ההזרקה כדי להזריק את ה- cRNA. מעבירים את הביציות המוזרקות לצלחת פטרי חדשה המכילה תמיסת ND96 בתוספת פירובט ופניצילין סטרפטומיצין.
שמור אותם בתוך החדר הסביבתי בטמפרטורה של 15 עד 18 מעלות צלזיוס למשך יום עד שלושה ימים. החלף את התמיסה מדי יום על ידי העברת הביציות לצלחת פטרי חדשה. השתמשו בשני פינצטה עדינה כדי לקלף בעדינות את קרום הווילין השקוף שעוטף את הביצית.
לאחר מכן, הניחו שתי ביציות לכל באר בתא זיווג ביציות המכיל את תמיסת ND96. חבר את בדיקת המתח הדיפרנציאלי ואת כבלי הזרם לתא המודל. לאחר מכן, חברו את השקעים האדומים והשחורים לבדיקת המתח הדיפרנציאלי עם המגשר המצורף וחברו את שתי רגלי המגשר לכל פין בתא המודל.
חבר את חוט ההארקה בתא המודל לכבל משקע מעגל הבסיס של המגבר. סובבו את ידיות ההיסט וההיסט של VM וה-VE לאפס את מתח הממברנה ואת מדי זרם הממברנה. הפעילו את המהדק מכיבוי למהיר או לאיטי והפכו את חוגת הרווח בכיוון השעון לרמה המאפשרת למהדק מתח תקין לאפס את אלקטרודת המתח ואת מדי האלקטרודות של המגבר.
הפעל פרוטוקול רכישה פשוט המכיל כמה שלבי מתח כדי לאשר שהמתח המוצג במד המתח של הממברנה משתנה בהתאם לפרוטוקול הרכישה, ושעקבות המתח והזרם מוצגים כראוי ב- Clampex. הניחו צלחת פטרי המכילה את הביציות הזוגיות לתוך כלי הקיבול של צלחת פטרי של פלטפורמת ההקלטה. בחר זוג ביציות וסובב את צלחת פטרי במידת הצורך, כך ששתי הביציות יהיו בכיוון שמאל וימין.
נעל את הבמה במקומה על ידי הבסיס המגנטי שלה. הניחו אלקטרודת ייחוס בסמוך לקצה צלחת פטרי לכיוון צד המשתמש. לאחר מכן, חבר את אלקטרודת הייחוס לשקע השחור רק באחת משתי בדיקות המתח הדיפרנציאלי.
קחו זוג מיקרופיפטים מזכוכית, נתקו מעט מהקצה עם כותב יהלומים והחליקו את קצה הקצה על ידי ליטוש אש. החזיקו את המיקרופיפט מעל הלהבה של מבער אלכוהול וכופפו אותו לזווית חלקה במרחק של כסנטימטר אחד מהקצה. בחזרה למלא את פיפטת הזכוכית לחלוטין עם פתרון ND96 ולאחר מכן להכניס אותו לתוך מחזיק microelectrode מלא מראש.
ודא כי לא קיימות בועות אוויר במערכת. הכנס את פין שני המילימטרים של מחזיק המיקרואלקטרודה לשקע של שני מילימטרים של חוט חיבור אלקטרודות מתח דיפרנציאלי. הידקו את שקע שני המילימטרים על צדפה מבוססת מגנטית וכיוונו את קצה אלקטרודת המתח הדיפרנציאלי לעבר אחת משתי הביציות.
הכנס את פין המילימטר האחד של חוט חיבור האלקטרודה של המתח הדיפרנציאלי לשקע האדום של גשושית המתח הדיפרנציאלי באותו צד. מכינים את אלקטרודות המתח והזרם מנימי הזכוכית וממלאים אותם בחזרה בתמיסת אשלגן כלורי. לאחר מכן, הכנס את האלקטרודות למחזיקי האלקטרודות המסופקים עם המגברים.
הורידו את האלקטרודות לתמיסת האמבטיה והפכו את מחוגות ההיסט VM וההיסט של ה-VE לאפס את מתח הממברנה ואת מדי זרם הממברנה. בדוק את התנגדות האלקטרודה על ידי לחיצה על בדיקת אלקטרודות VM ובדיקת אלקטרודות VE. החדירו את אלקטרודות הזרם והמתח לתוך הביציות והתבוננו בפוטנציאלי הממברנה השליליים.
לאחר מכן, בחלק המהדק של המגבר, לאשר כי רווח DC הוא במצב. סובבו את ידית ההישג בכיוון השעון לרמה המאפשרת מהדק מתח תקין ולכבות את מתג המהדק מכיבוי למהירות. לבסוף, הפעל פרוטוקול רכישה.
דיאגרמה של ניסוי הביציות מוצגת כאן. שלבי מתח ממברנה שליליים וחיוביים מוחלים על ביצית 1 ממתח ממברנה מחזיק של מינוס 30 מיליבולטים, ואילו ביצית 2 מוחזקת במתח ממברנה קבוע של מינוס 30 מיליבולטים. המתח הטרנס-צומתי, או Vj, מוגדר כמתח הממברנה של ביצית 2 מינוס מתח הממברנה של ביצית 1.
התמונות הייצוגיות מראות את עקבות Lj לדוגמה ואת יחסי המתח הטרנס-צמתוני של מוליכות הצמתים המנורמלים כתוצאה מכך של צמתים מרווחים הומוטיפיים UNC-9. עקבות Lj לדוגמה ויחס Gj-Vj המנורמל שנוצר כתוצאה מכך של צמתים של UNC-7b מרווח הומוטיפי מוצגים כאן. התוצאות מראות כי שני סוגים אלה של Gjs נבדלים זה מזה בקצב ההשבתה של Ij התלוי ב- Vj, בתלות ב- Vj ובכמות ה- Gj השיורי.בעת ניסיון ההליך, חשוב מאוד לוודא שלמערכת אלקטרודות המתח הדיפרנציאליות אין בועות אוויר והקצה שלה מכוון קרוב מאוד לביצית ולאלקטרודות המתח והזרם יש התנגדות של כמיקרוהם אחד.
הטכניקה שלנו קלה ליישום. זה עשוי לעניין במיוחד את המעבדות המעוניינות לאחרונה להשתמש בביציות קסנופוס כדי לחקור צמתים של פערים.
