פיתחנו שיטה להפעלה מחדש של תאי גזע עצביים שקטים במוחות של דרוזופילה בתרבית. שיטה זו יכולה לספק גורמים אקסוגניים למדיה התרבותית ויכולה לבדוק הפעלה מחדש נוירובלסטית. טיפולים טובים יותר בתאי גזע יכולים להתפתח על ידי הבנה טובה יותר של האופן שבו תאי גזע שקטים מגיבים לרמזים חיצוניים ונכנסים למחזור התא.
מפגינה את ההליך תהיה סוזן דויל, מדענית מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל לבחור בזהירות כ -20 עד 25 זחלים טריים בקעו מצלחת אגר הענבים תחת מיקרוסקופ מנתח. ממלאים צלחת פטרי עם כשני מיליליטרים של PBS ולהטביע את קצה הכלי המכיל זחלים ב- PBS במשך שתי דקות.
לאחר שתי דקות, להטות את המנה בזווית כדי לאסוף את הנוזל בתחתית, ובאמצעות מברשת צבע קטנה, מברשת את הזחלים מתוך הנוזל בתחתית צלחת פטרי. לאסוף את כל הזחלים על מברשת הצבע ולשטוף את הזחלים לזמן קצר ב 70% אתנול לפני העברתם בחזרה לצלחת פטרי המכיל PBS. לרסס את אזור העבודה, כלי ניתוח, מלקחיים, ושתי מנות שעון זכוכית עם 70% אתנול ולתת להם להתייבש על הספסל.
הפוך את התרבות המשלימה של שניידר למדיום, או SSM, והנח אותו על קרח. פיפטה מיליליטר אחד של המדיום לתוך כל צלחת שעון זכוכית. בעזרת מיקרופיפט עם קצה סטרילי, העבירו את הזחלים הטריים שבקעו מצלחת ה-PBS ל-SSM בצלחת שעון הזכוכית הראשונה.
לנתח את המוח מתוך הזחלים להציב צלחת השעון זכוכית השנייה עם SSM באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח ולהתאים את ההגדלה לפי הצורך. השתמש מלקחיים אחד כדי לתפוס את ווים הפה, ועם השני, בעדינות לתפוס את הגוף באמצע הדרך למטה ולמשוך בכיוון ההפוך כדי לפצל את הזחל לשני חלקים. לאחר ניתוח של 15 עד 20 מוחות, הוסיפו מיליליטר אחד של SSM לבאר אחת של מגש תרבות סטרילי בן 24 בארות.
באמצעות מיקרופיפט וקצה סטרילי, העבירו את המוחות המנותחים הטריים ל- SSM, ולאחר מכן דגירה של המדיה עם המוח במשך 24 שעות ב 25 מעלות צלזיוס. פיפטה 10 מיקרוליטרים של מלאי 10 מילימולרי של 5-אתיניל-2'deoxyuridine, או EDU, עם 990 מיקרוליטרים של SSM לתוך צינור microcentrifuge סטרילי, לערבב, ולאחר מכן פיפטה מיליליטר אחד של EDU SSM לתוך באר אחת של מגש תרבית סטרילי 12-well. העבירו את המוחות באמצעות מיקרופיפט עם קצה סטרילי מהבאר המכילה את ה-SSM לבאר החדשה המכילה את תמיסת EDU SSM ודגרו במשך שעה אחת ב-25 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, העבירו את המוחות המסומנים ב-EDU לבאר אחרת באותו מגש תרבות המכיל מיליליטר אחד של קיבוע ואפשרו לתקן את המוח למשך 20 דקות. לאחר הקיבעון, העבירו במהירות את המוח לבארות זעירות של 72 בארות באמצעות מיקרופיפט. שטפו את המוח שלוש פעמים ב-10 מיקרוליטרים של PBT וחזרו על שלוש כביסות במשך 10 דקות כל אחד, מה שמבטיח שהמוחות תמיד מכוסים בנוזל מסוים.
פיפטה 10 מיקרוליטרים של תמיסת חסימה על המוח. מכסים את המגש וחותמים אותו עם רצועה של parafilm סביב הקצה. האיור מראה תאים נוירובלסטיים חיוביים וחיוביים ל-EDU בגודל גדול לאחר 24 שעות של פולחן ב-SSM עם אינסולין וכתמים.
לאחר 24 שעות במדיה המשלימה של שניידר ללא אינסולין, למוחות הפראיים של אורגון R שזה עתה בקעו לא היו תאים נוירובלסטיים חיוביים ל-EDU בגודל גדול וחיוביים ל-deadpan, מלבד תאי נוירובלסט בעלי ארבע פטריות-גוף ותא נוירובלסט אחד מהבטן. במהלך הדמיה קונפוקלית, כמה ההמיספרות במוח עם נזק, כמו חורים קטנים עד גדולים ברקמת המוח המוסברת, נצפו מדי פעם. כל מוח עם חורים לא שימש לניתוח.
לנתח רקמות בזהירות פיפטה בעדינות כדי למנוע כל נזק לרקמות. גם לנסות להיות סטרילי ככל האפשר ולא לזהם את התרבויות שלך. מכיוון שניתן לתמרן בקלות את מדיה התרבות על ידי הוספת גורמים שונים, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לטפל בהשערות עתידיות לגבי איתות חיצוני וכניסה ויציאה של רגיעה עצבית.
