שתי טכניקות הפילינג שהוכחו כאן מבודדות תאים תת-תאיים בודדים של מוטות, ויכולות לעזור לחשוף את התהליכים הפיזיולוגיים החשובים המתרחשים בכל תא מיוחד במוטות בריאים וחולים. בידוד תאי מוט שונים מרשתית העכבר יכול להיות מאתגר. טכניקות פשוטות אלה משתמשות בחומרי מעבדה זולים ונפוצים כדי לבודד באופן אמין תאים תת-תאיים של מוטות לניתוח חלבונים.
כדי להתחיל, למקם חתיכת נייר מסנן לתוך צלחת פטרי מלא איימס HEPES חוצץ בועות עם 100% חמצן. לאחר מכן, באמצעות פיפטת העברה רחבת-שעמום, העבר מלבן רשתית אחד המנותח מעכבר C57 Black 6J בן חודשיים עד שלושה חודשים. כוונו את הרשתית המחוצצת כלפי מעלה וודאו שצלבי האור פונים כלפי מטה לכיוון תחתית המנה.
לאחר מכן, באמצעות פינצטה, לתפוס קלות את הצדדים של הרשתית חצויה ולהזיז אותו על גבי נייר הסינון. לאחר שהרשתית ממורכזת, הזיזו את נייר הסינון כלפי מעלה כך שהרשתית החצויה תיגע בנייר הסינון כדי ליצור מקטע חיצוני מוט, או ROS לסינון הידבקות בנייר. הרם בזהירות את נייר הסינון עם הרשתית המצורפת מתוך מאגר HEPES של איימס.
מניחים את הצד התחתון של נייר הסינון על מגבת נייר ומטפטפים פעמיים עד שלוש פעמים לייבוש. מוסיפים טיפה של איימס HEPES על הצד של נייר המסנן עם הרשתית ומניחים את נייר המסנן על מגבת הנייר שוב לייבוש. לאחר מכן, מניחים את נייר הסינון עם הרשתית בחזרה לתוך צלחת פטרי, ובאמצעות פינצטה, בעדינות לדחוף את כל הקצוות של הרשתית חצויה למעלה והרחק מנייר המסנן מכל הצדדים.
מקלפים בעדינות את הרשתית מנייר הסינון, נוגעים רק בהיקף הקיצוני של הרשתית כדי לשמור על שלמותה המבנית. לאחר מכן, הרם את נייר הסינון מצלחת פטרי והסר נוזל עודף על מגבת נייר, ומבטיח כי הצד במגע עם הרשתית אינו יוצר קשר עם מגבת הנייר. מניחים את נייר הסינון עם שכבת ROS החלקית לתוך צינור מסומן על קרח, ולשמור את הרשתית הקלופה שקועה במאגר HEPES איימס.
חזור על תהליך הפילינג עבור רשתית חצויה זו כשבע עד שמונה פעמים כדי להסיר את שכבת ROS כולה. לאחר כל קליפה, מניחים את נייר הסינון באותו צינור כדי לשלב את כל ROS מבודד מרשתית חצויה אחת. שמור את הצינור המכיל את כל קליפות נייר הסינון של ROS מבודד על קרח לשימוש מיידי.
באמצעות פינצטה, להעביר את הרשתית הקלופה הנותרת לתוך צינור מסומן כראוי ולשמור את הצינור על קרח לשימוש מיידי. כדי להכין את דגימת הרשתית לליופיליזציה, מניחים פיסת נייר סינון ומעבירים רשתית חצויה לצלחת פטרי מלאה במאגר של רינגר קר. לאחר מכן, באמצעות פינצטה, בזהירות להפוך את הרשתית כך שהוא מכוון קעור למעלה ולהזיז אותו לנוח על גבי נייר הסינון.
הרם את נייר הסינון בקצוות כלפי מעלה כדי שחתיכת הרשתית החצויה תיגע בנייר הסינון. המשך להרים את נייר הסינון מהפתרון של רינגר. לאחר מכן, מניחים את הצד התחתון של נייר הסינון על מגבת נייר ומטפטפים בזהירות פעמיים עד שלוש פעמים כדי להסיר נוזל עודף.
לאחר מכן, הרימו את נייר הסינון עם פינצטה והוסיפו טיפה של צלצולים קרים לצד נייר הסינון עם הרשתית. שוב, מניחים את נייר הסינון על מגבת הנייר כדי להסיר נוזל עודף. אחסנו כל רשתית דבוקה ודגימת נייר סינון בצלחת פטרי מלאה בצלצול קר עד שתהיה מוכנה להקפיא את כל הדגימות.
לאחר מכן, באמצעות פינצטה, הרימו כל דגימה מהחוצץ של הצלצול הקר, והבטיחו כי הפינצטה תיצור קשר רק עם קצוות נייר הסינון, תוך הימנעות מהרשתית החצויה. מניחים את הצד התחתון של כל נייר סינון על מגבת נייר כדי להסיר נוזל עודף. לאחר מכן, מוסיפים טיפה של PBS קר על הצד של נייר המסנן שבו הרשתית דבוקה וטפטוף שוב את נייר הסינון על מגבת הנייר.
מניחים את כל חתיכות נייר הסינון לתוך צלחת פטרי, ובאמצעות נייר טישו ללא מוך, לנדף את כל נוזל עודף המקיף את נייר הסינון. לאחר מכן, לעטוף בחוזקה את המנה כולה עם רדיד אלומיניום ולוודא כי הקצוות של רדיד האלומיניום מאובטחים ולחץ בצורה חלקה לתוך החלק התחתון של צלחת פטרי. לנקב קומץ של 0.1 עד 0.2 מילימטר חורים לתוך מכסה רדיד אלומיניום.
לאחר מכן, באמצעות מלקחיים מתכת, בהדרגה להוריד את צלחת פטרי מכוסה רדיד אלומיניום לתוך חנקן נוזלי. שמור את הדגימות בחנקן נוזלי עד מוכן ליופיליזציה. עבור lyophilization, למקם את צלחת פטרי מכוסה רדיד אלומיניום לתוך בקבוק ייבוש בהקפאה ולחבר אותו למכונת lyophilizer בעקבות הפרוטוקול של היצרן.
ליופיל את הרשתית במשך 30 דקות. לאחר lyophilization, לאסוף את המוט החיצוני ואת הקטע הפנימי על ידי הנחת בזהירות חתיכה קטנה של קלטת על גבי הרשתית lyophilized והחלת לחץ קל עם פינצטה כדי להבטיח שהוא נקשר עם שכבת photoreceptor. לקלף לאט את הקלטת משם ולוודא כי הן ROS ו RIS דבקו בקלטת.
סרט לבן דק יהיה נוכח על פני השטח השבורים. זה RIS. כדי להפריד RIS זה, למקם חתיכה אחרת של קלטת ולדחוף את הסרט למטה על פני השטח השבורים.
לאחר מכן, מניחים את פיסת הסרט רק עם השכבה הכתומה-ורודה לתוך צינור microcentrifuge המסומן כ- ROS, ופיסות נייר דבק עם השכבה הלבנה הדקה לתוך צינור אחר שכותרתו RIS. לאחר מכן, באמצעות קלטת, לאסוף את רקמת הרשתית הנותרת הממוקמת על נייר המסנן על ידי קילוף את השכבה העבה, לבן. לאחר מכן, מקם את הבידוד הזה לתוך צינור שכותרתו OIS.
אם אתם משתמשים באותו יום, יש לאחסן את השכבות המבודדות מהרשתית הליופילית בטמפרטורת החדר. בבעלי חיים שהותאמו בחושך, ההתפלגות של GNAT1 ו- ARR1 התאימה באופן הדוק להפצות המצב האפל הידועות שלהם, שם אות GNAT1 היה החזק ביותר באופן ניכר בבידוד ROS, ואות ARR1 היה חזק יותר בבידוד ROS. כימות האותות GNAT1 ו- ARR1 הראה הבדלים משמעותיים בין תנאי אור כהה עבור GNAT1 ו- ARR1 בדגימות ROS ו- ROS.
הן בדגימות כהות והן בדגימות המותאמות לאור, G פעימה 5S, ציטוכרום C, ואקטין אותות אינם נכללים בדגימות ROS, מדגימים היעדר זיהום משכבות תאיות אחרות. בנוסף, אות G beta 5L היה גלוי בבירור בדגימות ROS. סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים של המשטחים של רשתית ליופילית שלמה ומקולפת הראתה כי, לפני קילוף עם סרט דבק, פני השטח של רשתית ליופילית שלמה תאמו באופן הדוק את ROS גלילי אופייני.
לאחר קליפת הסרט הראשונית, ROS ו RIS נראה הוסר לחלוטין, כפי שמעיד על ידי שכבה גרעינית אחידה נוכח על פני השטח של שאריות, קלוף, רשתית lyophilized. קליפות סרט לאחר מכן הסירו את RIS מהמשטח החופשי של השכבה הקלופה. טכניקה זו גם הוכיחה כי GRK1 חיסוניות היה אינטנסיבי ביותר בדגימות ROS ברשתית חשופה לאור, ונעדר בדגימות OIS.
לעומת זאת, דגימות ROS ו- RIS הציגו אות קלוש עבור אלפא PKC, אשר בדרך כלל לא מזוהה ב- ROS או RIS על ידי כתמים immunofluorescence. לבסוף, קילוף סרט תת-אופטימלי יכול להניב דגימות מזוהמות מעט. מדגם RIS זוהם עם כמה מדגם OIS, לייצר הן G בטא 5L ו G בטא 5S רצועות, ואות אלפא PKC גבוה יותר.
יש להקפיד בעת lyophilizing הרשתית. אם נעשה שימוש בטכניקת ליופיליזציה לא נכונה, הרשתית עלולה להינמס, מה שהופך את בידוד שכבות תת-תאיות מוטות שונות על ידי סרט דבק לבלתי אפשרי. שימוש בשיטת פילינג קלטת זו בשילוב עם qRT-PCR אפשר הפרדה של תמלילי קולטן פוטורצפטור משאר הרשתית.
