הפרוטוקול פותח לייצור גרסאות ציד באורך מלא בקנה מידה של מיליגרם נמוך. הוא מאפשר חלבון עקבי באיכות גבוהה החיוני לחוקרי HD. מי שידגים את ההליך יהיה מייקל האריס, מדען מחקר ממעבדת קוריה.
מתחילים על ידי הוספת גרם אחד של פוליאתילניימין 25 K לליטר אחד של מים נטולי אנדוטוקסין, ומערבבים היטב. התאם את ה- pH ל- 2.0 באמצעות חומצה הידרוכלורית של 100 מילימולר וערבב עד שכל הפוליאתילנימין מתמוסס. לאחר מכן התאם את ה- pH ל- 7.0 באמצעות תמיסת נתרן הידרוקסיד של 100 מילימולר והעביר את התמיסה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר.
הפוך aliquots של הפתרון מסונן ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. להפיץ תאי HEK293 במדיום הצמיחה בתוספת סטרפטומיצין פניצילין באינקובטור שייקר לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 90 סל"ד, 5% פחמן דו חמצני למשך 18 עד 24 שעות. יום אחד לפני ההעברה, מדללים את התאים בצפיפות של כ-1.2 x 10 לתאי הכוח השישיים למיליליטר בשני ליטרים של מדיום גדילה בבקבוק ארלנמאייר של חמישה ליטרים ודוגרים במשך 18 עד 24 שעות.
בסוף הדגירה, מדוד את צפיפות התא ואת הכדאיות באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן. לאחר חישוב כמות הפוליאתילנימין והפלסמיד הדרושים לטרנספקציה, לדלל פוליאתילנימין ופלסמיד בנפרד ב -100 מיליליטר של PBS ולדגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, מערבבים את הפלסמיד המדולל והפוליאתילנימין על ידי מערבולת עדינה ודוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
מוסיפים את התערובת לתרבית התאים ומערבבים על ידי מערבולת עדינה. עכשיו, לאפשר לתאים לגדול במשך 24 שעות. למחרת, מוסיפים תמיסת נתרן בוטיראט לריכוז סופי של סוכן אנטי-גושים ואנטי-מקציף של שני מילימולרים ביחס של 1:1, 000 נפח לתרבית ודוגרים על התאים באינקובטור השייקר הלח במשך 48 שעות.
לאחר מדידת הכדאיות וצפיפות התא, קצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 2, 000 G במשך 30 דקות ולאחסן את גלולת התא במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני טיהור. לטיהור אנטי-FLAG באמצעות FPLC, יש לארוז 12 עד 25 מיליליטר של שרף אנטי-FLAG על עמודה ריקה בקצב זרימה של ארבעה מיליליטר לדקה באמצעות חיץ A ולהתאים את גובה הבוכנה כדי להסיר את המרווח בין קצה הבוכנה למצע השרף. לאחר מכן, להשעות את גלולת התא מופשר בחיץ ליזיס קר ולהעביר את תרחיף התא פעם אחת דרך הומוגנייזר גזירה גבוהה בלחץ של 1, 000 פאונד לאינץ 'מרובע.
באמצעות צנטריפוגה המצוידת ברוטור תואם בעל זווית קבועה, להבהיר את הליזאט ב 20, 000 G למשך שעה אחת. תוכנית FPLC תחת חלון השיטה, לטעון את lysate הבהרה באמצעות משאבת הדגימה, ולשטוף את העמודה עם נפחי העמודה הרצויים של מאגר A, B, C, D ומאגר elution כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר סיום הריצה, נתח 10 מיקרוליטרים של שברי השיא באמצעות SDS-PAGE.
שלב את שברי השיא עם הטוהר הרצוי ושמור כ-50 מיקרוליטרים של ה-eluates המשולבים לניתוח SDS-PAGE נוסף. התחל לאזן את עמודת ה- SEC באמצעות ה- FPLC וטען את ה- anti-FLAG eluate באמצעות superloop של 50 מיליליטר. לאחר הפעלת מאגר ה-SEC, אפשרו להפרדת ה-SEC להתרחש בן לילה בארבע מעלות צלזיוס.
השווה את פרופיל האלוציה לפרופיל האלוציה הסטנדרטי של HTT כדי להבחין בין פסגות מונומר, דימר ואוליגומריים בעלי סדר גבוה יותר. מאגר את שברי ה- HTT המונומריים בהתבסס על פרופיל ה- elution של עמודת ה- SEC, ואם תרצה, אחסן בנפרד את שברי ה- HTT האוליגומריים והדימריים בעלי הסדר הגבוה יותר. רכז את חלבון ה-HTT המאוגד באמצעות רכז צנטריפוגלי במשקל 100 קילו-דלטון בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
לאחר חישוב ריכוז החלבון, aliquot פחות מ -100 מיקרוליטר של חלבון HTT מטוהר בצינור microcentrifuge בטוח קריו. הבזק להקפיא את aliquots באמצעות חנקן נוזלי ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. בצע את כל ה- SEC-MALS האנליטיים בארבע מעלות צלזיוס במערכת HPLC, יחד עם גלאי UV, גלאי פיזור אור רב-זוויתי, גלאי אינדקס שבירה דיפרנציאלי, והשתמש ב- 0.185 כתוספת מקדם השבירה עבור HTT.
נקה את המשאבה ואת הגלאים במים מסוננים ברמת HPLC וחבר את עמודת UHPLC למערכת. שיווי משקל העמודה עם מים מסוננים ולאחר מכן חיץ SEC-MALS עד שכל אותות הגלאי מגיעים לנקודת ההתחלה. הזרקת שני מיקרוליטרים של תמיסת BSA בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר לדקה למשך 15 דקות להזרקה.
בדוק את איכות הנתונים, בצע נורמליזציה, יישור שיא ותיקון הרחבת פס בהתבסס על פרופיל BSA, וצור תבנית עבור הרצות הדגימה הבאות של HTT. הפשיר במהירות בקבוקון של דגימת FL Q23-HTT באמבט מים בטמפרטורת החדר באמצעות מצוף. סנן את ה-HTT דרך מסנן ספין של 0.1 מיקרומטר.
להזריק שניים עד ארבעה מיקרוליטרים של דגימת HTT ולרוץ במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר לדקה. נתח את הנתונים הכרומטוגרפיים ופיזור האור באמצעות התוכנה הנלווית וצור תרשים Zimm כדי לקבוע את המסה המולקולרית הממוצעת במשקל עבור כל פסגה. במחקר הנוכחי, באמצעות תהליך טור דו-שלבי, יותר מ-95% מהטוהר הושג עבור HTT והמזהם העיקרי היה מלווה Hsp70, אשר בוטל על ידי שטיפה נרחבת עם מגנזיום כלוריד ו-ATP במהלך שלב טיהור הזיקה נגד FLAG ביטוי יתר של FL HTT יכול לגרום לפיצול של החלבון, אך FL Q23-HTT המיוצר בשיטה נפתרה כפס יחיד עם המשקל המולקולרי הנכון של 350 קילו-דלטון מציין שאין פיצול.
ניתוח כתמים מערביים לאחר תגובת נוגדנים עם FL Q23-HTT הראה כי החלבון בודד ללא חתכים משמעותיים הניתנים לזיהוי, מכיוון שלא נצפו רצועות נוספות הקשורות לשברים. שונות אורך הפולי-Q של FL HTT, Q23, Q48 ו-Q73 הגיבו כצפוי בכתם המערבי, והראו אות חזק יותר ויותר עבור נוגדן חד-שבטי מכוון פולי-Q MW1, בקורלציה עם הגדלת אורך Q. בין עמודות HPLC שנבדקו, עמודת ה- SEC הראתה רזולוציה מספקת בין מונומר HTT ודימר, כך שניתן היה להבחין במסות טוחנות.
FL HTT מטוהר מ- SEC הראה פסים מרובים המתאימים למצבי האוליגומריזציה, אשר יכול להיות בגלל נוכחותם של מספר טלאים הידרופוביים אשר תורמים להיווצרותם של אוליגומרים בעלי סדר גבוה יותר במהלך הנדידה בתוך הג'ל. HTT מטוהר הראה שלושה פסים עיקריים על PAGE מקומי כחול עם משקל מולקולרי מוערך של 643, 927, ו 1, 070 קילודלטון המייצגים ככל הנראה את המינים המונומריים, הדימריים והטרימריים של HTT, בהתאמה. טיפול נכון בציד מטוהר חיוני כדי למנוע יצירת אוליגומרים מסדר גבוה באגרגטים מסיסים.
זה הכרחי שמשתמש הקצה יעבוד במהירות כדי לחלק את הדגימה לצינורות מקוררים מראש לפני הקפאת ההבזק. ניתן לבצע בדיקות יציבות ארוכות טווח על דגימות המאוחסנות בתקופות ממושכות במינוס 80 מעלות צלזיוס. ניתוחים חוזרים של HPLC SEC-MALS יאשרו אם חל שינוי כלשהו בתוכן המונומרי של הדגימה.
