פרוטוקול זה יכול לעזור לאנשים המעורבים בקהילת האבטיחים להעריך את הפתוגן fusarium wilt, וזה יעזור לקבוע את אוכלוסיות הפתוגנים הקיימים ולעזור לנהל אותו ביעילות. הקלדת מרוץ fusarium wilt היא מורכבת וגוזלת זמן רב להשלמה, וקיום שלוש אפשרויות בדיקה ביולוגית בנות קיימא של הקלדת מרוצים יאפשר למשתמשים לבחור בשיטה המתאימה ביותר לתנאי הניסוי שלהם. כל שלוש השיטות מסייעות למטפלים בתחום בריאות הצמח לאבחן את החומרה הפוטנציאלית של זיהומים בפוזריום נבול הקשורים לבידוד מסוים.
מידע זה מאפשר החלטות מושכלות ויעילות על ניהול מחלות משולבות. כדי להתחיל את ההכנה לשתילה, מלאו את התאים המתחילים 8x16 שטוחים עם מדיום שתילה תוך הקשה למטה כדי לדחוס את הקרקע. לאחר מכן, זרעו זרעים כאשר הפסגה שלהם מצביעה כלפי מעלה לעומק השווה לאורכם.
לאחר שהזרעים נזרעים, מכסים את המדיום המכיל את הזרעים הקבורים באדמת פולר לעומק של 0.3175 עד 0.635 ס"מ, ואז מערפלים את השטוחים כדי להרטיב את המדיום מבלי ליצור מים עומדים או איגומים. לאחר מכן, שמרו על בינוני לח על ידי ערפול במשך 20 שניות כל 180 דקות במשך חמישה ימים עד לנביטת הזרעים. לאחר הנביטה, השקו את השטוחים פעם ביום.
חמישה ימים לאחר השתילה, מניחים דיסקי נייר חודרים בקוטר של 1 עד 1.25 ס"מ המכילים את הפיוזריום אוקסיספורום המועדף לבודד על מדיום מיץ V8 מזוקק אחד ו-1/4 אגר דקסטרוז תפוחי אדמה חזקים, או צלחת מדיה QPDA, כדי לאחסן אותם באינקובטור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס במשך שמונה ימים. ביום השמיני, העבירו את לוחות ה-V8 וה-QPDA לארון בטיחות ביולוגית לפני שאתם מפרקים את הקונידיה על ידי גירוד מפזר תאים סטרילי על פני המשטח הבינוני ואגדו את תרחיף הקונידיה הנוזלי לצינור תרבית סטרילי של 50 מיליליטר. לאחר מכן, לכמת את ספירת הנבגים ולהכין את תמיסת האינוקולום הסופית על ידי העברת הנפח המחושב של כמיליון נבגים לצינור התרבית הסטרילית הטרייה והבאת הנפח הכולל ל -30 מיליליטר עם מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה.
כדי להתכונן לחיסון, הניחו משטחי קלקר 6x12 תאים שחוטאו בעבר עם 10% אקונומיקה ושטופים היטב כדי לקבל את הצמחים המחוסנים. מספר שעות לפני החיסון, השקו ביסודיות את הצמחים. שעתיים לאחר ההשקיה, מוציאים את הצמחים משטוחי הקלקר של התאים 8x16 ושוטפים את שורשיהם.
לאחר מכן, אחסנו באופן זמני את הצמחים השטופים במיכלים נקיים עם מי ברז עד לשימוש, תוך שמירה על הפרדה בין המינים זה מזה. מאוחר יותר, מפרידים את הצמחים לקבוצות של שישה פרטים ושומרים על קבוצות השתילים עטופות במגבות נייר רטובות על מגש מעבדה. מניחים 25 עד 30 סנטימטרים מעוקבים של אדמה בתחתית כל תא של מגש הקלקר 6x12 ומשתמשים בבקבוק שפריץ כדי להרטיב את האדמה עד שהיא לחה בעליל.
החל מהשליטה הבריאה, הכניסו קבוצה של ששת השתילים הלא פגומים של אותו זן לתוך צינורות 50 מיליליטר המכילים את האינוקולום. כדי לחסן, מערבולת את הצינורות של צמחים עם שורשים שקועים במשך 30 שניות. לאחר מכן, מניחים צמח יחיד לכל תא במישורי הקלקר 6x12 עם הצמחים של אותו זן בעמודה אחת של המגש.
מכסים את הצמחים במדיום שתילה ומגדירים בעדינות. השתמשו במזרק כדי להרטיב את הצמח עם 20 מיליליטר מים תוך הימנעות מהתזה. לאחר שכל הצמחים נשתלו מחדש, הניחו את הצמחים למשך הלילה בסביבה חשוכה סגורה עם טמפרטורה ממוצעת של 27 מעלות צלזיוס.
כדי לשריץ את הגרעינים, הכינו אינוקולום על ידי בידוד וגידול של זן fusarium oxysporum niveum על צלחת של QPDA עד כדי כך שצמיחתו מכסה מחצית מהצלחת. הכינו את הגרעינים על ידי הוספת מי ברז סטריליים לבקבוקי הזכוכית של ליטר אחד Erlenmeyer המכילים 200 גרם של גרעינים כדי לכסות לחלוטין את הגרגרים עד חמישה סנטימטרים לפחות. לאחר השריית הגרעינים בצלוחיות בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, מנקזים את המים מהבקבוקון ומחברים את פתח הבקבוקון בחתיכת גליל כותנה עטופה בבד גבינה לפני שהם מכסים את הפתח בעטיפת רדיד אלומיניום.
עיקרו את הצלוחיות באוטוקלב במחזור הכבידה למשך שעה אחת עם זמן ייבוש של חמש דקות, ואז אפשרו לצלוחיות להתקרר לטמפרטורת החדר. מעבירים את הגרגרים לשקית גידול פטריות עם פילטר. מוציאים את האוויר מהשקית ואז מקפלים את עודפי הפלסטיק סביבו.
מניחים את השקית בפח פלסטיק הסמוך לאוטוקלאב ומכסים את הפח בעטיפת רדיד אלומיניום, ואז משתמשים שוב באופן אוטומטי באותן הגדרות כמו קודם. לאחר האוטוקלבינג, אפשרו לפטריה לדגור על הגרעינים בשקית במשך שלושה שבועות. השתמש בנשא פקק סטרילי בגודל מספר ארבע כדי לחתוך דיסקיות אגר בקוטר של שישה מילימטרים מאזור הצמיחה הפעילה על לוחית התרבית.
פתחו את השקית כדי להניח חמישה דיסקי אגר בטכניקה סטרילית קפדנית. השתמשו בצילינדר סטרילי של 50 מיליליטר מדורג כדי למדוד ולהוסיף 35 מיליליטר של מי ברז סטריליים לשקית. ממלאים סיר פלסטיק בתערובת עציצים ואז מוסיפים את הכמות הנמדדת של תערובת העציצים לשקית ניילון גדולה המכילה 14 גרגרים של גרעינים שורצי עצים.
צרו כרית אוויר בשקית ואטמו אותה סגורה לפני ערבוב הגרעינים והאדמה על ידי היפוך השקית מספר פעמים. לאחר שתסיימו, מלאו סיר מעוקר על פני השטח בתערובת האדמה השורצת. חזרו על התהליך עבור כל זן אבטיח שנותר בסך הכל בסך הכל ארבעה סירים מלאים של אדמה שורצת אדמה לכל מבודד שנבדק.
לאחר מכן, זרעו שישה זרעי אבטיח בסיר כשקצהו העליון של הזרע פונה כלפי מעלה. באמצעות בקבוק ריסוס, הרטיבו את 0.3 עד 0.6 הסנטימטרים העליונים של האדמה במים ולאחר מכן הניחו צלחת פלסטיק שקופה מתחת לכל סיר ומעליו. מלאו 48 מכניסות תאים בחול מפוסטר באדים, כבול, ורמיקוליט ביחס 4:1:1 והקש על התוספות כדי לדחוס את הקרקע.
לאחר מכן, מניחים את התוספות במגשי פלסטיק וזורעים את הזרעים כפי שהוסבר קודם לכן. שבעה ימים לפני השתילה, חחסנו חמש צלחות QPDA עם נייר מסתנן כדי לאחסן אותן באזור דגירה במשך שמונה ימים במחזור חשוך של 14 שעות ל-10 שעות. ביום השביעי, העבירו שני תקעי אגר של סנטימטר רבוע אחד לכל בקבוקון ארלנמאייר בגודל 250 מיליליטר המכיל 100 מיליליטר של דקסטרוז תפוחי אדמה והניחו את צלוחיות ארלנמאייר על שייקר על ספסל.
ביום החיסון, לקצור את הנבגים על ידי סינון האינוקולום דרך ארבע שכבות של בד גבינה סטרילי כדי לקבוע את הריכוז המיקרו-קונידיאלי של הבקבוקון. 14 יום לאחר הזריעה, מעבירים את תאי ההחדרה עם השתילים למגש הרשת, ואז מניחים את מגש הרשת עם השתילים לתוך גיגית פלסטיק המכילה את שבעת הליטרים של מתלי האינוקולום. לאחר 15 דקות של שמירה על האינוקולום ללא הפרעה, מעבירים את תאי התאים המכילים את השתילים המחוסנים למגשים נטולי חורים ומניחים את המגשים נטולי החורים על ספסל החממה, ולאחר מכן השקיה לפי הצורך.
שמרו על התאורה ותנאי הסביבה כפי שתוארו קודם לכן לצורך בדיקת הביו-אסטיקה של טבילת השורש. בהתאם לשיטה שבה נעשה שימוש, התחל את הדירוג על ידי התבוננות וחישוב שכיחות המוות של נבול וצמחים וקח תמונות דיגיטליות כדי לתעד את התקדמות המחלה. בשיטת טבילת המגש המתוקנת, זני היהלום השחור ואפור צ'רלסטון שנדבקו בבידוד גזע-2 הראו תסמינים חמורים ומתו.
לעומת זאת, זן Citrullus amarus PI הראה התנגדות. בשיטת טבילת השורשים, השתילים שנדבקו בבידוד גזע-0 שרדו ברובם, בעוד שכמעט כל השתילים שנדבקו בבידוד גזע-3 מתו. בשיטת הגרעינים שורצי הגלעין, זני שוגר בייבי וצ'רלסטון גריי שגדלו באדמה שורצת גזע 2 החלו לנבול ולמות, בעוד שצמחי Citrullus amarus PI עדיין נראים בריאים.
זכרו לזרוע ולתחזק את הצמחים כראוי, לבדוק את הפתוגן לבודד את הכדאיות, להבין את הטכניקות הייחודיות של כל שיטת חיסון, ולהיות עקביים בעת הערכת תסמיני המחלה. בעזרת התוצאות של שיטות אלה, חוקרים יכולים לחקור את הדטרמיננטות הגנטיות הבסיסיות השולטות בביטוי השונות הדיפרנציאלית בין המבודדים באמצעות ריצוף וניתוח גנומי השוואתי. באמצעות שיטות אלה, חוקרים הצליחו להעריך את השכיחות של פנוטיפים שונים של אלימות על פני מקומות שונים ולהשוות את הפנוטיפים האלה עם אלמנטים גנטיים נצפים.
