מיצוי מולקולות גליקוגן בכבד לקביעת מבנה הגליקוגן

פרוטוקול זה מאפשר מיצוי של מולקולות הגליקוגן בכבד באופן המשמר את המבנה שלהן ומגביל את כמות חלקיקי הגליקוגן הקטנים שאבדו. עם מחקרים קודמים שהראו כי סוכרת משנה את מבנה הגליקוגן, שיטה זו יכולה לספק בחקר סוכרת ומחלות אחסון הגליקוגן השונות. כדי לחלץ גליקוגן מהכבד, התחילו בהעברת גרם אחד של רקמת כבד קפואה לצינור של 15 מיליליטר המכיל שישה מיליליטר של מאגר בידוד גליקוגן.

תוך שמירה על קרח, הומוגניזציה של רקמת הכבד באמצעות הומוגנייזר רקמות. כאשר נעשה, להעביר חצי או שלושה מיליליטר של השעיית התא צינור חדש, ואחריו רותחים במשך 10 דקות. שמור את החצי השני של התרחיף על קרח כדי לחלץ חלבונים הקשורים המכילים גליקוגן שאינם מפורק .

לקביעת תכולת הגליקוגן, הסר אליציטוט של שמונה מיקרוליטר מכל צינור ושמור את הצינור על קרח. לאחר סיבוב המתלה הנותר ב 6, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להעביר את supernatant צינורות אולטרה צנטריפוגות לצנטריפוגה אותם ב 3.6 פעמים 10 ל G החמישי וארבע מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. לאחר השלכת הסופרנאטים הנותרים, יש להשהות מחדש את הכדוריות ב-1.5 מיליליטר של מאגר בידוד הגליקוגן.

לאחר מכן, שכבו את הדגימות מעל 1.5 מיליליטר של תמיסת 30% סוכרוז בארבע צינורות אולטרה-צנטריפוגות מיליליטר, ולאחר מכן צנטריפוגות כפי שתואר קודם במשך שעתיים. לאחר השלכת supernatants, resuspend את הכדורים ב 200 מיקרוליטר של מים deionized. כדי לזרז גליקוגן מתרחיף התא, להוסיף 800 מיקרוליטר של אתנול מוחלט לתרחיפים התא ולערבב היטב.

לאחר מכן, אחסנו את התערובות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות כדי לאפשר משקעים. לאחר התרחשות משקעים, צנטריפוגות את הדגימות ב 6, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשעות מחדש את גלולת הגליקוגן ב 200 מיקרוליטר של מים deionized לחזור על תהליך משקעים אתנול שלוש פעמים. מתרחיף התא הסופי, הסר אליציטוט של שמונה מיקרוליטר מכל צינור לקביעת תכולת הגליקוגן.

לאחר מכן, הקפיאו את הסופרנאטנטים הנותרים בחנקן נוזלי והקפיאו לייבוש למשך הלילה. למחרת, אחסנו את דגימות הגליקוגן המיובשות במקפיא בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. המחקר ניתח את הטוהר, התפוקה הגולמית ותפוקת הגליקוגן של דגימת הגליקוגן המיובשת שהופקה בתנאים שונים.

לא נמצאו הבדלים משמעותיים בתפוקת הנפט הגולמי ובתפוקת הגליקוגן בין הקבוצות שהופקו בתנאים השונים. לעומת זאת, טוהר הגליקוגן הושפע משמעותית מריכוזי הסוכרוז ומתוספת של מדרגת רתיחה. גליקוגן בעל הטוהר הגבוה ביותר הופק באמצעות ריכוז של 30% סוכרוז ושלב רתיחה של 10 דקות.

גליקוגן הופק מהכבד הומוגנט על ידי 30%50% או 72.5% סוכרוז, מבושל או לא מבושל, כדי להעריך את ההשפעות של התנאים השונים על גודל המולקולות בתמצית הסופית. ניתוח אורך שרשרת בוצע על שישה כבדים הן מבושלים והן לא מבושלים, תוך שימוש בריכוזי סוכרוז של 30%50% ו-72.5%. חושב התוכן של מולקולות הגליקוגן או חלקיקי בטא עם רדיוס הידרודינמי, RH, נמוך מ -30 ננומטר.

הדגימות המבושלות היו בעלות ערכי RH ממוצעים נמוכים יותר ותכולת חלקיקים גבוהה יותר מאשר הדגימות הלא מבושלות. כמו כן, ריכוזי סוכרוז נמוכים יותר גרמו לערכי לחות יחסית נמוכים יותר ותכולת חלקיקי בטא גבוהה יותר. הכנסת שלב הרתיחה הובילה גם לערכי RH מקסימליים נמוכים יותר או לערכי המקסימום, בעוד שלריכוז הסוכרוז לא הייתה השפעה משמעותית.

יש לוודא שהרקמה הומוגנית לחלוטין ולא נותרו גושים מהרקמה. לכן, טכניקה זו סוללת לנו את הדרך לחקור אילו נתיבים מקשרים את חלקיקי הבטא הקטנים יחד ליצירת חלקיקי אלפא גדולים יותר.