מחלות מעי דלקתיות, או מחלת המעי הרגיז, מטילות נטל בריאותי וכלכלי ניכר על יחידים ועל החברה. מודל קוליטיס זה מועיל ללמוד את המנגנונים של IBD ולהעריך את הטיפולים עבור IBD. זה immunodominant Cbir flagellin T-cell ספציפי העברת קוליטיס מודל מספק תובנות כיצד חיידקי המעיים אנטיגן גורם תגובות תאי T כדי לגרום קוליטיס.
לאחר המתת חסד העכבר, לעשות כ סנטימטר אחד חתך הבטן השמאלית ולמשוך את העור מן רקמת שריר הבטן. לאחר מכן, לבצע חתך של כשלושה סנטימטרים ברקמת שריר הבטן. לאחר מכן, להסיר את הטחול עם מספריים סטריליים מלקחיים.
מניחים את הטחול בצלחת תרבית המכילה חמישה מיליליטר של חוצץ כביסה מקורר מראש. טוחנים את הטחול עם המשטח המחוספס של שתי מגלשות זכוכית סטריליות. העבר את ההשעיה התא לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר על ידי העברתו דרך מסננת תא 100 מיקרומטר.
שוטפים את מגלשות הזכוכית ואת צלחת התרבות עם חמישה מיליליטרים של חיץ כביסה מקורר מראש, ולהעביר את חיץ הכביסה לתוך הצינור. צנטריפוגה ההשעיה התא, להשליך את supernatant, ו resuspend התאים עם חמישה מיליליטרים של טריס אמוניום כלוריד תמוגה מראש חיץ לטחול. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
הוסף 10 מיליליטר של חוצץ כביסה מקורר מראש לצינור. לאחר מכן, צנטריפוגה השעיית התא, להשליך את supernatant, ו respend התאים עם 10 מיליליטר של חיץ בידוד מקורר מראש. כדי לספור את התאים, ערבבו 10 מיקרוליטרים כל אחד מהשעיית התא וכחול טריפאן ביסודיות, וטענו 10 מיקרוליטרים לשקופית.
לאחר מכן, הכנס את השקופית למונה התאים האוטומטי כדי להשיג את מספר התא הניתן לקיום. צנטריפוגה ההשעיה התא הנותרת ולהשליך את כל supernatant. מערבולת חלקיקים מגנטיים CD4 נגד עכבר, להוסיף ישירות 50 microliters של החלקיקים לכל 10 מיליון תאים, ולערבב עם כדורי תאים ביסודיות.
לדגור על התערובת במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבר את השעיית חלקיקי התא לתוך צינור איסוף סטרילי. הוסף 3.5 מיליליטר של חיץ בידוד מקורר מראש לתוך הצינור.
מניחים את הצינור על מגנט הפרדת התא במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בזהירות לשאוף את supernatant עם פיפטה העברת שלושה מיליליטר. הסר את הצינור ממגנט הפרדת התאים.
לאחר מכן, resuspend התאים עם 3.5 מיליליטר של חיץ בידוד מקורר מראש ומניחים את הצינור על המגנט במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. שאפו בזהירות את הסופר-נרטיב עם פיפטה של 3 מיליליטר. לבסוף, הקדישו מחדש את התאים למיליליטר אחד של מאגר FACS מקורר מראש.
כדי להעביר את התאים לעכברי הנמען, הזן מחדש את תאי ה- TCR הטרנסגניים-נאיביים-CD4-נאיבית של Cbir1 ל-5 מיליון תאים למיליליטר ב- 1x PBS. מחממים את העכברים תחת מנורת חום ומרסנים את העכברים באמצעות מרסן עכברים. תוך ורידי להזריק 200 מיקרוליטרים של ההשעיה התא לתוך הווריד האחורי של העכברים.
לאחר המתת חסד העכבר, לעשות כ חתך עור קו אמצע גחון סנטימטר אחד. משוך את העור הרחק מרקמת שריר הבטן. לאחר מכן, לעשות חתך של שלושה סנטימטרים ברקמת שריר הבטן.
לאחר מכן, לזהות את coecum ולהסיר את המעי הגס כולו עם מספריים סטריליים מלקחיים. הרטיבו את המעי הגס עם PBS מקורר מראש בצלחת תרבות. יש לחרוט את המעי הגס לאורכו ולשטוף אותו ב-PBS מקורר מראש.
חותכים 1/3 של המעי הגס אורך. מניחים את רצועת המעי הגס במגבת נייר כשהצד הלומנלי פונה כלפי מעלה. בצע גלגול שוויצרי באמצעות קיסם.
מניחים את המעי הגס השוויצרי לתוך קלטת, ולשים את הקלטת ב 10% פורמלין חוצץ במשך 24 שעות. מייבשים ומטביעים את המעי הגס בפרפין עם מעבד אוטומטי. לאחר מכן, לחתוך מקטעי רקמת חמישה מיקרומטר על מיקרוטום.
הר את הרקמה על שקופיות ולבצע הכתמת המטוקסילין ואאוזין. עכברי נוקאאוט סמרטוט החלו לרדת במשקל כשלושה שבועות לאחר העברת התא, ומשקלם הגיע סביב 80 עד 85% ממשקלם המקורי שישה שבועות לאחר העברת התא. עכברי נמען הראו אורך המעי הגס הקצר שישה שבועות לאחר העברת התא.
עכברי הנמען הדגימו יותר חדירת תאים במעיים למינה פרופריה ארבעה שבועות לאחר העברת התאים. הם הראו אובדן תאי גביע והיפרפלזיה של תאי אפיתל במעיים חמישה שבועות לאחר העברת התאים, כמו גם שחיקת הרירית וחדירת תאים דלקתיים בתת-הקוקוסה של המעי הגס שישה שבועות לאחר העברת התאים. הציונים ההיסטופתולוגיים עלו משמעותית מארבעה לשישה שבועות.
בו זמנית, לא הייתה דלקת בעכברים נוקאאוט Rag מקבל PBS לבד. באמצעות הליך זה, רמות ציטוקינים המעי הגס יכול להיקבע על ידי ELISA ו qPCR.
