פרוטוקול זה מספק גישה חדשה לסיווג מצב הפעלת תאי גזע עצביים עם קבוצה של יתרונות טכניים. באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים להשיג ניתוח רזולוציה של תא בודד ללא תוויות של תאים חיים של מצב הפעלת תאי גזע עצביים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לשפוך אור על מנגנונים המווסתים נוירוגנזה של מבוגרים.
אוטופלואורסצנטיות היא הרבה יותר עמומה ממה שחוקרים רבים רגילים לעבוד איתה. היה בטוח בשימוש בכוחות לייזר גבוהים יותר כדי לאסוף את הנתונים שלך. מי שידגים את ההליך יהיה כריס מורו, סטודנט לשעבר לתואר שני מהמעבדה שלי.
התחל על ידי הגדרת המיקרוסקופ קונפוקלי עבור הדמיה autofluorescence. לחץ על לייזר 405 והקלד בחלון הפליטה תחת תפריט לייזר 405. המשך ללחוץ על TD כדי לאסוף תמונת אור משודרת ולהגדיר את ערך HV כדי להמחיש את הדגימה.
התאם את עוצמת הלייזר ל- 3.5% והגדר את הרווח ל- 75. הגדר את גודל התצוגה לשניים. עבור פרמטרי הסריקה הקונפוקלית, הגדר את מיקום הפיקסלים ל- 0.5 ואת הרזולוציה ל- 2048 על ידי 2048 פיקסלים.
באמצעות עדשה אובייקטיבית 60X שמן טבילה תחת שדה בהיר, להביא את התאים לתוך מיקוד. לחץ על יציאת עיניים כדי לעבור למצב סריקה קונפוקלית. ודא שנתיב האור מכוון לכיוון ראש הסריקה וודא שאף קוביית מסנן אינה חוסמת את נתיב האור.
לחץ על סריקה, ולאחר מכן התמקד בתמונה ולחץ על לכידה כדי לקבל תמונות של אוטופלואורסצנטיות בתאי גזע עצביים שקטים ובתאי גזע עצביים פעילים. הקפד לאסוף תמונות מישוריות בודדות עם הציטופלסמה של התאים ממוקדת לקבלת חתך מייצג של כל תא. התחל הדמיה עם עוצמת לייזר נמוכה והגדל בהדרגה את ההספק עד שניתן יהיה לזהות את האות האוטופלואורסצנטי מבלי לגרום לרוויה.
נתח תאי גזע עצביים שקטים ותאי גזע עצביים פעילים עם ציטומטר זרימה באמצעות פייה של 130 מיקרומטר. החל תנאים אופטיים בהתאם ליכולות המכשיר וזהה ניקוב אוטופלואורסצנטי. אסוף לפחות 10, 000 qNSCs singlet ו- aNSCs בקובץ נתונים.
השתמש בנתונים אלה כדי לתכנן שערים לאיסוף אוכלוסייה מועשרת של qNSCs או aNSCs. לאחר מכן מיין את תאי הסינגלט לבארות מצופות למינין אש"ף מלאות בתווך aNSC. לאחר FACS, לאפשר לתאי גזע עצביים לדגור במשך שלוש שעות.
כדי לתקן את התאים, להוסיף 4% paraformaldehyde, להבטיח שזה מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של הצלחת לדגור. לאחר 15 דקות, חדרו לתאים עם 0.25% טריטון ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לטפל בתאים בתמיסת צביעת EdU בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
לאחר מכן, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם PBS. התחילו בשימוש באוקולרים כדי לאתר שדה ראייה מתאים והתאימו את נתיב האור לדגימה במיקרוסקופ כדי לאפשר הדמיה בחושך עם המולטיפוטון. הגדר לאוסף תמונות הערוץ הראשון.
נווט אל כרטיסיית צריכת החשמל והתאם את הרווח ב- PMT ל- 800. לחץ על הכרטיסייה לייזר 2P ובחר 750 ננומטר עבור אורך גל הלייזר וודא שנעשה שימוש בקוביית המסנן הנכונה. כדי לאסוף את תמונת הערוץ הראשון, לחץ על הכרטיסייה Power Gain והגדר את Pockels ל- 30.
לאחר מכן המשך למקטע הסריקה במסך ולחץ על סריקה חיה כדי להפעיל את מצב התצוגה המקדימה. להגדיל בהדרגה את Pockels כדי להשיג שדה ראייה מתאים בעוצמת לייזר נמוכה. לאחר זיהוי שדה ראייה מתאים, כוונן את עוצמת הלייזר ל- 3.6 מילי וואט.
לאחר מכן המשך לקטע הסריקה ולחץ על סריקה יחידה כדי לצלם תמונה של ערוץ אחד במשך 60 שניות. כדי לאסוף תמונת ערוץ שתיים, לחץ על הכרטיסייה לייזר 2P ובחר 890 ננומטר עבור הלייזר. החלף את קוביית המסנן בקוביית הפליטה של ערוץ שתיים.
הפעל את מצב התצוגה המקדימה. הגדל את Pockels עד מד החשמל מראה כשבעה מילי וואט ואת ספירת CFD הם בין 10, 000 ו 100, 000. לחץ על סריקה אחת וצלם תמונת ערוץ שתיים במשך 60 שניות.
נעשה שימוש בהדמיה אוטופלואורסצנטית קונפוקלית כדי להבדיל בין תאי גזע עצביים שקטים לבין תאי גזע עצביים פעילים. נמצא כי qNSCs מציגים מספר גבוה יותר של PAF מאשר aNSCs, מה שמדגים את השימוש באוטופלואורסנציה כסמן לזיהוי מצב התא. באמצעות FACS, מצבי תאי NSC הועשרו על בסיס אוטופלואורסצנטיות.
תאים שמוינו משער האוטופלואורסנציה הגבוה הראו קצב התפשטות נמוך יותר בהשוואה למדגם המעורב, בעוד שתאים משער האוטופלואורסנציה הנמוך היו מתרבים יותר, מה שאישר את העשרת מצבי ההפעלה של NSC. יתר על כן, FLIM שימש כדי להעריך את האוטופלואורסצנטיות של NSC ולהבחין במצב ההפעלה של NSCs. יש לציין כי qNSCs הראו אורך חיים ממוצע גבוה יותר של פלואורסצנטיות בערוץ הראשון, אך שיעור נמוך יותר של רכיב הפלואורסצנטיות אלפא אחד בהשוואה ל- aNSCs.
מודל רגרסיה לוגיסטית המשלב נתונים משני הערוצים הניב יכולת חיזוי כמעט מושלמת עבור מצבי הפעלת NSC כפי שצוין על ידי עקומה אופיינית של מפעיל מקלט המדגישה את הפוטנציאל של FLIM בסיווג מצבי NSC. בעקבות הליך זה, זה יהיה טוב לאמת את התוצאות באמצעות גישות אחרות כדי למדוד את מצב ההפעלה של תאי גזע עצביים.
